Desarrollo y reproducción de Drosophila

<em>Drosophila</em> Development and Reproduction

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila Development and Reproduction

3.6: C. elegans Maintenance

3.13: Yeast Transformation and Cloning

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12:51 min

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April 30, 2023

Overview

Una de las muchas razones que hacen de Drosophila un organismo sumamente valioso es que las bases moleculares, celulares y genéticas de desarrollo están muy conservadas entre moscas y eucariotas superiores como seres humanos. Progreso de Drosophila a través de varias etapas de desarrollo en un proceso conocido como el ciclo de vida y cada etapa proporciona una plataforma única para la investigación del desarrollo. Este video presenta cada etapa del ciclo de vida de Drosophila y detalles de las características físicas y principales eventos del desarrollo que ocurren durante cada etapa. A continuación, el video trata sobre la regulación genética de la formación de patrones, que es importante para establecer el plan del cuerpo del organismo y la especificación de órganos y tejidos individuales. Además, este video da una descripción de la reproducción de Drosophila y cómo utilizar las características reproductivas de Drosophila para establecer un cruce genético. Finalmente, se discuten ejemplos de cómo pueden aplicarse los principios de la reproducción y el desarrollo de Drosophila a la investigación. Estas aplicaciones incluyen RNA de interferencia, ensayos conductuales de las conductas de apareamiento y las técnicas de imagen que permiten visualizar el desarrollo como un proceso dinámico en vivo. En general, este video resalta la importancia del desarrollo de la comprensión y reproducción de Drosophila, y cómo este conocimiento puede utilizarse para comprender el desarrollo de otros organismos.

Procedure

Drosophila melanogaster, son ampliamente utilizados como un organismo modelo en el estudio desarrollo y reproducción. Progreso de Drosophila a través de varias etapas de desarrollo en un proceso conocido como el ciclo de vida y cada etapa proporciona una plataforma única para la investigación del desarrollo. En este video, presentamos los conceptos básicos de reproducción, incluyendo cómo configurar una cruz genética y discutir cómo se puede aplicar esta investigación para comprender procesos que van desde la cicatrización de heridas al comportamiento y desarrollo de Drosophila .

En primer lugar, vamos a discutir el ciclo de vida de Drosophila . Progreso de Drosophila a través de 4 etapas principales de desarrollo: embrión, larva, pupa y adulto.

El embrión es un óvulo fecundado que es aproximadamente de 0,5 mm de largo y forma ovalada. Inmediatamente después de la fertilización, el embrión sufre división mitótica rápida sin crecimiento. El núcleo cigóticos sufre nueve rondas de división nuclear, pero no experimentan citocinesis, formando una célula nuclea múltiples llamada un blastoderm sincitial. Ya que todos los núcleos de la parte del blastoderm sincitial un citoplasma común, las proteínas pueden difundir libremente, formando gradientes de morfógeno, que son importantes para establecer el plan del cuerpo y patrones de los órganos y tejidos en la mosca. Después de la 10ª División nuclear, los núcleos migran a la periferia del blastoderm sincitial. Después de la 13 ronda de división nuclear, que ocurre aproximadamente 3 horas después de la fecundación, los 6000 núcleos en el blastoderm sincitial convertido en individualizado forman blastoderm celular. El blastoderm celular contiene una monocapa de células y se transforma en una estructura compleja de varias capas, en un proceso conocido como gastrulación. Durante gastrulation, cambios en la forma de la célula unidad invaginations de la monocapa, creando en última instancia las capas germinales ectodermo, endodermo y mesodermo. El endodermo da lugar a la tripa, el mesodermo da origen a los músculos y el corazón, y el ectodermo da lugar a la epidermis y el sistema nervioso central. Después de 24 horas, los embriones eclosionan como larvas.

Las larvas son de color blancas con gusano-como organismos segmentados. Arrastrarse alrededor en comida húmeda comiendo constantemente, llevando a un rápido crecimiento. Las larvas progresan a través de tres etapas: el primer instar durante 24 horas, segundo instar durante 24 horas y tercer instar durante 48 horas. La muda se produce entre cada etapa. Cuando esté listo para pupas, larvas de tercer estadio dejan su fuente de alimento y coloque en una superficie firme, como el lado de un frasco.

Pupa están inmóvil y son inicialmente suaves y blancos pero eventualmente endurecer y dar vuelta a marrón. Durante un período de cuatro días, forma de los tejidos degenerados y adultos de los tejidos larvales. Eclosión marca el final de la etapa pupal y las moscas emergen como adultos.

8 horas después de la eclosión, los adultos se convierten en sexualmente receptivos y comienzan a aparearse, volver a empezar el ciclo de vida de.

El ciclo de vida toma cerca de 10 días a 25 ° C, pero puede verse afectada por la temperatura. Por ejemplo, a 18 ° C el ciclo de vida es de unos 19 días y a 29 ° C, el ciclo de vida es de sólo 7 días.

En todo el desarrollo, cuidado regulación genética de la formación establece el plan corporal y especifica los órganos y tejidos individuales. Lo importante, el establecimiento del eje antero-posterior define la cabeza a la cola de orientación del organismo y está regulado por varios grupos de genes.

Genes de efecto materno, primero se suministran en el ovocito y heredados de la mujer. Son importantes en el blastoderm sincitial para establecer inicialmente el anterior y posterior del embrión. En particular, el gen bicoid define la parte anterior del embrión incluyendo la cabeza y el tórax, mientras que el gen nanos define la parte posterior, incluyendo el abdomen.

En segundo lugar, los genes de segmentación, que son regulados por genes de efecto materno, incluyen los genes gap y par los genes de la regla. Los genes Gap establecen un plan de cuerpo segmentado a lo largo del eje antero-posterior por ampliamente dividir el embrión. Genes de regla par se expresan en un patrón rayado perpendicular al eje antero-posterior, más dividir el embrión en segmentos más pequeños. Entonces los genes de polaridad de segmento, tales como angrelado comienzan a establecer sinos de la célula dentro de cada segmento.

Por último, genes homeóticos son responsables de definir las estructuras anatómicas particulares, tales como alas y patas. Curiosamente, el orden de los genes en el cromosoma de reflejar cómo se expresan a lo largo del eje antero-posterior.

Drosophila son organismos extremadamente fértiles que pueden producir miles de descendientes en la vida. Las hembras ponen cientos de huevos al día y continuar fertilizar huevos bien después de apareamiento.

Drosophila son también organismos dimorfismo sexual lo que significa que las hembras son fenotípicamente distintas de los hombres. En particular, los machos son más pequeños que las hembras y han de color oscuro los órganos genitales externos, así como más pigmento negro en su abdomen inferior. Los machos también tienen un parche de cerdas en sus patas delanteras llamados peines sexuales utilizados para enganchar a la hembra durante la cópula. Estas diferencias fenotípicas distintas hacen muy fácil de distinguir machos de hembras, que es particularmente útil cuando se configura un cruce genético.

Configuración de una cruz con Drosophila es una técnica útil para estudiar genética. Así que vamos a empezar!

El primer paso para establecer una cruz es recoger las hembras vírgenes del genotipo deseado, así que usted puede controlar exactamente que hombre con quien ella se acoplará. Drosophila son incapaces de compañero durante las primeras 8 horas después de la eclosión, para recoger los adultos muy jóvenes garantiza la virginidad. Para recoger nuevamente las hembras eclosed, claro el frasco en el depósito de cadáveres para deshacerse de todos los adultos. Cada 3-4 horas, compruebe el frasco recién eclosed adultos y recoger las hembras en un vial nuevo sin ningún macho hasta que esté listo para su uso. Hembras vírgenes se identifican por su color de cuerpo muy ligero y una mancha oscura en su abdomen, conocido como el meconio.

Cuando esté listo para empezar la Cruz, combinan los machos 4-6 con 4-6 hembras vírgenes de sus genotipos deseados en un frasco de alimento y almacenar a 25° C y 60% de humedad. Después de 3-4 días, las larvas estarán presentes y los padres deben ser transferidos a un nuevo frasco, impidiendo el apareamiento con la progenie de los padres. Después de aproximadamente 10 días, surgirán nuevos descendientes y sus fenotipos pueden ser examinadas.

Una herramienta que utilizan los investigadores de la Drosophila son cromosomas balanceador que previenen recombinación genética y contienen marcadores genéticos como rizados alas, que son útiles para determinar el genotipo correcto de una mosca. Si querías moscas que son heterocigotos para dos mutaciones diferentes, se puede cruzar un stock con mutación #1 sobre el cromosoma balanceador CyO, a una segunda acción con mutación #2 también equilibrada sobre CyO. Ninguna progenie que emergen sin alas rizadas es heterocigotos para ambas mutaciones.

Otra herramienta utilizada en la investigación de Drosophila es el sistema UAS-GAL4, que permite a los investigadores a expresar o caída un gen en un tejido específico. GAL4 es un factor de transcripción de la levadura que es conducido por un promotor específico de tejido y UAS es la secuencia de activación Upstream, que controla la expresión del gen de interés. Cuando se cruza una mosca con un tejido específico GAL4 transgen a una mosca con un transgen de la UAS con el gen de interés directamente aguas abajo, la proteína GAL4 une a la UAS y unidades de expresión de su gen deseado. Por ejemplo, UAS-GFP cruzada ápteros-GAL4, que es específica para los discos ala pupa, expresa GFP específicamente en esas células.

Hay muchas aplicaciones que pueden utilizarse para estudiar la reproducción y el desarrollo de Drosophila . Una aplicación es el análisis conductuales – específicamente el comportamiento de cortejo. Durante el cortejo, el macho se orienta hacia la hembra y la sigue mientras le golpeando con sus patas delanteras. Si la hembra es receptiva, ella permite que el macho montar le. El hombre de rizos su abdomen y las transferencias de líquido seminal en la hembra, un proceso conocido como cópula. El análisis de estos comportamientos de cortejo en varios mutantes da la penetración en el control genético del comportamiento

Desarrollo de Drosophila es un proceso muy dinámico que incluye muchos movimientos celulares y cambios en la forma, que pueden ser estudiados a través de viven imagen. Por ejemplo, cierre dorsal durante la embriogénesis es cuando se cierra una brecha en el epitelio en forma de cremallera-como con la coordinación de muchos tipos de células. Cierre dorsal durante el desarrollo se utiliza a menudo como un modelo para estudiar el cierre de la herida, que puede tener implicaciones clínicas.

Una tercera aplicación utilizada para entender los procesos durante el desarrollo de Drosophila es ARN de interferencia, que derriba a la actividad de los genes individuales y puede ser utilizado en pantallas genética reversa a gran escala. Por ejemplo, dsRNA puede ser inyectado en embriones, y el impacto de la caída en el gen en el desarrollo del órgano, por ejemplo, puede ser evaluado. Aquí, el ARN de interferencia reveló un gen importante para la fusión durante el desarrollo traqueal.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a Drosophila melanogaster reproducción y desarrollo. En este video repasamos: el ciclo de vida de Drosophila , incluyendo detalles acerca de cada etapa de desarrollo. También aprendimos a utilizar la capacidad reproductiva de la Drosophila para estudiar genética y establecer una cruz. Finalmente, nos enteramos de cómo son útiles para la comprensión de procesos complejos como el comportamiento, encierro de la herida y el desarrollo de órganos reproducción y desarrollo de la Drosophila .

Transcript

Drosophila melanogaster, are widely used as a model organism in the study development and reproduction. Drosophila progress through several developmental stages in a process known as the life cycle and each stage provides a unique platform for developmental research. In this video, we will present the basics of Drosophila development and reproduction, including how to set up a genetic cross and discuss how this research can be applied to understand processes ranging from wound healing to behavior.

First, let’s discuss the Drosophila life cycle. Drosophila progress through 4 main stages of development: embryo, larva, pupa, and adult.

The embryo is a fertilized egg that is about 0.5 mm long and oval shaped. Immediately after fertilization, the embryo undergoes rapid mitotic division without growth. The zygotic nucleus undergoes nine rounds of nuclear division, but does not undergo cytokinesis, forming a multi-nucleate cell called a syncytial blastoderm. Since all the nuclei in the syncytial blastoderm share a common cytoplasm, proteins can diffuse freely, forming morphogen gradients, which are important for establishing the body plan and patterning of individual organs and tissues in the fly. After the 10th nuclear division, the nuclei migrate to the periphery of the syncytial blastoderm . Following the 13th round of nuclear division, which occurs approximately 3 hours after fertilization, the 6000 nuclei in the syncytial blastoderm become individualized forming the cellular blastoderm . The cellular blastoderm contains a monolayer of cells and is transformed into a complex multi-layered structure, in a process known as gastrulation. During gastrulation, cell shape changes drive invaginations of the monolayer, ultimately creating the endoderm, mesoderm, and ectoderm germ layers. The endoderm gives rise to the gut, the mesoderm gives rise to the muscles and heart, and the ectoderm gives rise to the epidermis and central nervous system. After 24 hours, embryos hatch as larvae.

Larvae are white with worm-like segmented bodies. They crawl around in wet food eating constantly, leading to rapid growth. Larvae progress through three stages: the first instar for 24 hours, second instar for another 24 hours, and third instar for 48 hours. Molting occurs between each stage. When ready for pupation, third instar larvae leave their food source and attach to a firm surface, such as the side of a vial.

Pupa are immobile and are initially soft and white but eventually harden and turn brown. Over a period of four days, larval tissues degenerate and adult tissues form. Eclosion marks the end of the pupal stage and the flies emerge as adults.

8 hours after eclosion, the adults become sexually receptive and begin to mate, starting the life cycle all over again.

The complete life cycle takes about 10 days at 25 °C, but it can be affected by temperature. For example, at 18 °C the life cycle is about 19 days and at 29 °C, the life cycle is only 7 days.

Throughout development, careful genetic regulation of pattern formation establishes the body plan and specifies individual tissues and organs. Importantly, the establishment of the anterior-posterior axis defines the head to tail orientation of the organism, and is regulated by several groups of genes.

First, maternal effect genes are supplied in the oocyte and inherited from the female. They are important in the syncytial blastoderm for initially establishing the anterior and posterior of the embryo. In particular, the bicoid gene defines the anterior of the embryo including the head and thorax, while the nanos gene defines the posterior, including the abdomen.

Second, the segmentation genes, which are regulated by maternal effect genes, include the gap genes and pair rule genes. Gap genes establish a segmented body plan along the anterior-posterior axis by broadly subdividing the embryo. Pair rule genes are expressed in a striped pattern perpendicular to anterior-posterior axis, further dividing the embryo into smaller segments. Then the segment polarity genes, such as engrailed begin to establish cell fates within each segment.

Lastly, homeotic genes are responsible for defining particular anatomical structures, such as wings and legs. Interestingly, the order of the genes on the chromosome reflect how they are expressed along the anterior-posterior axis.

Drosophila are extremely fertile organisms that can produce thousands of progeny in a lifetime. Females lay hundreds of eggs per day and continue to fertilize eggs well after mating has occurred.

Drosophila are also sexually dimorphic organisms meaning that the females are phenotypically distinct from males. In particular, males are smaller than females and have darkly colored external genitalia, as well as more black pigment on their lower abdomens. Males also have a patch of bristles on their forelegs called sex combs used to latch onto the female during copulation. These distinct phenotypic differences make it very easy to distinguish males from females, which is particularly useful when setting up a genetic cross.

Setting up a cross with Drosophila is a useful technique for studying genetics. So let’s get started!

The first step to setting up a cross is to collect virgin females of the desired genotype, so that you can control exactly which male with whom she will mate. Drosophila are unable to mate during the first 8 hours after eclosion, so collecting very young adults guarantees virginity. To collect newly eclosed females, clear the vial into the morgue to get rid of all adults. Every 3-4 hours, check the vial for newly eclosed adults, and collect the females in a new vial without any males until ready for use. Virgin females are identified by their very light body color and a dark spot on their abdomen, known as the meconium.

When ready to begin the cross, combine 4-6 males with 4-6 virgin females of your desired genotypes in a dated food vial, and store at 25° C and 60% humidity. After 3-4 days, larvae will be present and the parents should be transferred to a new vial, preventing the parents from mating with the progeny. After approximately 10 days, new offspring will emerge and their phenotypes can be examined.

One tool that Drosophila researchers use are balancer chromosomes that prevent genetic recombination and contain genetic markers such as curly wings, which are useful in determining the correct genotype of a fly. If you wanted flies that are heterozygous for two different mutations, you can cross a stock with mutation #1 over the balancer chromosome CyO, to a second stock with mutation #2 also balanced over CyO. Any progeny that emerge without curly wings are heterozygous for both mutations.

Another commonly used tool in Drosophila research is the UAS-GAL4 system, which allows researchers to express or knockdown a gene in a specific tissue. GAL4 is a yeast transcription factor that is driven by a tissue specific promoter and UAS is the Upstream Activating sequence, which controls the expression of the gene of interest . When you cross a fly with a tissue specific GAL4 transgene to a fly with a UAS transgene with your gene of interest directly downstream, the GAL4 protein binds the UAS and drives expression of your desired gene. For example, UAS-GFP crossed to apterous-GAL4, which is specific for the wing discs in pupa, expresses GFP specifically in those cells.

There are many applications that can be used to study Drosophila development and reproduction. One application is behavioral analyses – specifically courtship behavior. During courtship, the male orients himself towards the female and follows her while tapping her with his forelegs. If the female is receptive, she allows the male to mount her. The male curls his abdomen and transfers seminal fluid into the female, a process known as copulation. The analyses of these behaviors of courtship in various mutants gives insight into the genetic control of behavior

Drosophila development is an extremely dynamic process that includes many cell movements and shape changes, which can be studied via live imaging. For example, dorsal closure during embryogenesis is when a gap in the epithelium is closed in a zipper-like manner involving the coordination of many cell types. Dorsal closure during development is often used as a model to study wound closure, which may have clinical implications.

A third application used to understand processes during Drosophila development is RNA interference, which knocks down the activity of individual genes and can be used in large scale reverse genetic screens. For example, dsRNA can be injected into embryos, and the impact of the gene knockdown on organ development, for example, can be assessed. Here, RNA interference revealed a gene important for fusion during tracheal development.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Drosophila melanogaster reproduction and development . In this video we reviewed: the Drosophila life cycle, including details about each stage of development. We also learned how to use the reproductive capabilities of Drosophila to study genetics and set up a cross. Finally, we learned how Drosophila development and reproduction are useful for understanding complex processes such as behavior, wound closure, and organ development.

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