Modelos DNBS / TNBS colitis: Proporcionar ideas sobre la enfermedad inflamatoria intestinal y efectos de la grasa en la dieta

El objetivo general de este procedimiento es ofrecer un método alternativo e económico para estudiar la enfermedad inflamatoria intestinal o EII utilizando ácido dinitrobenceno sulfónico o DNBS. Esto se logra primero mediante la administración intraanal de DNBS mediante inserción suave en el ano. En el segundo paso, se obtienen secciones de tejido del intestino grueso para el cribado histológico y para evaluar la actividad de mieloperoxidasa en los tejidos tratados con DNBS; finalmente, los efectos de los aceites dietéticos sobre la pérdida de peso y la colitis pueden evaluarse mediante métodos macroscópicos y microscópicos.

La principal ventaja de este procedimiento frente al método existente de sulfato de dextrona sódica es que el método DNBS es fácil de realizar, menos costoso y altamente reproducible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de investigación de la EII, como cuáles son los roles del estrés y la depresión en la recurrencia de la EII, o cuáles son los mecanismos subyacentes en la lesión y reparación intestinales. Para la administración rectal de DNBS en ratones, comience por conectar una jeringa de un mililitro a una aguja de calibre 19. Equipada con un catéter de polietileno 50, aspire luego el DNBS recién preparado hacia el catéter.

A continuación, aplique gel lagrimal a un ratón anestesiado y ejerza una presión suave con las yemas de los dedos sobre el extremo posterior del animal para eliminar cualquier materia fecal presente en el colon distal. Ahora inyecte una pequeña cantidad de la solución de DNBS para lubricar el colon y facilitar la inserción, introduciendo suavemente el catéter por vía intraanal unos tres a cuatro centímetros. Una vez que el catéter esté en su lugar, inyecte 100 microlitros de DNBS o un volumen igual de etanol al 50% para los animales de control.

Luego, coloque al animal con la cabeza hacia abajo durante 90 segundos para evitar la pérdida de los reactivos. Después de la administración de DNBS, alimente a los animales con agua de sacarosa al 8% en solución salina al 0,2% para prevenir la deshidratación durante la primera semana. Monitoree cuidadosamente al animal diariamente en busca de pérdida de peso, deshidratación o malestar durante toda la duración del experimento, hasta el punto de tiempo deseado.

Después del desafío con DNBS, abra la cavidad abdominal del animal sacrificado y retire todo el intestino grueso. Luego, abra el intestino longitudinalmente. Deben observarse úlceras mucosas macroscópicas aproximadamente de dos a tres centímetros proximales desde el extremo distal del colon.

Recolecte secciones de 0,5 centímetros proximales al sitio de daño macroscópico máximo en los animales experimentales y segmentos del colon de las ubicaciones anatómicas correspondientes en los animales control. Luego, congele rápidamente en nitrógeno líquido 0,5 centímetros de una sección control y otra tratada con 1D NBS para la evaluación de la actividad de mieloperoxidasa, y fije las otras secciones en formaldehído tamponado al 10 % durante la noche para análisis histológico. A la mañana siguiente, lave los tejidos fijados en formalina con etanol al 70 %, colóquelos en una cubeta y envíelos a un laboratorio de histología para su inclusión en parafina y tinción con hematoxilina y eosina destinada a la puntuación histológica.

Luego, puntúe al menos tres secciones de tejido de cada animal bajo un microscopio óptico para determinar los puntajes de daño histológico de cada grupo. Para ensayar la actividad de mieloperoxidasa de los tejidos tratados con DNBS, primero homogenice los tejidos control y experimentales congelados rápidamente en tampón de homogenización de mieloperoxidasa, obteniendo una suspensión con un segmento de colon de 50 miligramos por mililitro de tampón de homogenización. A continuación, alícuote la solución homogenizada en porciones de un mililitro y centrifúguelas durante dos minutos a 10.000 × g y 4 °C.

A continuación, transfiera 100 microlitros de cada alícuota a cubetas individuales y agregue 2,9 mililitros de PBS suplementado con IDE, dihidrocloruro y peróxido de hidrógeno, mezclando vigorosamente. Por último, mida la velocidad de absorbancia utilizando un espectrofotómetro a 460 nanómetros. Tras el desafío intrarrectal con DNBS tal como se acaba de demostrar.

Se observa una pérdida de peso significativa a las 48 horas en ratas suplementadas con aceite de pescado o de canola, y a las 72 horas en ratas suplementadas con aceite de cártamo. La pérdida máxima de peso observada ocurre a las 48 horas en las ratas suplementadas con aceite de pescado, y a las 72 horas en las ratas suplementadas con aceite de canola o de cártamo.

El aumento de peso se reanudó después de 72 horas y, a los cinco días posteriores a la administración de DNBS, los grupos tratados con aceite de pescado y aceite de cártamo exhibieron pesos corporales similares a sus valores basales. Las ratas control suplementadas con los aceites dietéticos y desafiadas con etanol intraanal ganaron peso progresivamente durante todo el período del estudio de cinco días. El daño intestinal causado por el DNBS puede ser extenso.

Sin embargo, el área de daño máximo generalmente se localiza en los seis centímetros distales del colon en ratas y en los tres centímetros distales en ratones. Mediante un examen histológico más detallado, se observa un daño epitelial extenso, que incluye la formación de úlceras, infiltración de neutrófilos y linfocitos, agotamiento de moco y edema. Aunque estos signos histológicos de inflamación y daño tisular son evidentes en los tres grupos suplementados con aceites dietéticos tras la exposición al DNBS, el daño más severo se observa en el grupo con aceite de cártamo, seguido por el grupo con aceite de canola.

Mientras que las ratas del grupo con aceite de pescado muestran una lesión epitelial mínima y una infiltración limitada de células inflamatorias en la mucosa. Las diferencias en el daño histológico entre las muestras pueden cuantificarse para permitir una mejor comparación entre los grupos. La gráfica ilustra los puntajes de daño histológico para los tres grupos con diferentes aceites en la dieta durante la colitis inducida por DNBS.

Como se observa en las secciones teñidas con h y e, el grupo suplementado con aceite de cártamo presenta el mayor grado de daño, seguido por el grupo con aceite de canola. Aunque el grupo con aceite de pescado muestra la menor cantidad de daño, el grado de infiltración de células inflamatorias, particularmente de neutrófilos, puede examinarse más a fondo mediante un ensayo de actividad de mieloperoxidasa. Tal como se esperaba a partir de los puntajes de daño histológico.

La evaluación de la actividad de mieloperoxidasa en colon de ratas al quinto día posterior a la exposición a DNBS revela un aumento en la actividad en los tres grupos, observándose la mayor actividad de mieloperoxidasa en el grupo tratado con aceite de cártamo, seguido por el grupo con aceite de canola y el grupo con aceite de pescado. Al realizar este procedimiento, es importante recordar anestesiar ligeramente a los ratones y optimizar las dosis de DNBS tras su administración. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad inflamatoria intestinal exploraran los mecanismos que controlan la inflamación intestinal en modelos animales de EII.

No olvide que trabajar con DNBS puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones como el uso de ropa protectora, guantes, gafas y protectores faciales al preparar la solución.