Modelos DNBS / TNBS colitis: Proporcionar ideas sobre la enfermedad inflamatoria intestinal y efectos de la grasa en la dieta

El objetivo general de este procedimiento es ofrecer un método alternativo y económico para estudiar la enfermedad inflamatoria intestinal o EII utilizando el ácido zonico nitrobenceno DY o DNBS. Esto se logra mediante la administración intrarrectal de DNBS a través de una inserción suave en el ano. En el segundo paso, se adquieren secciones de tejido del intestino grueso para el cribado histológico y para evaluar la actividad de la mieloperoxidasa de los tejidos desafiados con DNBS, en última instancia, los efectos de los aceites dietéticos sobre la pérdida de peso y la colitis pueden evaluarse mediante métodos macroscópicos y microscópicos.

La principal ventaja de este asunto sobre el método existente de sulfato de sodio dextron es que el método DNBS es fácil de realizar, menos costoso y altamente reproducible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la EII, como cuáles son los roles del estrés y la depresión en la recurrencia de la EII, o cuáles son los mecanismos subyacentes en la lesión intestinal y la reparación Para la instalación rectal de DNBS en ratones, comience conectando una jeringa de un mililitro a una aguja de calibre 19. Equipado con un catéter de polietileno 50, luego aspire DNBS recién preparado en el catéter.

A continuación, aplique gel lagrimal a un ratón anestesiado y aplique una suave presión con las yemas de los dedos en el extremo posterior del animal para eliminar las heces presentes en el colon distal. Ahora inyecte una pequeña cantidad de la solución de DNBS para lubricar el colon para facilitar la inserción, mientras inserta suavemente el catéter intrarrectal unos tres o cuatro centímetros. Una vez que el catéter esté en su lugar, inyecte 100 microlitros de DNBS o un volumen igual de 50% de etanol para los animales de control.

A continuación, coloque la cabeza del animal hacia abajo durante 90 segundos para evitar la pérdida de los reactivos. Después de la administración de DNBS, alimente a los animales con agua con sacarosa al 8% en solución salina al 0,2% para prevenir la deshidratación durante la primera semana. Monitorear cuidadosamente el animal diariamente para detectar pérdida de peso, deshidratación o angustia durante la duración del experimento, es decir, en el momento deseado.

Después de la provocación con DNBS, abra la cavidad abdominal del animal sacrificado y extraiga todo el intestino grueso. A continuación, abra el intestino longitudinalmente. Las úlceras macroscópicas de la mucosa deben observarse aproximadamente a dos o tres centímetros proximales del extremo distal del colon.

Recoja secciones de 0,5 centímetros proximales al sitio de máximo daño macroscópico en los animales de experimentación y segmentos del colon de las ubicaciones anatómicas correspondientes de los animales de control. A continuación, congele a presión 0,5 centímetros de una sección de control y 1D tratada con NBS en nitrógeno líquido para evaluar la actividad de la mieloperoxidasa y fije las otras secciones en formina tamponada neutra al 10% durante la noche o en un análisis histológico. A la mañana siguiente, lavar los tejidos fijados en formol con etanol al 70% y colocarlos en un casete para enviarlos a un centro de histología para que los incorporen a parafina y los tiñan con hematina y eoína para la puntuación histológica.

A continuación, marque al menos tres secciones de tejido de cada animal bajo un microscopio óptico para determinar las puntuaciones de daño histológico de cada grupo Para analizar la actividad de la mieloperoxidasa de los tejidos desafiados con DNBS. En primer lugar, homogeneice los tejidos experimentales y de control congelados a presión en el tampón de homogeneización de la mieloperoxidasa para obtener un segmento de colon de 50 miligramos por mililitro de suspensión de tampón de homogeneización. A continuación, alícuota de la solución homogeneizada en porciones de un mililitro y centrifugarlas durante dos minutos a 10.000 veces g y cuatro grados centígrados.

A continuación, transfiera 100 microlitros de cada alícuota a cubetas individuales y agregue 2,9 mililitros de PBS suplementado con IDE, diclorhidrato y peróxido de hidrógeno mezclando vigorosamente. Finalmente, mida la tasa de absorbancia usando un espectrofotómetro a 460 nanómetros. Después de la provocación intrarrectal con DNBS como se acaba de demostrar.

Se observa una pérdida de peso significativa a las 48 horas en ratas suplementadas con aceite de pescado o canola, y a las 72 horas en ratas suplementadas con aceite de cártamo. La pérdida de peso máxima observada ocurre a las 48 horas en el aceite de pescado, en ratas suplementadas, y a las 72 horas en ratas. Complementado con aceite de canola o cártamo.

El aumento de peso se reanudó después de 72 horas y cinco días después de la administración de DNBS, los grupos tratados con aceite de pescado y aceite de cártamo mostraron pesos corporales similares a sus valores basales. Las ratas de control suplementadas con los aceites dietéticos y desafiadas con etanol intrarrectal aumentaron de peso de manera constante durante todo el período de estudio de cinco días. El daño intestinal causado por el DNBS puede ser generalizado.

Sin embargo, el área de daño máximo generalmente se localiza en los seis centímetros distales del colon en ratas y en los tres centímetros distales en ratones. Tras una evaluación histológica más detallada, se observa una lesión epitelial extensa, que incluye la formación de úlceras, infiltración de neutrófilos y linfocitos, depleción de moco y edema. Aunque estos signos histológicos de inflamación y daño tisular son evidentes en los tres grupos de aceite dietético suplementados con DNBS, el daño más severo se observa en el grupo de aceite de cártamo, seguido por el grupo de aceite de canola.

Mientras que las ratas en el grupo del aceite de pescado demuestran una lesión epitelial mínima y una infiltración limitada de células inflamatorias en la mucosa cosa. Las diferencias en el daño histológico entre las muestras se pueden cuantificar para permitir una mejor comparación entre los grupos. El gráfico ilustra las puntuaciones de daño histológico para los tres grupos de aceites dietéticos durante la colitis DNBS.

Como se observa en las secciones teñidas h y e, el grupo suplementado con aceite de cártamo exhibe la mayor extensión de daño, seguido por el grupo de aceite de canola. Si bien el grupo del aceite de pescado muestra la menor cantidad de daño, el grado de infiltrado de células inflamatorias, particularmente de neutrófilos, se puede examinar más a fondo mediante la realización de un ensayo de actividad de mieloperoxidasa. Como se esperaba de las puntuaciones de daño histológico.

La evaluación de la actividad de la mieloperoxidasa en el colon de las ratas en el quinto día después de la exposición a DNBS revela un aumento de la actividad en los tres grupos, con la mayor actividad de la mieloperoxidasa observada en el grupo del aceite de cártamo, seguido por el grupo del aceite de canola y el grupo del aceite de pescado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar anestesiar ligeramente a los ratones y optimizar las dosis de DNBS después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad inflamatoria intestinal exploraran los mecanismos que controlan la inflamación intestinal en modelos animales de EII.

No olvide que trabajar con DNBS puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben usar precauciones como ropa protectora, guantes, gafas y tratamientos faciales mientras se prepara la solución.