Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los sitios de unión genómica de los reguladores de respuesta bacterianos de dos componentes mediante un ensayo in vitro basado en microarreglos. Esto se logra clonando y purificando una proteína reguladora de respuesta marcada, activándola mediante fosforilación in vitro y determinando un gen diana utilizando ensayos de cambio en la movilidad electroforética como control positivo para los pasos posteriores del microarreglo. Como segundo paso, la proteína reguladora de respuesta purificada se mezcla con el ADN genómico, lo que permite separar el ADN unido a la proteína del ADN de entrada mediante purificación por afinidad.

A continuación, el ADN unido a proteína y el ADN de entrada se amplifican mediante qPCR y se verifica el enriquecimiento del gen diana de control positivo en la fracción unida a proteína, se etiquetan fluorescentemente, se combinan y se hibridan a un microarreglo de baldosas. Con el fin de determinar los sitios de unión genómica del regulador de respuesta, los resultados muestran los genes más probables que son regulados por el regulador de respuesta en estudio, y los resultados pueden validarse adicionalmente mediante ensayos de retardo en electroforesis. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como el chip-chip in vivo es que puede utilizarse incluso cuando las señales activadoras y las condiciones no son conocidas para los sistemas de dos componentes.

Este método es de gran importancia para el campo de la señalización bacteriana, ya que la gran mayoría de los reguladores de respuesta tienen objetivos génicos desconocidos y este método ayuda a desentrañar redes reguladoras complejas. Amy Chen, una asistente de investigación de mi laboratorio, demostrará este procedimiento antes de comenzar el mismo.

Purifique un rr, específicamente la proteína DVU 3 0 2 3 expresada a partir de una mezcla de genes DVU 3 0 2 3 clonados. Utilice 0,5 picomoles de la proteína DVU 3 0 2 3 con 100 femtomoles de un sustrato de ADN previamente preparado por atenuación en una solución amortiguadora hasta un volumen total de 20 microlitros. Después de preparar una reacción sin ninguna proteína como control, incube las reacciones a temperatura ambiente sobre la bancada durante 20 minutos.

Después de la incubación, agregue cinco microlitros de tampón de carga al 5x a las reacciones de unión. Cargue 18 microlitros de cada reacción en un gel mini de poliacrilamida al 6% previamente preparado en tampón 0,5x TBE y corra a 100 voltios durante dos horas. Después de que el gel haya corrido, corte una membrana de nailon cargada al tamaño del gel y sumérjala en 0,5x TBE durante al menos 10 minutos. Luego retire el gel del cassette.

Corte cualquier cresta del gel y coloque el gel y la membrana entre dos papeles filtro gruesos empapados en TBE 0,5X. Coloque el gel y la membrana dentro de un aparato de transferencia semiseca y corra a 20 voltios durante 30 minutos. A continuación, coloque la membrana dentro de un instrumento comercial de cruzamiento con luz UV y establezca el tiempo en tres minutos tras desarrollar el trasplante usando un kit de detección quimioluminiscente; luego, obtenga la imagen mediante un ordenador conectado a una cámara equipada con CCD.

Busque un cambio en la movilidad del sustrato de ADN en presencia de la RR, lo que indica que la RR se une al ADN que se está probando. A continuación, mezcle de dos a tres microgramos de ADN genómico compartido con 0,5 picomoles de DVU 3 0 2 3 en una solución amortiguadora. Después de incubar la reacción a 25 grados Celsius durante 30 minutos, transfiera 10 microlitros de la mezcla a un tubo de 1,5 mililitros y etiquételo como ADN de entrada.

Añada 30 microlitros de resina de níquel NTA aros a un tubo microfuga de 0.6 mililitros. Centrifugue la muestra a 100 GS durante un minuto para recoger la resina en el fondo del tubo tras la centrifugación. En este punto, retire el sobrenadante.

Añada 100 microlitros de tampón de lavado y agite suavemente el tubo para mezclar el contenido. Tras la centrifugación, aplique 100 G durante dos minutos y elimine el sobrenadante. Añada los 90 microlitros restantes de la reacción de unión al lavado de la resina de NTA con níquel.

A continuación, incubar la muestra en un agitador rotatorio durante 30 minutos. Una vez finalizado, centrifugar la muestra a 100 Gs durante dos minutos. Después de eliminar el sobrenadante, repetir los pasos de lavado otras tres veces.

A continuación, añada 35 microlitros de tampón de elución a la resina y mezcle mediante vortex. Incube la muestra en la bancada a temperatura ambiente durante cinco minutos. Tras centrifugar la muestra, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y etiquételo como la fracción de ADN unido a proteína.

Luego, agregue 35 microlitros del tampón de elución al ADN de entrada tras la purificación de las fracciones de ADN de entrada y de ADN unido a proteínas. Añada 10 microlitros de cada una a tubos de PCR separados. A continuación, agregue un microlitro de tampón de fragmentación 10 x, dos microlitros de tampón de preparación de biblioteca y un microlitro de solución de estabilización de biblioteca a cada muestra, mezclando bien las muestras mediante vortex.

Incube las muestras en un termociclador a 95 grados Celsius durante dos minutos. Una vez finalizado, enfríe las muestras en hielo. A continuación, agregue un microlitro de enzima de preparación de biblioteca a las muestras y mezcle el contenido mediante pipeteo.

Incube las muestras en un termociclador. Después de la incubación, agregue 47,5 microlitros de agua, 7,5 microlitros de mezcla maestra de amplificación 10 x y cinco microlitros de polimerasa a cada tubo. Una vez que las muestras hayan sido mezcladas, caliéntelas en un termociclador.

Prepare reacciones de QPCR por triplicado para cada molde de ADN preparando una mezcla maestra 1x para cada conjunto de cebadores diseñado previamente, luego alícuota 18 microlitros de la mezcla maestra por pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Diluya las muestras de ADN amplificado y purificado, así como las muestras de ADN ligado a proteína, con agua hasta cinco nanogramos por microlitro y agregue dos microlitros de cada muestra a los pocillos. A continuación, selle la placa con una película selladora UltraClear para QPCR.

Centrifugar la placa a 200 ×g durante un minuto. Después de colocar la placa en un ciclo de la máquina de QPCR en tiempo real, utilizando las siguientes condiciones para etiquetar el ADN de entrada con s si tres y el ADN enriquecido con sci cinco, mezclar un microgramo de ADN con 40 microlitros de nonámeros marcados con S3 SCI-FI, y ajustar el volumen a 80 microlitros con agua. Desnaturalizar las muestras a 98 grados Celsius durante 10 minutos en la oscuridad en un termociclador.

Una vez finalizado, enfríe rápidamente las muestras en hielo durante dos minutos, agregue dos microlitros de polimerasa exo tres primas, cinco primas, cinco milimolares de trifosfatos de desoxinucleótidos y ocho microlitros de agua a cada reacción. Después de mezclar, incube las reacciones a 37 grados Celsius durante dos horas en la oscuridad en un termociclador. En este punto, agregue EDTA hasta alcanzar 50 milimolares para detener las reacciones y solución de cloruro de sodio hasta 0,5 molar.

Luego, transfiera a tubos de 1,5 mililitros que contienen un 0,9 de volumen de isopropanol, tras la incubación en la oscuridad durante 10 minutos. Centrifugue las muestras a 12.000 GS durante 10 minutos. Combine seis microgramos de cada una de las muestras de ADN marcadas S3 y sci-fi en un tubo de 1,5 mililitros y seque al vacío en una centrífuga con calor bajo en la oscuridad, cubriendo la tapa de la centrífuga si es transparente.

Una vez que los pellet estén secos, se suspenden en cinco microlitros de agua. Luego, añada 13 microlitros de una mezcla maestra de solución de hibridación 1x previamente preparada a las muestras tras agitarlas durante 15 segundos en vórtex, incube las muestras a 95 grados Celsius en un baño seco durante cinco minutos. Retire las muestras del baño seco y colóquelas en un sistema de hibridación a 42 grados Celsius hasta que estén listas para la carga.

A continuación, coloque el ensamblaje del portaobjetos mezclador previamente preparado dentro del sistema de hibridación. Cargue 16 microlitros de muestra en el puerto de llenado. Luego selle los puertos con una película adhesiva y active la mezcla en el sistema tras hibridar durante 16 a 20 horas a 42 grados Celsius.

Deslice el mezclador, deslícelo dentro de una herramienta de desmontaje y colóquelo dentro de un recipiente que contenga tampón tibio uno. Retire el mezclador mientras agita vigorosamente la herramienta de desmontaje. Coloque el portaobjetos en un recipiente con 50 mililitros de tampón de lavado uno y agite vigorosamente durante dos minutos.

Luego repita el paso anterior con 50 mililitros de tampón de lavado dos y 50 mililitros de tampón de lavado tres RRR DVU 3 0 2 3 desplazado. La región aguas arriba de DVU 3 0 2 5 QPCR mostró que la región aguas arriba de DVU 3 0 2 5 está enriquecida en la fracción unida a proteína en relación con el ADN de entrada, lo que indica que las condiciones de unión fueron adecuadas para DVU 3 0 2 3 DVU 0 0 1 3 fue un control negativo. Los cuatro picos superiores obtenidos tras el análisis de DAP chipp se seleccionaron como los objetivos más probables: fueron DV 3 0 2 3.

El objetivo positivo DVU 3 0 2 5 fue el primer pico obtenido con la puntuación más alta. Dos objetivos genéticos son otras dos permeasas de lactato codificadas por genes. El cuarto objetivo genético no se encuentra en una región upstream, sino en la región intergénica entre dos genes transcritos de forma convergente. Las regiones upstream de los objetivos obtenidos mediante DAP-chip se utilizaron con MEME para predecir un motivo del sitio de unión.

El motivo se validó además mediante sustituciones en las bases conservadas dentro del motivo, lo que eliminó el cambio en la unión. El motivo validado se utilizó para analizar otros genomas de bacterias reductoras de sulfato que presentaban ortólogos de DVU 3 0 2 3; los loci se eligieron como posibles dianas génicas cuando el motivo se localizaba en regiones upstream de marcos de lectura abiertos, utilizando secuencias de motivos predichas para rs autólogos. Se generó un motivo de sitio de unión consenso, que se asemejaba estrechamente al de Divo Garris Hilton Burrow.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el método Daptive para determinar los genes diana de proteínas reguladoras. Este método puede emplearse para analizar el tamaño de unión de cualquier proteína reguladora, siempre que la proteína pueda purificarse y se conozca la secuencia del genoma.