Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los sitios de unión genómica de los reguladores de respuesta bacteriana de dos componentes utilizando un ensayo in vitro basado en microarrays. Esto se logra clonando y purificando una proteína reguladora de respuesta marcada, activándola por fosforilación in vitro y determinando un gen objetivo mediante ensayos de cambio de movilidad electroforética para usar como control positivo para los pasos posteriores de los microarrays. Como segundo paso, la proteína reguladora de la respuesta purificada se mezcla con el ADN genómico she, lo que permite separar el ADN unido a la proteína del ADN de entrada mediante la purificación por afinidad.

A continuación, el ADN unido a la proteína y el ADN de entrada se amplifican QPCR verificados para el enriquecimiento del gen objetivo de control positivo en la fracción unida a la proteína, marcados con fluorescencia, agrupados e hibridados en un microarray de mosaico. Con el fin de determinar los sitios de unión genómica del regulador de la respuesta, los resultados muestran los genes más probables que están regulados por el regulador de la respuesta en estudio y los resultados se pueden validar aún más utilizando ensayos de cambio de movilidad electroforética. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como el chip in vivo, es que se puede utilizar incluso si no se conocen las señales de activación y las condiciones para los sistemas de dos componentes.