Name: Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprende el método DAP-chip para identificar sitios de unión genómicos de reguladores de respuesta bacterianos mediante purificación de afinidad y microarrays. Esta técnica permite estudiar redes regulatorias sin conocer señales activadoras previas.

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Damos las gracias a Amy Chen por su ayuda en la preparación para la filmación del video y para la demostración de la técnica. Este trabajo realizado por ENIGMA: Ecosistemas y redes integradas con Genes y Asambleas Molecular (http://enigma.lbl.gov), un programa científico del área de focalización en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, con el apoyo de la Oficina de Ciencia, Oficina de Biológica y Investigación del Medio Ambiente, del Departamento de Energía de los EE.UU. bajo el Contrato No. DE-AC02-05CH11231.

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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses a revelar.

El método DAP-chip descrito aquí se utilizó con éxito para determinar los objetivos de genes durante varios RR en Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 de los cuales uno se muestra aquí como un resultado representativo. Para DVU3023 RR, la elección de un objetivo de genes candidatos fue sencillo. DVU3025 está situada inmediatamente aguas abajo del gen RR, y los genes RR y de destino se conservan en varias especies Desulfovibrio, y adicionalmente DVU3025 tiene un promotor sigma54 dependiente...

La capacidad de las bacterias para sobrevivir y prosperar depende críticamente de lo bien que son capaces de percibir y responder a las perturbaciones en sus ambientes, y esto a su vez depende de los sistemas de transducción de señales. El número de sistemas de señalización A codifica bacteria que se ha llamado su &quot;IQ microbiana&quot; y puede ser una indicación de la variabilidad de su medio ambiente y su capacidad de detectar señales múltiples y afinar su respuesta 1. Sistemas de dos componentes de transducción de señales (TCS) son los sistemas de señalización más prevalentes utilizados por las bacterias, y que consisten en una histidina quinasa (HK) que detecta la señal externa y transmite a través de la fosforilación de un regulador de la respuesta efectora (RR) 2. RR puede tener una variedad de dominios de salida y por lo tanto diferentes modos efectoras, pero la respuesta más común es la regulación transcripcional a través de un ADN de dominio de unión 1. Las señales detectadas y las funciones correspondientes de los conductos deferentest mayoría de TCSs siguen siendo desconocidos. Aunque los métodos in vivo, tales como chip-chip se utilizan rutinariamente para la determinación de sitios de unión de factores de transcripción genómica 3, que sólo se pueden utilizar para bacterianas RR sistema de dos componentes si se conocen las condiciones de activación o señales. A menudo, las señales ambientales que activan una TCS son más difíciles de determinar que sus genes diana. El microarray de ensayo in vitro basado descrito aquí se puede utilizar para determinar eficaz y rápidamente los objetivos de genes y predecir funciones de TCSs. Este ensayo se aprovecha del hecho de que los RR se pueden fosforilar y por lo tanto activan in vitro utilizando pequeñas moléculas donantes como fosfato de acetilo 4. En este método, llamado DAP-chip para ADN-afinidad-chip purificado (Figura 1), el gen RR de interés se clona con una etiqueta de His en E. coli, y una proteína marcada posteriormente purificado se permite a Bind a esquilada de ADN genómico. El ADN unido a la proteína se enriquecen entonces por purificación por afinidad, el ADN enriquecido y de entrada se amplifican, marcado con fluorescencia, agrupados juntos y se hibridó a una matriz de mosaico que está hecho a medida para el organismo de interés (Figura 1). Microarray experimentos están sujetos a los artefactos, por lo que se emplean pasos adicionales para optimizar el ensayo. Una de esas medidas es tratar de determinar un objetivo para el RR en estudio el uso de ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (véase el flujo de trabajo en la Figura 2). Entonces, después de la unión al ADN genómico y los pasos de DAP, el ADN unido a proteína y de entrada se examinó por qPCR para ver si el objetivo positivo se enriquece en la fracción unida a proteínas en relación con la fracción de entrada, confirmando de este modo las condiciones de unión óptimas para el RR (Figura 2). Después de la gama de hibridación, los datos se analizan para encontrar picos de señal de mayor intensidad que indican loci del genoma en donde la proteína had obligado. Las funciones pueden ser predichos para el RR en base a los objetivos de genes obtenidos. Los loci genómicos de destino se utilizan para predecir motivos sitio de unión, que luego son validados experimentalmente utilizando EMSAs (Figura 2). Las predicciones funcionales y objetivos de genes para el RR pueden entonces extenderse a especies que codifican los RR ortólogos mediante el escaneo de los genomas de los motivos de unión similares (Figura 2), estrechamente relacionado. El método DAP-chip puede proporcionar una gran cantidad de información de un TCS donde antes no había ninguna. El método también puede utilizarse para cualquier regulador transcripcional si la proteína se puede purificar y condiciones de unión de ADN se puede determinar, y para cualquier organismo de interés con una secuencia del genoma disponible. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. El chip purificado-ADN-afinidad (DAP-chip) estrategia 7. El gen RR a partir del organismo de interés se clona con un carboxi-terminal de His-tag en una E. cepa de expresión coli. Se purificó la proteína marcada con His se activa por fosforilación con fosfato de acetilo, y se mezcla con el ADN genómico cortado. Una alícuota de la reacción de unión se guarda como ADN de entrada, mientras que el resto se sometió a purificación de afinidad utilizando resina de Ni-NTA. La entrada y el ADN RR-unidos se todo el genoma amplificado, y marcado con Cy3 y Cy5, respectivamente. El ADN marcado se agrupen y se hibridó a una matriz de suelo de baldosas, que luego se analizó para determinar los objetivos de genes. Figura modificado y reimpreso con el licencia creative commons de 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Resumen de flujo de trabajo. Para cualquier protei etiquetados purificadon, comenzar por la determinación de un destino utilizando la EMSA. Permitir proteínas se unen al ADN genómico y ADN-purificar por afinidad (DAP) y la totalidad de su genoma amplificar (WGA) y la entrada de ADN enriquecido. Si se conoce un gen objetivo, utilizar la qPCR para asegurar que el objetivo conocido se enriquece en la fracción unida a proteínas. Si se pudo determinar ningún objetivo, pase directamente al marcaje de ADN y la gama de hibridación. Si no se pudo observar el enriquecimiento por qPCR, a continuación, repetir la proteína de unión-ADNg y pasos DAP-WGA utilizando diferentes cantidades de proteína. Utilice el análisis conjunto para encontrar picos y asignarlos a los genes objetivo. Utilice las regiones aguas arriba de los genes diana de predecir motivos sitio de unión. Validar los motivos experimentalmente utilizando EMSAs. Utilice el motivo para escanear los genomas de las especies relacionadas que codifican ortólogos de la RR en estudio, y predecir determinados genes en estas especies también. Sobre la base de los objetivos de genes obtenidos, la función fisiológica de la RR y sus ortólogos se puede predecir. Figura modificado y reimpreso usando el C creativoommons licencia de 7.

<table><tbody><tr><td>Columna HisTrapFF (columna de Ni-Sepharose)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (instrumento FPLC)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>HiPrep 26/10 Columna de desalinización</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, EE. UU</td>. <td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos marcados con biotina</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% de poliacrilamida-0,5x TBE mini gel retardante de ADN prefabricado</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU</td><td>. EC63652BOX</td><td>Alternativamente, puede verter su propio gel.</td></tr><tr><td>Membrana de nailon</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU</td><td>. INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Célula de transferencia electroforética semiseca</td><td>Biorad, Hercules, CA, EE. UU</td><td>. 170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Papel secante extra grueso, 8 x 13,5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, EE. UU</td>. <td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV Modelo XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detección quimioluminiscente de ácidos nucleicos (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU</td><td>. 89880</td><td></td></tr><tr><td>Resina de agarosa Ni-NTA</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, EE. UU</td><td>. 30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Kit de amplificación del genoma completo (tampón de fragmentación, tampón de preparación de bibliotecas, solución de estabilización de bibliotecas, enzima de preparación de bibliotecas, mezcla maestra de amplificación 10x, polimerasa WGA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.</td><td>Para la cuantificación de ADN</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, con ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Se puede utilizar cualquier mezcla de PCR Sybr Green</td></tr><tr><td>PlateMax Película de termosellado ultra clara para qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de perfil bajo y transparente de 96 pocillos</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.</td><td>4376600</td><td>Se puede utilizar cualquier sistema de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, EE. UU</td>. <td>28104</td><td>Se puede utilizar cualquier kit de limpieza de PCR</td></tr><tr><td>Nonámeros marcados con Cy3/Cy5</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, EE. UU</td>. <td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polimerasa 50,000 U/ml, 3'-5' exo-</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de hibridación</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EE. UU</td>. <td>N/A</td><td>Esta empresa ya no fabrica matrices ni artículos relacionados, por lo que será necesario utilizar fuentes alternativas como Agilent o Affymetrix.</td></tr><tr><td>Microarrays y mezcladores impresos a medida</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EE. UU</td>. N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de hibridación (2x Tampón de hibridación, Componente de hibridación A, Oligo de alineación)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EE. UU</td>. <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tampón de lavado (10x Tampón de lavado I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EE. UU</td>. N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de microarrays GenePix 4200A</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, EE. UU.</td><td>Este modelo ha sido reemplazado por otros</td><td></td>superiores</tr><tr><td>Software de microarrays GenePix Pro</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, software de análisis de chips ChIP</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, EE. UU</td><td>. N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

purificado de adn afinidad chip (dap-chip) método para determinar los objetivos de genes para bacteriana dos sistemas regulatorios componentes

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

Los métodos in vivo como chip-chip son técnicas bien establecidas que se utilizan para determinar dianas génicas globales para los factores de transcripción. Sin embargo, son de uso limitado en la exploración de dos sistemas de regulación componente bacteriano con condiciones de activación no caracterizados. Tales sistemas regulan la transcripción sólo cuando se activa en la presencia de señales únicas. Puesto que estas señales son a menudo desconocida, el método in vitro de microarrays basado en describe en este artículo de vídeo se puede utilizar para determinar objetivos de genes y sitios de unión para los reguladores de respuesta. Este método chip purificado-ADN-afinidad puede ser utilizado para cualquier regulador purificado en cualquier organismo con un genoma secuenciado. El protocolo consiste en permitir que la proteína marcada purificada para unirse al ADN genómico cortado y después de purificación por afinidad del ADN a las proteínas, seguido de marcaje fluorescente del ADN y la hibridación con un suelo de baldosas gama personalizado. Precediendo pasos que se pueden usar para optimizar el ensayo para la especificaciónTambién se describen los reguladores c. Los picos generados por el análisis de datos de la matriz se utilizan para predecir motivos sitio de unión, que luego se validan experimentalmente. Los motivo de las predicciones se pueden usar además para determinar objetivos de genes de respuesta de los reguladores ortólogos en especies estrechamente relacionadas. Se demuestra la aplicabilidad de este método mediante la determinación de los objetivos de genes y vinculante motivos sitio y predecir así la función de un regulador de respuesta DVU3023 sigma54 dependiente en la bacteria Desulfovibrio vulgaris ambiental Hildenborough.

El método anterior se aplicó para determinar los genes objetivos globales de los RR en el modelo de reducción de sulfato bacteria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Este organismo tiene un gran número de TCSs representado por más de 70 RR, lo que indica la amplia variedad de posibles señales que detecta y responde a. Los análisis in vivo en las funciones de estos sistemas de señalización son difíciles de realizar, ya que sus señales y por lo tanto sus condiciones de activación se descon...

Este artículo de vídeo describe un método de microarrays basado en vitro para determinar los objetivos de genes y sitios de unión para dos reguladores de respuesta del sistema de componentes.

Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los sitios de unión genómica de los reguladores de respuesta bacterianos de dos componentes mediante un ensayo in vitro basado en microarreglos. Esto se logra clonando y purificando una proteína reguladora de respuesta marcada, activándola mediante fosforilación in vitro y determinando un gen diana utilizando ensayos de cambio en la movilidad electroforética como control positivo para los pasos posteriores del microarreglo. Como segundo paso, la proteína reguladora de respuesta purificada se mezcla con el ADN genómico, lo que permite separar el ADN unido a la proteína del ADN de entrada mediante purificación por afinidad.A continuación, el ADN unido a proteína y el ADN de entrada se amplifican mediante qPCR y se verifica el enriquecimiento del gen diana de control positivo en la fracción unida a proteína, se etiquetan fluorescentemente, se combinan y se hibridan a un microarreglo de baldosas. Con el fin de determinar los sitios de unión genómica del regulador de respuesta, los resultados muestran los genes más probables que son regulados por el regulador de respuesta en estudio, y los resultados pueden validarse adicionalm

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

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Biología

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

Inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas diana en el ADN genómico

Este video muestra un ensayo in vivo en bacterias para estudiar la interacción de las proteínas de unión al ARN (RBP) con el ARN. Las células bacterianas se transforman con dos construcciones de plásmidos: un plásmido de sitio de unión que codifica un ARNm que contiene un gen indicador fluorescente aguas abajo de un sitio de unión RBP, mientras que un plásmido RBP expresa las proteínas RBP bajo el control de un inductor. Tras el aumento mediado por inductores en la producción de RBP, los RBP se...

Ensayo de represión de genes reporteros para estudiar la regulación traslacional de un gen diana

Este video muestra un método para detectar las cepas de cianobacterias en una muestra ambiental utilizando un chip de microarray de anticuerpos. Las muestras portadoras de varias bacterias interactúan con los anticuerpos impresos, y la inmunotinción con anticuerpos anticianobacterianos marcados con fluoróforos revela la presencia de cepas específicas de cianobacterias a través de la fluorescencia en distintos puntos.

Una técnica para detectar cepas de cianobacterias utilizando un chip de micromatriz de anticuerpos

Hemos desarrollado una plataforma microfluídica para la prueba rápida de la susceptibilidad a los antibióticos. El líquido se pasa a altas velocidades sobre las bacterias inmovilizadas en el fondo de un canal microfluídico. En presencia de estrés y antibióticos, las cepas susceptibles de bacterias mueren rápidamente. Sin embargo, las bacterias resistentes pueden sobrevivir a estas condiciones estresantes.

Pruebas de susceptibilidad a antibióticos inducidas por el estrés en un chip

Se describe en este documento un ensayo mediante el acoplamiento de identificación de ADN metiltransferasa adenina (DamID) a alto rendimiento de secuenciación (DamID-ss). Este método mejorado proporciona una mayor resolución y un rango dinámico más amplio, y permite el análisis de datos DamID-Seq en conjunción con otros datos de secuenciación de alto rendimiento tales como chip-ss, RNA-Seq, etc.

-DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de próxima generación (ChIP-seq) es un método utilizado para establecer interacciones entre los factores de transcripción y las secuencias genómicas que controlan. Este protocolo describe técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, utilizando Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bacteriano como ejemplo.

Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq)

El ensayo Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) se puede utilizar para identificar pequeñas proteínas de unión a ligandos de un organismo mediante el uso de una biblioteca ORFeome.

Identificación de las proteínas de unión de pequeños ligandos con la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos (DRaCALA)

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

Aprende el método DAP-chip para identificar sitios de unión genómicos de reguladores de respuesta bacterianos mediante purificación de afinidad y microarrays. Esta técnica permite estudiar redes regulatorias sin conocer señales activadoras previas.

Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes (Video) | JoVE Journal

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