Name: Un microarray de tejido de nueva generación (ngTMA) Protocolo de Estudios de biomarcadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende a construir microarrays de tejido de nueva generación para investigación de biomarcadores mediante patología digital y automatización. Este protocolo mejora la precisión histológica y optimiza el flujo de trabajo en análisis de tejidos.

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Los autores desean agradecer al personal técnico de la Unidad de Investigación Traslacional; María Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni y el Equipo de Informática en el Instituto de Patología de la Universidad de Berna.

NOTA: Este estudio ha sido aprobado por el comité de ética local del Hospital Insel, Berna, Suiza (07/10/13). Los tejidos se obtuvieron del Banco de Tumores Berna, Instituto de Patología de la Universidad de Berna. 1. Planificación y Diseño (Consulting) <ol><li> Piense acerca de la pregunta de investigación que hay que contestar. Decidir sobre los tipos de tejidos que se incluirán en el proyecto. Determine qué estructuras histológicas son importantes para responder a la pregunta. </li><li> Determinar el diámetro del núcleo más útil y el número de núcleos por paciente para el proyecto. Decidir sobre el número de copias del tejido de nueva generación Micro matriz (ngTMA) sobre la base de la cantidad de biomarcadores para ser investigado. </li><li> Considere los aspectos estadísticos, como el tamaño de la muestra y el análisis después de que se construyó el microarray tisular (TMA). Determinar el número de pacientes para su inclusión en el estudio y establecer tejidos de control para la matriz. </li><li> Recuperar el histológico (odiagnóstico) Hematoxilina y Eosina (H &amp; E) diapositivas de cada paciente. Repase brevemente las diapositivas e identificar las que contienen la información y la histología relevante para el proyecto. NOTA: Asegúrese de nuevas secciones de los bloques de parafina, si se desea una tinción especial o diapositiva inmunohistoquímica para el escaneo de diapositivas y anotación, en lugar de H &amp; E diapositivas </li></ol> Escaneo 2. Slide <ol><li> Encienda el PC y el escáner de diapositivas y software de exploración abierta. Seleccione &quot;modo automático&quot; para la exploración de campo claro de la pantalla de vista previa. </li><li> Haga clic en &quot;opciones de análisis&quot; para ajustar los parámetros de calidad de diapositivas. En este momento, seleccione si las diapositivas son a escanear directamente a la plataforma digital accesible en Internet, oa una unidad local (o disco duro externo) y establecen los tipos de análisis y el número de puntos de enfoque. </li><li> Haga clic en &quot;Parámetros del servidor&quot; para escanear al &quot;centro del caso&quot;. En este paso, añadir más revistas, etiquetar todas las diapositivas y establecerla carpeta en la sentencia de Centro, donde se deben guardar las diapositivas. Cada revista contiene hasta 25 diapositivas. </li><li> Compruebe la calidad / limpieza de placas histológicas reales para la exploración. Si es necesario, diapositivas limpias con etanol al 70%. </li><li> Cargue un máximo de 25 diapositivas por la revista con las etiquetas apuntando hacia adentro (Figura 3) </li><li> Coloque el cargador en el escáner. Por más de una revista, colocarlos en la parte superior de uno al otro. </li><li> Inicie la exploración de diapositivas haciendo clic en la flecha verde (Figura 3B). Cuando se escanean todas las diapositivas, descargar las revistas, y apague el escáner programa, PC y diapositivas. </li></ol> 3. Deslice digital Anotación <ol><li> Introduzca la dirección del navegador para el centro de gestión de diapositivas digitales y descargar el software gratuito visor de diapositivas digital. </li><li> Abra el software de visualización de diapositivas digitales y seleccione la carpeta que contiene las diapositivas digitales (Figura 4A). </li><li> Añadir notas, reordenar y gestionar la digital carpeta de diapositivas o asignar derechos de usuario a los colegas o agregar datos adjuntos a la carpeta. </li><li> Haga clic en la diapositiva digital deseado que aparece en el visor de diapositivas digital. </li><li> Uso de la herramienta de ampliación, evaluar la diapositiva y encontrar las áreas de interés para la integración en la ngTMA. </li><li> Uso de la &#39;herramienta de anotación TMA&#39;, seleccione el tamaño de la base deseada y el color de la anotación. Coloque la anotación en la preparación digital haciendo clic sobre ella (Figura 4B). </li><li> Mueva la anotación a las estructuras histológicas deseadas para su incorporación en el ngTMA (Figura 4C). </li><li> Repita este proceso de anotación de nuevo utilizando la herramienta de anotación, la selección de un tamaño de núcleo y un color de anotación deseada. Repetir la visualización de diapositivas y anotación en todas las diapositivas de la carpeta. </li><li> Como alternativa, coloque núcleos de tejido para PCR en tubos de 0,2 ml en lugar de la integración en el TMA. Anotar diapositivas utilizando un color diferente para identificarestos puntos para su posterior análisis molecular. </li><li> Crear una lista de todos los casos con sus correspondientes anotaciones y colores. </li></ol> 4. Tissue Microarray construcción <ol><li> Recuperar los correspondientes bloques de tejido de parafina para todas las diapositivas digitales anotadas, bloques Clasificar en el orden deseado para microarraying tejido. </li><li> Asegúrese de que los bloques de tejido tienen un mínimo de 4 mm de espesor. Si no, reembedding de tejido es necesaria. </li><li> Apague la PC &quot;ON&quot; y el instrumento microarrayer tejido automatizado. Abra el software microarrayer tejido y proporcionar un nombre al proyecto </li><li> Realizar un &quot;cambio de herramienta&quot; y seleccionar el diámetro de la herramienta necesaria para el proyecto (es decir, 0.6, 1.0, 1.5, o 2.0 mm). </li><li> Cargue un máximo de 12 &#39;destinatario&#39; bloques de TMA en la máquina. Dé un ID para cada uno de los 12 bloques </li><li> Crear un diseño de TMA para cada bloque receptor. Observar un diseño TMA con el número de filas, columnas y adelantarserectas y así como la distancia entre los núcleos. Crear un nuevo diseño para cada bloque receptor o utilizar el mismo diseño en varias ocasiones. </li><li> Coloque el cursor en el diseño de bloque receptor a dar el primer núcleo. </li><li> A continuación, cargar hasta 60 bloques donantes en el microarrayer tejido (Figura 5A). Coloque diez bloques en cada fila de A a F. Dé a cada bloque una identificación de donantes. Observar las imágenes de cada bloque de donantes en la pantalla del ordenador adquirido automáticamente por el microarrayer tejido. </li><li> Comenzando con el primer bloque, haga clic en &quot;Diapositiva&quot;. Observar la preparación digital anotada almacenado en el centro de gestión de diapositivas digitales (o en la unidad externa) usando el visor de diapositivas digital. Ver la imagen del bloque donante y el lado al lado de la diapositiva digital. </li><li> Seleccione los puntos de referencia en la imagen de bloque para superponer la imagen de bloque de donante con la preparación digital </li><li> Después de hacer clic en &quot;Siguiente&quot;, observar las anotaciones en una imagen más grande de la cuadra. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Haga clic en la parte superior de las anotaciones para confirmar y haga clic en &quot;Inicio&quot;. NOTA: Esta pregunta al microarrayer tejido para comenzar a perforar un agujero de 0,6 mm de diámetro en el bloque receptor en el punto de partida seleccionado. Luego, en un segundo paso, utilizando la herramienta de perforación, el instrumento golpea agujero en el tejido del bloque donante seleccionado en la región anotado y confirmado exacta. Los núcleos se transfieren desde el donante hasta el bloque receptor. </li><li> Después de aproximadamente 500 núcleos, limpiar la herramienta de perforación y perforación utilizando un hisopo de xileno. </li><li> Si se desean núcleos de tejido (en lugar de golpes en un ngTMA), haga clic en la herramienta &quot;PCR&quot; para el bloque, confirmar hasta 4 anotaciones y pulsa &quot;Inicio&quot;. Esto perforar y transferir los núcleos en un tubo de 0,2 ml. </li><li> Repita punto 4.9 a 4.11 con el segundo bloque de donantes, y así sucesivamente. </li><li> Después de usar todos los bloques donantes, introduzca una segunda ronda de bloques donantes (61-120) en el microarray de tejidoer y seguir los pasos 4.8 a 4.11. </li><li> Actualizar donantes y destinatarios bloqueados imágenes mientras que el avance del proyecto durante la perforación y la perforación se está produciendo (Figura 5C). </li><li> Realizar un &quot;Exportar&quot; después de que el proyecto esté terminado. Busque el archivo .xslx con los ID de los donantes y de bloque receptor, la localización de todos los golpes dentro de la TMA, así como el diseño TMA / diseño, en la carpeta exportada. Guardar todas las imágenes de bloques de donantes con toda anotación superpuesta como imágenes jpg en la carpeta exportada (Figura 5D). El bloque final TMA es entonces listo. </li></ol>

<ol><li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li>
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</ol>

Los autores no tienen divulgaciones

En este trabajo, un protocolo para ngTMA se perfila. ngTMA es un concepto de reciente creación para microarraying tejido que comprende la planificación y el diseño, la patología digital y anotación de diapositivas, así como automatizado microarraying tejido 12. En comparación con microarraying tejido convencional, ngTMA ofrece muchas ventajas. En una primera fase, la fase de planificación y diseño es fundamental. La atención se centra en responder a una pregunta de investigación específica. Esto debe tomar en consideración las cuestiones histológicas (por ejemplo, que las regiones y el número de puntos es lo que quiero para incluir?), La planificación estadística (por ejemplo, tamaño de la muestra? ¿Cómo analizo mis muestras más tarde?) Y las consideraciones logísticas (por ejemplo, cómo muchos biomarcadores y, por tanto, el número de copias ngTMA?). A ngTMA específica se da con necesidades específicas, ya sea para la detección de biomarcadores y de alto rendimiento o la intención de estudiar los aspectos histológicos específicos en sólo unos pocos cas bien seleccionadaes. Uno, si no el más importante desventaja de microarraying tejido convencional es la baja precisión con la que se hacen marcas en los cortes histológicos. El estudio de las estructuras histológicas, células o regiones específicas se hace casi imposible. ngTMA permite una alta exactitud porque las anotaciones se colocan directamente en las diapositivas digitales. Esto permite que el investigador para seleccionar precisamente las regiones a punzonar, incluyendo las células específicas. En este ejemplo, varias áreas dentro del mismo bloque de tejido se troquelan para poner en orden, tales como el centro del tumor, el frente de invasión y áreas de interacción de tumor / estroma de relieve por la presencia de grupos de células tumorales pequeñas o incluso células individuales. Esta precisión sólo puede lograrse utilizando ngTMA. En tercer lugar, porque las diapositivas se escanean en una plataforma digital basada en la web, deslice la visualización y anotación puede hacerse a través de la computadora en lugar de con el microscopio. El software arraying tejido proporciona un fácil de usarinterfaz con un alto grado de flexibilidad, por lo tanto, diferentes diseños y diseño ngTMA se puede lograr. Desde la construcción TMA se realiza automáticamente por la perforación, hay poca necesidad de se reduce significativamente con manos de maniobra y la cantidad de tiempo para la construcción. El tiempo para la construcción TMA en este ejemplo aquí es entre 24 hr. El uso de un enfoque convencional TMA y la estimación de 15 golpes por hora, este proyecto tomaría aproximadamente 304 horas. ngTMA se puede aplicar para estudiar la expresión de proteína, ARNm o ADN, así como combinaciones de éstos. Figura 9 ilustra varias de estas aplicaciones a biomarcadores potenciales. Inmunohistoquímica estándar se puede aplicar para determinar el índice de proliferación de cánceres utilizando Ki-67. Un enfoque combinado para investigar la expresión de proteínas y la amplificación de ADN para los genes tales como HER2 puede ser utilizado. Los tejidos pueden ser reunidas en un solo ngTMA para reducir los costos, el uso de tejidos y otros recursoss. Además, el ARNm cromogénico hibridación in situ para HER2 y otros genes se puede realizar para identificar las transcripciones de ARNm individuales en un gran número de casos utilizando un número mínimo de diapositivas de tejidos. La inmunohistoquímica de los marcadores inmunes tales como CD8 puede ser visualizado en el contexto del microambiente del tumor. Doble inmunohistoquímica también se puede utilizar para resaltar regiones particulares de interés tales como las interacciones entre las células inmunes (marcados en rojo) y células tumorales (marcados en marrón) en el frente de invasión de los cánceres. Tal región de interés no podría haber sido capturado utilizando microarraying tejido convencional. No obstante, este protocolo contiene algunas limitaciones. El reto más importante es el solapamiento entre el bloque de los donantes y de diapositivas digitales. Hay varios factores que pueden influir en este paso. En primer lugar, la última sección del bloque se debe utilizar para el escaneado de diapositivas. En muchos casos, la H &amp; E no es la última sección del bloque donante, Rather es una tinción inmunohistoquímica u otro. En este caso, también un portaobjetos teñido puede ser utilizado siempre y cuando la última mancha se escanea y anotado o debe hacerse una nueva H &amp; E. También se debe tener cuidado cuando se hacen cortes de tejido como los tejidos pueden expandirse en el baño de agua que conduce a juego desafiante de diapositivas y el bloque. En segundo lugar, en este momento los proyectos se limitan a 12 receptores TMA bloques procesados ​​en una sola vez. Los proyectos más grandes de más de 12 TMA deben asignarse a un segundo nombre del proyecto. En tercer lugar, los bloques donantes deben hacerse usando moldes estándar y casetes como el instrumento no puede ajustarse a diferentes tamaños. Por último, los bloques donantes deben superar la altura mínima (4 mm) para lograr la perforación óptima. En algunos casos, esto requiere reembedding de los tejidos. Cientos de publicaciones en los últimos años ponen de manifiesto la TMA como una valiosa herramienta para la investigación de biomarcadores. TMA se han utilizado para estudiar pulmonar 13, colorrectal 7, breast 14, 15 de próstata, páncreas 16, la vejiga 17, y 18 cánceres gástricos, para nombrar unos pocos. Un creciente número de autores han combinado el uso de TMA con el análisis de imágenes y pasos importantes se están haciendo en esta dirección 19-21. Sin embargo, junto a un puñado de grupos de investigación que han publicado las ideas innovadoras TMA 22-24, se ha prestado poca atención a la optimización de la técnica de TMA en sí. Microarrayers tejido automatizados, como el ATA-27 por Estigen / Beecher proporcionan esquema de trazado y conveniente y automatizado de perforación del tejido. Sin embargo, esto representa sólo 1 aspecto del concepto ngTMA. ngTMA es una mejora sustancial respecto a las técnicas convencionales microarraying tejido. Incorpora experiencia en la histología y el diseño TMA con la flexibilidad de la patología digital y la precisión de las anotaciones digitales con la velocidad y la fiabilidad de la construcción automatizada de TMA. La combinación de ngTMA y análisis de imágenes para la evaluación de proteínas y biomarcadores moleculares será una herramienta poderosa para mejorar aún más la calidad de la investigación clínica y traslacional en el futuro.

En las últimas dos décadas, microarrays de tejidos (TMA) han tenido un impacto notable en los estudios de investigación de biomarcadores. TMA son esencialmente de tejido &quot;archivos&quot; producidas por la transferencia repetida de pequeñas cuñas de tejido, por lo general varían en tamaño desde 0,6 hasta 2,0 mm de diámetro, desde embebidos en parafina bloques &quot;donantes&quot; en un solo bloque TMA &#39;receptor&#39; (Figura 1) 1. Con un pequeño tamaño del núcleo, aproximadamente 500 diferentes puntos de tejido de pocos o muchos pacientes diferentes pueden ser dispuestos en una TMA 2. El uso de la TMA para estudios de biomarcadores pronósticos o predictivos tiene muchas ventajas. Considere el ejemplo donde la expresión de un biomarcador de proteína por inmunohistoquímica se va a evaluar en 450 pacientes. En lugar de realizar 450 tinciones inmunohistoquímicas en 450 diapositivas paciente seccionadas desde el mismo número de bloques, pequeños núcleos de cada muestra pueden ser dispuestas en una sola TBloque MA. Aunque varios núcleos se toman de cada paciente, se produjo un número mínimo de bloques. Esto tiene el efecto considerable de disminuir drásticamente los costos y otros recursos, así como la reducción de pérdida de tejido. Además esto permite estudios powered apropiadamente utilizando un gran número de tejidos a ser evaluadas bajo las mismas condiciones experimentales. TMA tiene muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo, pueden ser utilizados para estudiar la morfología, expresión de proteínas, expresión de ARN y las aberraciones de ADN después de la tinción con colorantes diferentes, o después de inmunohistoquímica o cromogénico e incluso hibridación in situ fluorescente 3-7. Estudios recientes también han utilizado las TMA para probar la variación intra e interlaboratorios en los protocolos de tinción, establecer la especificidad o sensibilidad de los anticuerpos para las mutaciones de genes específicos, y para determinar la reproducibilidad entre observadores de la expresión de proteínas en las colaboraciones internacionales <sup&gt; 8-11. La construcción del tradicional TMA utilizando tejidos derivados del paciente es un largo proceso de múltiples fases (Figura 2). Se inicia con la búsqueda de posibles casos apropiados y selección de diapositivas de diagnóstico de los archivos en un instituto de patología, u otro instituto, desde donde se recuperan. El patólogo evalúa cada diapositiva por caso y selecciona la diapositiva más representativo para los propósitos del estudio. A continuación, la región de interés se marca con un lápiz directamente bajo el microscopio. Esto es a menudo difícil e imprecisa y da como resultado sólo en una &quot;estimación&quot; de dónde golpes de tejidos deben tomarse de. A continuación, los bloques de parafina correspondientes a estas diapositivas marcadas se recuperan del archivo. Se hace una comparación rápida entre el bloque y el tobogán. El uso de un arrayer semi-automatizado o tejido hecho en casa, el bloque donante se troquela en la región estimada de interés y se transfirió a un bloque de TMA destinatario. Construcción de TMA utilizando esta técnica de agrupación es un trabajo intensivo, consume tiempo, impreciso y poco flexible. Preparación de una TMA de 475 puntos en 3 copias se estima para tomar cerca de 84 horas de trabajo. Un nuevo enfoque para la construcción de las TMA fue presentado recientemente por el Instituto de Patología de la Universidad de Berna que se basa en tres componentes: la planificación y el diseño (o asesoría), la patología digital combinada con la experiencia en la histología y automatizado TMA arraying 12. En conjunto, este concepto se llama Tissue próxima generación de microarrays (ngTMA). A continuación, un protocolo para ngTMA se describe sobre la base de un ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Aquí, los tumores primarios, así como metástasis en los ganglios linfáticos y las metástasis hepáticas son que se vista en ngTMAs para el análisis de biomarcadores posterior. Además, los pequeños núcleos de tejido de cada paciente se desean para el futuro de la extracción de ácidos nucleicos.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Escáner de diapositivas</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Microarrayer de tejidos</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>software gratuito</td><td>de visualización de diapositivas</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Plataforma digital de diapositivas</td></tr></tbody></table>

un microarray de tejido de nueva generación (ngtma) protocolo de estudios de biomarcadores

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

La investigación de biomarcadores se basa en microarrays de tejidos (TMA). TMA se producen por transferencia repetida de pequeños núcleos de tejido de un bloque &quot;donante&quot; en un bloque de &quot;receptor&quot; y luego se usa para una variedad de aplicaciones de biomarcadores. La construcción de TMA convencional es de mano de obra, impreciso y requiere mucho tiempo. Aquí, un protocolo utilizando microarrays de tejidos de última generación (ngTMA) se resume. ngTMA se basa en la planificación y diseño de TMA, la patología digital, y microarraying tejido automatizado. El protocolo se ilustra utilizando un ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Se consideran aspectos histológicos, estadísticos y logísticos, como el tipo de tejido, las regiones histológicas específicas, y tipos de células para su inclusión en el TMA, el número de manchas de tejidos, tamaño de la muestra, el análisis estadístico, y el número de copias de TMA. El estudio histológico de cada paciente son escaneados y subidos a una plataforma digital basada en la web. Allí, ellos son vistos y annotated (marcado) utilizando una herramienta de diámetro 0,6-2,0 mm, varias veces utilizando diferentes colores para distinguir las áreas de tejido. Bloques donantes y 12 bloques &#39;receptores&#39; se cargan en el instrumento. Diapositivas digitales se recuperan y adaptan a las imágenes de bloque donante. Arraying repetido de regiones anotadas es automática, consiguiéndose en un ngTMA. En este ejemplo, se han previsto seis ngTMAs que contiene seis diferentes tipos de tejidos / zonas histológicas. Dos copias de los ngTMAs se desean. De tres a cuatro diapositivas para cada paciente son escaneados; 3 ejecuta el análisis son necesarios y realizado durante la noche. Todas las diapositivas son anotados; se utilizan diferentes colores para representar los diferentes tejidos / zonas, a saber, el centro del tumor, frente a la invasión, tumor / estroma, metástasis ganglionares, metástasis hepáticas, y el tejido normal. 17 anotaciones / caso se hacen; tiempo para la anotación es de 2-3 min / caja. 12 ngTMAs se producen contiene 4.556 puntos. Tiempo Arraying es de 15-20 horas. Debido a su precisión, flexibilidad y velocidad, ngTMA es un potenteherramienta para mejorar aún más la calidad de las TMA utiliza en la investigación clínica y traslacional.

Planificación y Diseño Aquí se utilizó el ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico que están siendo investigados por una serie particular de biomarcadores. No sólo está previsto un ngTMA para estos pacientes, pero la extracción de ADN seguido por el análisis mutacional para algún gen especificado. Durante la fase de planificación y diseño de ngTMA, se han decidido los siguientes aspectos. De cada paciente, se investigarán 6 regiones histológicas diferentes: el centro del tumor, frente a la invasión tumoral, áreas de tumor más densa en ciernes (tumor / interacción estroma), el tejido normal, metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis hepáticas. Tres puntos tumorales por área de tejido tumoral y dos manchas de tejido normal se van a incluir en el proyecto (n = 17 puntos por paciente). Dado que se prevé que más de 50 biomarcadores ser investigadas en este material del paciente, se desean dos copias de la ngTMA final. Debido a la posible pequeño tamaño de los ganglios linfáticos y distant metástasis, se elige un pequeño diámetro de núcleo de 0,6 mm para la construcción TMA para todos los tejidos. Además, está previsto que cada región se vistió por separado, de manera que se producirán 6 ngTMAs contienen diferentes zonas histológicas: un ngTMA contiene tejidos del centro del tumor a), b) frente de invasión, zonas c) del tumor en ciernes, d) el tejido normal , e) metástasis en los ganglios linfáticos, y f) las metástasis hepáticas. Para el diseño TMA utilizando una herramienta de 0,6 mm, se seleccionará una distancia cómoda de 0,4 mm entre golpes. Debido a que la evaluación de los puntos de tejido en filas y columnas largas suele ser tedioso, se seleccionaron dos diseños diferentes. Para los bloques tumorales con 3 golpes por área de tejido, se crea un diseño que contiene seis partes. Esto conduce a un número total de 402 golpes de tejido. Para golpes normales de tejido, 2 golpes por caso se van a incluir. Se elige un diseño de montaje 432 golpes en total. Además, para cada caso, hasta 4núcleos a 0,6 mm serán, además, se perforaron y se colocaron en tubos de 0,2 ml. También se anotan Estos núcleos de tejido. En resumen, se producirán 6 ngTMAs de diferentes tejidos (5 matrices tumorales x 3 golpes x 134 pacientes; 1 matriz de tejido normal x 2 punzones x 134 pacientes), además de 4 núcleos por paciente para los tubos. En conjunto, se harán 2.814 anotaciones. A continuación, las correspondientes diapositivas H &amp; E de los pacientes seleccionados se recuperan del archivo de diapositivas. Cada caso es revisado brevemente por un patólogo y se seleccionan la mayoría de las diapositivas representativas de cada tipo de tejido. Escaneo Diapositivas digitales de cada corte histológico se hacen para la anotación del futuro. Para este estudio, 3-4 diapositivas de tejidos han de ser escaneados por caso, es decir, el cáncer colorrectal primario, con o sin los tejidos normales adyacentes, metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis hepáticas y, posiblemente, una estafa carro adicionalque contiene mucosa normal. Hasta 10 revistas diferentes pueden ser totalmente cargado en el escáner de diapositivas; por lo tanto, 250 diapositivas se pueden escanear en una sola pasada. Tiempo para la digitalización y el tamaño de diapositivas digitales varía con las dimensiones del tejido y el factor de calidad deseado. Los rangos de los factores de calidad de 0 a 100 Aquí, se selecciona un factor de calidad de 60, ya que produce un tamaño de archivo más pequeño de exploración sin ninguna pérdida notable de calidad de escaneo. Biopsias pequeñas pueden ser escaneados en menos de 30 segundos, mientras que las secciones de tejido conjunto, como las que se utilizan en este ejemplo puede tardar entre 2 y 10 min. Tamaño de diapositiva digital también puede variar de 2 MB a 2 GB. El uso de un factor de calidad de 60, analiza entre 600 MB y 1 GB se producen. Se requieren entre 402 y 536 diapositivas para este proyecto un total de 3 carreras de escaneo. Cada ejecución se lleva a cabo durante la noche. Aproximadamente se necesita 500 GB de espacio de almacenamiento. Las diapositivas se escanean directamente sobre una plataforma digital llamado Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center es accesible desde cualquier lugar con acceso a la web introduciendo el nombre de usuario y la contraseña designada. Anotación Para anotación, dos aspectos deben ser considerados: 1) diferentes áreas de tejido se debe dar diferentes colores de anotación y 2) el número de anotaciones deben reflejar el número de copias deseadas de la final ngTMA. En este caso, se han seleccionado 3 puntos por cada área del tumor para un solo ejemplar. Para 2 copias, cada región debe ser anotado utilizando 6 puntos. Útil son verdes para el tejido normal, azul para el centro del tumor, amarillo para el frente de invasión tumoral, rojo para las áreas de tumor en ciernes (tumor / estroma) interacción, negro de metástasis en los ganglios linfáticos, turquesa para metástasis a distancia y finalmente blanco para que las regiones sean utilizado para tubos. Anotación de cada caso requiere 2-3 min. ngTMA Construcción Este estudio requiere 6 ngTMA bloques to construirse en 2 copias, lo que resulta en 12 bloques finales. El número máximo de bloques de receptores que puede ser apoyado por el arrayer es 12. Cada bloque tumor contendrá 402 puntos de tejido y cada bloque de tejido normal contiene 268 puntos, por un total de 4.556 puntos en todo el proyecto entero. Se crea un diseño TMA para cada bloque receptor y el proyecto se guarda (Figuras 6A, 6B). 60 bloques de tejido se pueden cargar en el tejido microarrayer en paralelo; se toma una imagen de cada bloque donante. Comenzando con el primer bloque de donantes, las correspondientes diapositivas digitales anotada se recupera de Case Center. Juego de diapositivas se realiza, lo que puede tardar entre 1-3 min. Las anotaciones se confirmaron y el arrayer se le solicitará que inicie la perforación (Figura 7). Punzonado y tiempo de transferencia del núcleo es de aproximadamente 12 segundos. Pérdida de núcleos durante este procedimiento es mínimo. Tiempo total para poner en orden este proyecto es de aproximadamente 24 horas, incluyendo el tiempo para slide / correspondencia de bloques y carga del instrumento. Algunos ejemplos de ngTMA se ilustran en la Figura 8A. Núcleos para posterior análisis molecular también pueden ser perforados en este tiempo (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 A) Un bloque de "donante". Núcleos del bloque donante se perforaron y se transfieren a B) un bloque receptor o microarray tisular (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 El flujo de trabajo convencional de microarrays de tejidos. A) el estudio histológico se recuperan del archivo y B) dado que el patólogo f u opinión. CD) Las anotaciones se hicieron en las diapositivas que indican la región 'estimado' para la transferencia. E) Los bloques de tejido correspondientes se recuperan. F) Bloquear y diapositiva se comparan para la coincidencia, que pueden G) a veces ser una tarea difícil. HJ ) microarraying Tissue entonces se lleva a cabo. K) Núcleos son transferidos en varias ocasiones y L) un TMA definitiva se construye. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3 A) Hasta 25 diapositivas se puede colocar en cada revista para la exploración. B) Ajustes para el factor de calidad y tamaño se puede hacer. Progreso de la exploración se puede controlar. "Src =" / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/&gt; Figura 4 A) escaneada diapositivas se pueden subir a la plataforma basada en la web, la sentencia de Centro. B) diapositivas digitales se puede ver. La herramienta de anotación TMA permite al usuario seleccionar el tamaño del núcleo y color necesarios para la anotación. C) Las anotaciones se pueden colocar directamente en la diapositiva digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500"> Figura 5 A) Hasta 60 bloques se puede cargar en el microarrayer tejido, es decir, 10 bloques de donantes por fila y 12 receptores bloques así B) Una imagen de cada bloque donante. Consta a la digitase recupera l de diapositivas. Coincidencia de bloque y de diapositivas se realiza y las anotaciones se utilizan para la perforación de bloque. C) El progreso de la arraying se puede monitorizar mientras el instrumento es la perforación. D) Una vez realizada la perforación, una exportación de la ubicación de cada punto en el diseño, pero También se hace una imagen de cada bloque de donantes con las anotaciones correspondientes. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500"> Figura 6. Estos diseños TMA fueron utilizados para poner en orden los bloques A) y B) de tumores de tejidos normales. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500"> Figura 7. Captura de pantalla del software microarrayer tejido. A la izquierda, 12 reincipiente bloques se pueden colocar en el instrumento. En la parte inferior, se toman imágenes de cada bloque donante. En el centro, el diseño de TMA, el progreso de la perforación, así como imágenes ampliadas de cada bloque donante con anotaciones se encuentra. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500"> Figura 8 A) Algunos ejemplos de nueva creación ngTMA bloques. B) golpes adicionales de tejido se pueden tomar para el análisis molecular posterior. Estos núcleos se troquelan y se colocaron en tubos de 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600"> Figura 9. Ejemplos de aplicaciones de biomarcadores ngTMA. Tinción A) La inmunohistoquímica de Ki67 en el cáncer colorrectal. Dual HER2 inmunohistoquímica / in situ ensayo de hibridación que muestra B) baja expresión de la proteína (marrón) y sin la amplificación del gen Her2 (negro) con relación al centrómero (rojo); C) alta expresión de la proteína (marrón) y amplificación del gen HER2 ( negro) con relación al centrómero (rojo). D) cromogénico hibridación in situ de Her2 que muestra los transcritos de ARNm individuales en cáncer de mama ngTMA. E) Inmunohistoquímica para CD8 en el cáncer colorrectal. F) tinción inmunohistoquímica doble para marcador pan-citoqueratina AE1 / AE3 (marrón; las células tumorales) y CD68 (rojo;. Macrófagos) destacando microambiente tumoral en el cáncer colorrectal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El protocolo tiene como objetivo la optimización de la construcción y la calidad de los microarrays de tejidos para la investigación de biomarcadores. Incluye aspectos de la planificación y el diseño, la patología digital, la anotación de la diapositiva virtual, y arraying tejido automatizado.

Un microarray de tejido de nueva generación (ngTMA) Protocolo de Estudios de biomarcadores

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

El objetivo del siguiente procedimiento es construir microarrays de tejidos óptimos o dirigidos para su posterior uso en la investigación de biomarcadores. En primer lugar, se genera un archivo digital de portaobjetos a partir de portaobjetos de tejido representativos. Las áreas histológicas de interés se anotan en los portaobjetos digitales para especificar las regiones exactas de los bloques donantes correspondientes que se transferirán al bloque de microrrayos tisulares.Una vez creados el diseño y los diseños de los microarrays de tejido, los bloques donantes se perforan automáticamente y la causa se carga en los microarrays de tejido. Con este enfoque preciso, rápido y automatizado de próxima generación, se pueden capturar con precisión áreas histológicas precisas o incluso grupos particulares de células y transferirlas a un microarray de tejidos. La principal ventaja de nuestra técnica frente a los métodos existentes de micro anillo tisular, como el uso de un dispositivo casero o semiautomatizado, es claramente la precisión histológica.Esto se logra mediante la combinación de las fortalezas de la patología digital con la experiencia histológica y también el microanillo de tejido automatizado que demuestra el procedimiento hoy en día son Kalin Hamman y José Galván. Dos asistencias técnicas de nuestro laboratorio Utilizando el software de escaneo. En primer lugar, seleccione el modo automático para el escaneo de campo claro.A continuación, haga clic en las opciones de escaneo para ajustar los parámetros de calidad de la diapositiva. Ahora elija guardar los escaneos de diapositivas localmente o en el final web haciendo clic en los parámetros del servidor y establezca el destino del escaneo en el centro de la caja. Ahora, prepare las diapositivas antes de cargarlas en el cargador Para el escáner, verifique que las diapositivas estén limpias.Si es necesario, límpielos Con etanol, se pueden cargar hasta 25 portaobjetos en cada cargador y el escáner se puede cargar con hasta 10 cargadores. Se apilan varios cargadores cuando se cargan. Una vez que se carguen las diapositivas, proporcione todas las diapositivas, los nombres de los archivos y configure la carpeta de guardado en el centro de cajas.Ahora comience a escanear la diapositiva haciendo clic en la flecha verde. En esta sección, las ubicaciones desde las que se perforan las muestras de tejido en el portaobjetos se establecen mediante anotaciones en el portaobjetos digital. Comience abriendo la carpeta de diapositivas digitales.En el software de visualización, se pueden realizar cambios en la propia carpeta. Se pueden agregar notas, las diapositivas se pueden reordenar y los privilegios de usuario se pueden establecer, al igual que los archivos adjuntos. Ahora comience a anotar las diapositivas haciendo clic en una.Aparecerá en el visor. En el visor. Utilice la herramienta de aumento para evaluar la guía y encontrar las áreas de interés para su integración en la TMA de próxima generación.Con la herramienta de anotación TMA, seleccione el tamaño del núcleo deseado y el color de la anotación. Adjunte esta anotación a una diapositiva haciendo clic en la diapositiva. A continuación, mueva la anotación a las estructuras histológicas deseadas.Estas anotaciones marcan las ubicaciones de los punzones en el bloque de tejido correspondiente. Repita este proceso hasta que todas las diapositivas estén anotadas. Una opción alternativa para la causa tisular es enviarlos a un tubo de PCR de 0,2 mililitros para su análisis molecular.Anote las diapositivas usando una marca de color diferente para distinguir estos puntos de los que son el TMA. Una vez hechas todas las anotaciones, guarde un archivo de hoja de cálculo que contenga una lista de todas las diapositivas con sus anotaciones correspondientes y los colores de las anotaciones. Comience la microreconstrucción del tejido recuperando los bloques de tejido de parafina correspondientes para todos los portaobjetos digitales anotados, a partir de entonces.Se denominan bloques de donantes. Ordena los bloques en el mismo orden que las diapositivas digitales. Comprueba que cada bloque tenga al menos cuatro milímetros de grosor.De lo contrario, el tejido tendrá que reinventarse en la computadora. Abra el software de micromatriz de tejidos y proporcione un nombre para el proyecto. Vaya al cambio de herramienta y seleccione el diámetro de herramienta requerido.Ahora cargue hasta 12 bloques de destinatarios en la máquina. Toma nota de los nombres de los bloques. Todos deben estar etiquetados utilizando el mismo sistema de numeración para mantener la coherencia.Luego, en el software, asigne el nombre apropiado a cada uno de los bloques para crear un diseño TMA. Primero, haga un nuevo diseño de TMA asignando el número de filas, columnas, líneas vacías y espaciado de los punzones. Guarde el diseño y asígnelo al bloque.A continuación, repita el proceso para el siguiente bloque. Con un nuevo diseño o el mismo diseño, los tamaños de los núcleos se pueden variar entre los bloques receptores. A continuación, cargue hasta 60 bloques donantes en la máquina.En cada fila caben hasta 10 bloques. De la A a la F. Los bloques donantes restantes se cargarán más adelante en el software. Asigne a cada bloque de donantes un nombre que lo identifique.Se adquirirá automáticamente una imagen de cada bloque. Ahora alinee las diapositivas digitales con sus correspondientes bloques donantes. Primero, seleccione un bloque.A continuación, haga clic en la diapositiva y compare las imágenes de la diapositiva y del bloque una al lado de la otra. Seleccione puntos de referencia en la imagen del bloque donante que correspondan a puntos específicos en la diapositiva digital correspondiente. A continuación, haga clic en siguiente y las anotaciones se trasladarán a la imagen del bloque donante.Si las anotaciones son correctas, haga clic en cada una para confirmar su ubicación. A continuación, haga clic en Inicio. Esto hace que el microarray perfore un agujero en el punto de referencia en el bloque receptor y, a continuación, perfore un agujero del bloque donante en la misma ubicación y transfiera el núcleo al bloque receptor.Para recolectar núcleos en un tubo de PCR, haga clic en la herramienta de PCR para el bloque. Se pueden utilizar hasta cuatro anotaciones para suministrar tejido al tubo. Una vez que estén configurados, haga clic en iniciar y se llamará al donante y se cargará el tubo.Después de que la máquina perfore y perfore los núcleos, actualice la imagen del bloque donante. Proceda a repetir la alineación y la anotación para el siguiente bloque. A continuación, cúscalo.Siga haciendo esto para todos y cada uno de los bloques de donantes. Eso será en el TMA. Cuando se complete el primer conjunto de 60 bloques donantes, descárguelos y cargue 60 bloques más.Continúe el proceso hasta que todos los bloques de donantes estén colocados. Después de tomar unos 500 núcleos, limpie el taladro y la herramienta de perforación se extinguirá rápidamente. Cuando se completen las matrices, exporte el proyecto.Un archivo de hoja de cálculo con los datos del proyecto estará en la carpeta de exportación. Muestra la ubicación de cada muestra dentro de cada bloque TMA. A continuación, guarde las imágenes del bloque donante con anotaciones superpuestas como archivos JPEG en la carpeta de exportación.Esto completa el proceso de generación del bloque TMA. Este diseño de TMA muestra seis bloques NG TMA que se construyeron en dos copias para 12 bloques finales para llenar la matriz. Cada bloque tumoral contenía 402 manchas de tejido y cada bloque de tejido normal contenía 268 manchas.Después de anotar 60 bloques de donantes, se perforó la causa. El tiempo de transferencia del núcleo fue de aproximadamente 12 segundos. La pérdida de núcleo fue mínima, y el tiempo total para una matriz, este proyecto fue en total de unas 24 horas.Esto incluyó el tiempo necesario para perforar la causa del análisis molecular posterior después del proceso de N-G-T-M-A. A estos microarrays de tejidos se les pueden aplicar otros métodos, como la inmunohistoquímica en la citohibridación e incluso tinciones especiales, con el fin de responder a algunas preguntas como qué genes o proteínas se expresan o incluso se alteran en los diferentes tejidos.

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