Un microarray de tejido de nueva generación (ngTMA) Protocolo de Estudios de biomarcadores
23 de septiembre de 2014
El protocolo tiene como objetivo la optimización de la construcción y la calidad de los microarrays de tejidos para la investigación de biomarcadores. Incluye aspectos de la planificación y el diseño, la patología digital, la anotación de la diapositiva virtual, y arraying tejido automatizado.
El objetivo del siguiente procedimiento es construir microarrays de tejidos óptimos o dirigidos para su posterior uso en la investigación de biomarcadores. En primer lugar, se genera un archivo digital de portaobjetos a partir de portaobjetos de tejido representativos. Las áreas histológicas de interés se anotan en los portaobjetos digitales para especificar las regiones exactas de los bloques donantes correspondientes que se transferirán al bloque de microrrayos tisulares.
Una vez creados el diseño y los diseños de los microarrays de tejido, los bloques donantes se perforan automáticamente y la causa se carga en los microarrays de tejido. Con este enfoque preciso, rápido y automatizado de próxima generación, se pueden capturar con precisión áreas histológicas precisas o incluso grupos particulares de células y transferirlas a un microarray de tejidos. La principal ventaja de nuestra técnica frente a los métodos existentes de micro anillo tisular, como el uso de un dispositivo casero o semiautomatizado, es claramente la precisión histológica.
Esto se logra mediante la combinación de las fortalezas de la patología digital con la experiencia histológica y también el microanillo de tejido automatizado que demuestra el procedimiento hoy en día son Kalin Hamman y José Galván. Dos asistencias técnicas de nuestro laboratorio Utilizando el software de escaneo. En primer lugar, seleccione el modo automático para el escaneo de campo claro.
A continuación, haga clic en las opciones de escaneo para ajustar los parámetros de calidad de la diapositiva. Ahora elija guardar los escaneos de diapositivas localmente o en el final web haciendo clic en los parámetros del servidor y establezca el destino del escaneo en el centro de la caja. Ahora, prepare las diapositivas antes de cargarlas en el cargador Para el escáner, verifique que las diapositivas estén limpias.
Si es necesario, límpielos Con etanol, se pueden cargar hasta 25 portaobjetos en cada cargador y el escáner se puede cargar con hasta 10 cargadores. Se apilan varios cargadores cuando se cargan. Una vez que se carguen las diapositivas, proporcione todas las diapositivas, los nombres de los archivos y configure la carpeta de guardado en el centro de cajas.
Ahora comience a escanear la diapositiva haciendo clic en la flecha verde. En esta sección, las ubicaciones desde las que se perforan las muestras de tejido en el portaobjetos se establecen mediante anotaciones en el portaobjetos digital. Comience abriendo la carpeta de diapositivas digitales.
En el software de visualización, se pueden realizar cambios en la propia carpeta. Se pueden agregar notas, las diapositivas se pueden reordenar y los privilegios de usuario se pueden establecer, al igual que los archivos adjuntos. Ahora comience a anotar las diapositivas haciendo clic en una.
Aparecerá en el visor. En el visor. Utilice la herramienta de aumento para evaluar la guía y encontrar las áreas de interés para su integración en la TMA de próxima generación.
Con la herramienta de anotación TMA, seleccione el tamaño del núcleo deseado y el color de la anotación. Adjunte esta anotación a una diapositiva haciendo clic en la diapositiva. A continuación, mueva la anotación a las estructuras histológicas deseadas.
Estas anotaciones marcan las ubicaciones de los punzones en el bloque de tejido correspondiente. Repita este proceso hasta que todas las diapositivas estén anotadas. Una opción alternativa para la causa tisular es enviarlos a un tubo de PCR de 0,2 mililitros para su análisis molecular.
Anote las diapositivas usando una marca de color diferente para distinguir estos puntos de los que son el TMA. Una vez hechas todas las anotaciones, guarde un archivo de hoja de cálculo que contenga una lista de todas las diapositivas con sus anotaciones correspondientes y los colores de las anotaciones. Comience la microreconstrucción del tejido recuperando los bloques de tejido de parafina correspondientes para todos los portaobjetos digitales anotados, a partir de entonces.
Se denominan bloques de donantes. Ordena los bloques en el mismo orden que las diapositivas digitales. Comprueba que cada bloque tenga al menos cuatro milímetros de grosor.
De lo contrario, el tejido tendrá que reinventarse en la computadora. Abra el software de micromatriz de tejidos y proporcione un nombre para el proyecto. Vaya al cambio de herramienta y seleccione el diámetro de herramienta requerido.
Ahora cargue hasta 12 bloques de destinatarios en la máquina. Toma nota de los nombres de los bloques. Todos deben estar etiquetados utilizando el mismo sistema de numeración para mantener la coherencia.
Luego, en el software, asigne el nombre apropiado a cada uno de los bloques para crear un diseño TMA. Primero, haga un nuevo diseño de TMA asignando el número de filas, columnas, líneas vacías y espaciado de los punzones. Guarde el diseño y asígnelo al bloque.
A continuación, repita el proceso para el siguiente bloque. Con un nuevo diseño o el mismo diseño, los tamaños de los núcleos se pueden variar entre los bloques receptores. A continuación, cargue hasta 60 bloques donantes en la máquina.
En cada fila caben hasta 10 bloques. De la A a la F. Los bloques donantes restantes se cargarán más adelante en el software. Asigne a cada bloque de donantes un nombre que lo identifique.
Se adquirirá automáticamente una imagen de cada bloque. Ahora alinee las diapositivas digitales con sus correspondientes bloques donantes. Primero, seleccione un bloque.
A continuación, haga clic en la diapositiva y compare las imágenes de la diapositiva y del bloque una al lado de la otra. Seleccione puntos de referencia en la imagen del bloque donante que correspondan a puntos específicos en la diapositiva digital correspondiente. A continuación, haga clic en siguiente y las anotaciones se trasladarán a la imagen del bloque donante.
Si las anotaciones son correctas, haga clic en cada una para confirmar su ubicación. A continuación, haga clic en Inicio. Esto hace que el microarray perfore un agujero en el punto de referencia en el bloque receptor y, a continuación, perfore un agujero del bloque donante en la misma ubicación y transfiera el núcleo al bloque receptor.
Para recolectar núcleos en un tubo de PCR, haga clic en la herramienta de PCR para el bloque. Se pueden utilizar hasta cuatro anotaciones para suministrar tejido al tubo. Una vez que estén configurados, haga clic en iniciar y se llamará al donante y se cargará el tubo.
Después de que la máquina perfore y perfore los núcleos, actualice la imagen del bloque donante. Proceda a repetir la alineación y la anotación para el siguiente bloque. A continuación, cúscalo.
Siga haciendo esto para todos y cada uno de los bloques de donantes. Eso será en el TMA. Cuando se complete el primer conjunto de 60 bloques donantes, descárguelos y cargue 60 bloques más.
Continúe el proceso hasta que todos los bloques de donantes estén colocados. Después de tomar unos 500 núcleos, limpie el taladro y la herramienta de perforación se extinguirá rápidamente. Cuando se completen las matrices, exporte el proyecto.
Un archivo de hoja de cálculo con los datos del proyecto estará en la carpeta de exportación. Muestra la ubicación de cada muestra dentro de cada bloque TMA. A continuación, guarde las imágenes del bloque donante con anotaciones superpuestas como archivos JPEG en la carpeta de exportación.
Esto completa el proceso de generación del bloque TMA. Este diseño de TMA muestra seis bloques NG TMA que se construyeron en dos copias para 12 bloques finales para llenar la matriz. Cada bloque tumoral contenía 402 manchas de tejido y cada bloque de tejido normal contenía 268 manchas.
Después de anotar 60 bloques de donantes, se perforó la causa. El tiempo de transferencia del núcleo fue de aproximadamente 12 segundos. La pérdida de núcleo fue mínima, y el tiempo total para una matriz, este proyecto fue en total de unas 24 horas.
Esto incluyó el tiempo necesario para perforar la causa del análisis molecular posterior después del proceso de N-G-T-M-A. A estos microarrays de tejidos se les pueden aplicar otros métodos, como la inmunohistoquímica en la citohibridación e incluso tinciones especiales, con el fin de responder a algunas preguntas como qué genes o proteínas se expresan o incluso se alteran en los diferentes tejidos.
Descripción general
Este protocolo describe la construcción y optimización de matrices microtisulares para la investigación de biomarcadores. Integra la patología digital y la agrupación automatizada de tejidos para mejorar la precisión histológica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación de biomarcadores
- Tecnología de matriz de microtejidos
- Patología digital
Antecedentes
- Las matrices de microtejidos son esenciales para el análisis de alto rendimiento de biomarcadores.
- Los archivos digitales de portaobjetos facilitan la anotación precisa de áreas histológicas.
- Los procesos automatizados mejoran la eficiencia y la precisión en el muestreo de tejidos.
- La experiencia histológica es crucial para una selección óptima de tejidos.
Objetivo del estudio
- Construir microarreglos de tejidos dirigidos para la investigación de biomarcadores.
- Mejorar la precisión del muestreo de tejidos mediante la automatización.
- Optimizar el proceso de anotación digital de portaobjetos y transferencia de tejidos.
Métodos Utilizados
- Creación de archivos digitales de portaobjetos a partir de portaobjetos de tejido representativos.
- Anotación de áreas histológicas de interés en portaobjetos digitales.
- Perforación automatizada de bloques donantes para crear matrices de tejidos.
- Uso de software para el diseño y gestión del diseño de matrices de tejidos.
Resultados Principales
- Construcción exitosa de microarreglos de tejidos con alta precisión histológica.
- Transferencia eficiente de muestras de tejido dirigidas a bloques receptores.
- Mejora del flujo de trabajo mediante la automatización y la integración con la patología digital.
- Creación de una hoja de cálculo integral de datos del proyecto para análisis posteriores.
Conclusiones
- El protocolo mejora significativamente la calidad de las matrices de tejidos microarrays.
- La combinación de la patología digital con técnicas automatizadas produce resultados precisos.
- Este enfoque es ventajoso frente a los métodos tradicionales de construcción de matrices de tejidos microarrays.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tecnología de microarreglos de tejidos de próxima generación (ngTMA) aborda la necesidad crítica de un muestreo de tejidos preciso y reproducible en el descubrimiento y la validación de biomarcadores. Al integrar la patología digital con la formación automatizada de arreglos, ngTMA mejora la precisión histológica y el rendimiento, apoyando directamente los flujos de trabajo de validación de objetivos y desarrollo de ensayos. Este enfoque reduce el ruido biológico en modelos preclínicos, mejorando la confianza predictiva en la identificación de compuestos prometedores y en estudios de biomarcadores traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la captura de regiones histológicas específicas, como el centro del tumor, el frente de invasión y los sitios metastásicos, para la validación funcional de dianas.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la anotación precisa de zonas del tejido, reduciendo la ambigüedad mecanicista en los estudios de interacción con la diana.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la generación de puntos de tejido estandarizados a partir de regiones anotadas, lo que permite una evaluación confiable de compuestos.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante el perforado automatizado y la coincidencia digital de portaobjetos, asegurando una preparación consistente de muestras entre diferentes ejecuciones.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad y la alineación de biomarcadores traslacionales mediante la incorporación de múltiples tipos de tejidos/zonas histológicas (por ejemplo, tumor, ganglio linfático, metástasis hepáticas, tejido normal) a partir de muestras de pacientes.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la producción de múltiples copias de ngTMA para análisis paralelos en inmunohistoquímica, hibridación in situ y tinciones especiales.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
ngTMA se integra en el continuo de descubrimiento desde el Descubrimiento Temprano hasta la Identificación de Compuestos Promisorios y el trabajo Preclínico, al proporcionar resultados cuantitativos y resueltos espacialmente en tejidos que apoyan la prueba de hipótesis y la aclaración de vías.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la prueba de hipótesis, la aclaración de vías o la reducción de riesgos biológicos mediante la captura precisa de áreas histológicas de interés a través de anotación digital.
- Selección: Describe la preparación del ensayo, la reproducibilidad o las salidas cuantitativas cuando el artículo lo respalda mediante la disposición automatizada de regiones anotadas que producen puntos de tejido estandarizados.
- Análisis: Destaca las mediciones, lecturas o salidas estadísticas que ayudan a los equipos a comparar condiciones mediante la anotación digital de portaobjetos y la exportación de datos del proyecto para análisis posteriores.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores solo cuando la fuente lo respalda, al permitir la aplicación de IHC, ISH y tinciones especiales en ngTMA para evaluar la expresión de proteínas/genes en distintas zonas del tejido.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único, mediante la producción de múltiples copias de ngTMA y el archivo digital de portaobjetos para estudios futuros.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en histología, patología digital y diseño de microarrays de tejidos.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo un microdispensador de tejidos automatizado, escáner de portaobjetos y plataforma web para anotación.
- Requisitos de estandarización entre equipos para protocolos de anotación, etiquetado de bloques y gestión de datos.
- Consideraciones de adaptación en distintos sistemas modelo, como tipos de tejido variables, tamaños de núcleos y volúmenes de muestras de pacientes.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la documentación fuente, incluyendo el tiempo de anotación (2-3 min/caso), requisitos de escaneo (3 corridas nocturnas para 134 pacientes) y tiempo de microarreglo (15-20 h).
