Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

El objetivo de este procedimiento es cuantificar las patologías pulmonares crónicas de la EPOC en los pulmones de ratones expuestos al humo del cigarrillo. Esto se logra exponiendo primero a los ratones al humo del cigarrillo o al aire durante seis meses. A continuación, se realizan pruebas de función pulmonar en los ratones utilizando un ventilador para roedores.

Luego, los pulmones se inflan a una presión fija, se retiran y se fijan en formalina al 10%. Por último, se utiliza un software más informativo para medir el tamaño del espacio aéreo en secciones pulmonares teñidas de branquias y pequeñas secciones de pulmón teñidas de vías respiratorias, el grosor de la capa de proteínas o las secciones pulmonares teñidas con tricomas de Mason. En última instancia, la medición del agrandamiento del espacio aéreo en los pulmones de los ratones expuestos al humo del cigarrillo se realiza de manera estandarizada, imparcial y automatizada.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la medición de intercepción lineal media o el índice destructivo, es que este protocolo requiere menos tiempo para completarse, es menos susceptible al sesgo del observador y es más eficaz para capturar la naturaleza heterogénea de la patología en ratones, ya que puede analizar la enfermedad en LOB completos y/o ambos pulmones. Después de exponer a los ratones al humo del cigarrillo y anestesiarlos de acuerdo con el protocolo de texto, afeitar la piel anterior a la tráquea y usar una solución a base de yodo seguida de etanol para desinfectar el área con tijeras clavadas. Haga una incisión en la línea media a través de la piel y el tejido subcutáneo anterior a la tráquea y use fórceps para separar los músculos tiroideos esterno.

Para exponer la tráquea, pase una sutura de seda de dos pulgadas de largo posterior a la tráquea, induzca unas tijeras traqueales para hacer una traqueotomía en la cara anterior de la tráquea. A continuación, inserte una cánula de calibre 18 en la traqueostomía. Induzca la sutura para asegurarla en su lugar a través de la cánula traqueal.

Conecte el ratón al tubo Y del adaptador del ventilador mecánico e inicie la ventilación mecánica con un volumen corriente de 10 mililitros por kilogramo y una frecuencia respiratoria de 150 respiraciones por minuto. A continuación, infle los pulmones hasta una capacidad pulmonar total o TLC de tres veces por historia de volumen. Para medir la capacidad inspiratoria o ic y reducir el éxtasis de los pulmones, realizar una oscilación forzada de frecuencia única, maniobrar, y evaluar la resistencia dinámica, RRS, elastina ERS y distensibilidad CRS del sistema respiratorio.

A continuación, lleve a cabo una frecuencia de banda ancha, oscilación forzada, maniobra y mida la resistencia de la vía aérea central, la resistencia del tejido RN, el tejido G, la elastina H y la relación G sobre H. Finalmente, registre el cumplimiento cuasi estático CST durante las maniobras de flujo de presión volumétrica. Repita cada una de estas maniobras cinco veces hasta obtener lecturas consistentes. Inflar a TL C3 veces entre cada serie repetida.

Registre el valor medio de cada parámetro para cada ratón. Retire el ratón del ventilador y después de practicarlo la eutanasia de acuerdo con el protocolo de texto. Corta el diafragma, abre el tórax en la línea media y retira las costillas anteriores para exponer los pulmones.

Diseccionar la piel y el tejido subcutáneo alrededor de la tráquea y pasar dos suturas de seda de dos pulgadas de largo posteriores a la tráquea. Una vez que se ha cuantificado la insuflación pulmonar mediante la realización de un lavado broncoalveolar y se ha expulsado el aire del equipo de administración para la inyección pulmonar, conecte el equipo de administración intravenosa a la cánula traqueal. Abra la válvula y permita que el PBS fluya hacia los pulmones por gravedad hasta que los pulmones se inflen por completo.

Realizar un nudo con la sutura distal a la cánula traqueal. Use pinzas para levantar la tráquea y cortarla proximal al nudo. A continuación, diseccionar el tejido conectivo posterior a la tráquea y los pulmones.

Retire con cuidado los pulmones y colóquelos en un tubo que contenga un 10% de solución salina. Fórmula tambada. Fije los pulmones a temperatura ambiente durante la noche antes de usar PBS para lavarlos dos veces.

Incrusta los pulmones en parafina y corta cinco secciones de micro tramos de grosor. A continuación, utilice la tinción branquial para teñir las secciones y obtener una imagen de ellas como se indica en el protocolo de texto. Para preparar imágenes para el análisis de imágenes de Scion, inicie la imagen de Scion y cargue las macros como se indica en la parte complementaria del protocolo de texto, seleccione la macro de imagen de campo claro abierta para seleccionar y abrir un archivo TIFF.

Utilice las herramientas de edición de imágenes para preparar la imagen. Para el análisis, seleccione el color del pincel haciendo clic en blanco o negro en la parte inferior de la ventana de LUT. A continuación, haga clic en la herramienta de pincel para cambiar el tamaño del pincel.

Haga doble clic en la herramienta de pincel e introduzca un tamaño de pincel adecuado. Utilice la herramienta de pincel para forzar que las áreas que no son espacio aéreo o paredes alveolares se traten como espacio aéreo o tejido pintando los bronquios y los vasos de negro para que se analicen como tejido. Para medir la longitud media del cable del espacio aéreo, seleccione la macro longitud del cable air two.

Este paso convierte la imagen en escala de grises en una imagen binaria con solo un umbral de píxeles blancos o negros. La imagen binaria haciendo clic cerca del centro de la imagen y arrastrando el ratón hacia arriba o hacia abajo. Para ajustar el valor de umbral, haga clic con el ratón por segunda vez para aceptar el valor.

Ajuste el umbral para que las paredes alveolares tengan el mismo grosor que en las imágenes originales. Es crucial no estar por debajo del umbral y, por lo tanto, crear roturas en las paredes alveolares que no existen en la imagen original, lo que producirá valores de longitud de cordón artificialmente altos. Observe una ventana que solicita un nuevo umbral de la imagen binaria y continúe o cancele la macro hasta el umbral.

Nuevamente, responda por qué a la pregunta y seleccione el botón Aceptar. Observe la ventana de cuadrícula horizontal y vertical generada por macros con líneas separadas por cinco píxeles. El programa mide las longitudes de las líneas verticales horizontales que se superponen al espacio aéreo.

Guarde el archivo en cualquier carpeta con el nombre predeterminado. Eso incluye un formato de archivo que se adjunta con C LA TXT para la longitud del cable del espacio aéreo. Esto permitirá que las macros de informes de Excel encuentren el archivo.

Para analizar los informes, abra el informe X Excel TWENTYX XLS. Elija la macro CL m multi para informar de las mediciones de la longitud del cordón alveolar para varias carpetas correspondientes a imágenes de varios ratones desde la ventana de archivo. Seleccione una carpeta a la vez resaltando la carpeta y, a continuación, seleccionando OK.

A medida que se selecciona cada carpeta, observe su hoja de cálculo que muestra las estadísticas de cada archivo txt CL. Seguido de las estadísticas de los datos de longitud del cable combinados de todos los archivos, abra el archivo all CL para ver los datos de todas las hojas de trabajo. Finalmente, cambie el nombre y guarde la hoja de cálculo.

El nombre de archivo predeterminado es el nombre de la carpeta principal anexada con c xls. Aquí se muestra una sección de un pulmón bien inflado. Los macrófagos en los espacios alveolares están pintados de blanco y los vasos y bronquios están pintados de negro.

A continuación, la imagen se convierte en una imagen binaria sometida a umbrales utilizando la imagen original y, a continuación, se invierte de modo que todos los píxeles del espacio alveolar sean negros o los píxeles de las zonas del pulmón que no sean alvéolos sean blancos. En estas figuras se muestran las longitudes verticales y horizontales del cordón alveolar que genera la macro de software. Este experimento ilustra que los ratones C 57 black six wild type expuestos al humo tienen un aumento del 23% en el tamaño del espacio aéreo alveolar en comparación con los ratones de tipo salvaje expuestos al aire por edad y sexo.

Las pruebas de función pulmonar muestran modestos cambios a la izquierda en los bucles de volumen de presión, lo que refleja una modesta pérdida del retroceso elástico del pulmón, consistente con el enfisema leve que se desarrolla en ratones C 37 negro de seis tipos salvajes expuestos al humo del cigarrillo. Los seis meses que se muestran aquí son imágenes de secciones masivas de pulmones teñidos de tricromo de ratones negros C 57 de tipo salvaje expuestos al aire o al humo del cigarrillo durante seis meses, lo que ilustra los aumentos en la deposición de proteínas de la matriz extracelular alrededor de las vías respiratorias pequeñas en el cigarrillo, animales expuestos al humo mientras intentaban este procedimiento. Es importante recordar que hay que tener cuidado de no cortar los pulmones al sacarlos de la jaula torácica de los ratones después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para las búsquedas en el campo de las enfermedades pulmonares para explorar las vías que contribuyen a la patogénesis de las enfermedades pulmonares proobstructivas crónicas en ratones, y evaluar la eficacia de nuevas terapias para nuestra EPOC en un sistema modelo preclínico.