Name: La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprende a inducir células madre neurales directamente desde células progenitoras hematopoyéticas CD34+ de sangre periférica mediante transfección con virus Sendai. Este método permite obtener neuronas, astroglía y oligodendrocitos para investigación en neurociencia y medicina regenerativa.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

1. Enriquecimiento de las células progenitoras hematopoyéticas de sangre entera adulto NOTA: células progenitoras hematopoyéticas o células CD34 + se pueden purificar a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) derivadas de una variedad de fuentes, incluyendo sangre del cordón umbilical, material de leucaféresis y la sangre entera utilizando métodos basados ​​centrifugación en gradiente de densidad. El método enumerado aquí utiliza la sangre entera como un ejemplo. <ol><li> El aislamiento de PBMCs de sangre entera: <ol><li> Añadir 4,5 ml de medio de separación de linfocitos al tubo SepMate pipeteando a través del orificio central de la pieza de inserción. </li><li> Diluir la muestra de sangre con un volumen igual de DPBS estériles que contienen 2% de suero humano (v / v). Por ejemplo, diluir 5 ml de muestra con 5 ml de DPBS + 2% de suero humano. </li><li> Añadir la muestra diluida pipeteando hacia abajo el lado del tubo. Tenga cuidado de no verter la muestra directamente a través del agujero central. </li><li> Centrifugar a 1200 xg durante 10 min a TA. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante por encima de la capa de PMBC. </li><li> Recoger la capa de PBMC (nublado) en un nuevo tubo. </li><li> Añadir 15 ml de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) que contiene 2% de suero humano en el tubo y centrifugar a 150 xg durante 10 min a TA con el freno. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de DPBS que contenía 2% de suero humano. Contar el número de células. </li><li> Centrifugar a 690 xg durante 10 min a TA. Eliminar todo el sobrenadante del tubo. </li><li> Resuspender las células en 1 x 10 7 células por 15 ml de de Dulbecco modificado por Iscove medio (IMDM) que contenía 1% de antibióticos (v / v) y 10% de suero humano (v / v). </li><li> Se incuban las células O / N a 37 ° C en el 5% de CO2 antes de aislar las células CD34 +. </li></ol></li><li> La selección positiva de células CD34 + a partir de PBMCs utilizando CD34 multisort Kit: NOTA: trabajo rápido y utilizar soluciones pre-enfriado para fabricar células frío y prevenir tapadode anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado de células no-específica por la instrucción kit. <ol><li> Recoge todas PMBCs en un tubo de 50 ml y contar el número de células totales en el medio. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. Retire completamente todo el sobrenadante. </li><li> Resuspender hasta 10 8 células por 300 l en tampón de talón (DPBS que contenía 0,5% de suero humano (v / v) y EDTA 2 mM). </li><li> Añadir 100 l de FcR Reactivo de bloqueo y añadir 100 l de MultiSortMicroBeads CD34. </li><li> Mezclar bien e incubar durante 30 minutos en el frigorífico (2-8 ° C). </li><li> Lavar las células mediante la adición de 2 ml de tampón de grano por 10 8 células y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Retire completamente sobrenadante. </li><li> Resuspender hasta 10 8 células en 500 l de tampón. </li><li> Colocar la columna MACS LS en el campo magnético de un MACS Separador y preparar la columna de lavado con 3 ml de tampón de perla. </li><li> Aplicar la suspensión de células en el center de la columna. Células no marcadas fluirán a través del cual se pueden recoger, si se prefiere. </li><li> Lavar la columna tres veces con 3 ml de tampón de perla. </li><li> Retire la columna del separador y colocarlo en un tubo de 15 ml. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de la gota sobre la columna y eliminar inmediatamente las células marcadas magnéticamente empujando el émbolo en la columna. </li><li> Añadir 20 l de multisort liberación de reactivo por 1 ml de suspensión celular. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos en el frigorífico (2-8 ° C). </li><li> Añadir 1 - 2 ml de tampón de grano por 10 7 células y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a TA. Retire completamente sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 50 l de tampón de grano por 10 7 células. </li><li> Añadir 30 l de multisort Detener Reactivo por 10 7 células y se incuba durante 15 minutos en el refrigerador. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de talón y centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li></ol></li></ol> 2. La derivación de células madre neuronales inducida de células CD34 + <ol><li> Las células CD34 + cultura: NOTA: medio recién preparado se debe utilizar dentro de los 7 días cuando se almacena en el refrigerador. Pérdida significativa de células CD34 se observó después de 24 hr, pero la proliferación significativa de células debe ser perceptible, especialmente después de día 5. Si el número de células disminuye continuamente o no hay proliferación, implica ya sea mala calidad de las células medianas o CD34 y las células no debe ser utilizado para el siguiente paso. <ol><li> + Resuspender las células y la cultura CD34 en CD34 mantenimiento de medio (medio StemSpan SFEM que contiene trombopoyetina humana (TPO, 100 ng / ml), de tipo fms tirosina quinasa 3 (Flt-3) ligando (100 ng / ml) y factor de células madre (SCF, 100 ng / ml), interleucina-6 (IL-6, 20 ng / ml) y la interleucina-7 (IL-7, 20 ng / ml)) en una placa de 24 pocillos (hasta 3 x 10 5 / pocillo en 1 ml de medio por pocillo) a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> After 24 horas, recoger las células flotantes y centrifugar las células a 110 xg a temperatura ambiente para deshacerse de las células unidas y restos celulares. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de mantenimiento y CD34 semilla fresca en una nueva placa de 24 pocillos (hasta 1 x 10 5 / pocillo) a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora durante 5 días adicionales. </li><li> Reemplazar la mitad del medio cada otro día por aspiración cuidadosamente la mitad superior del sobrenadante mientras que las células CD34 + están flotando en la parte inferior de los pocillos (Figura 1A). </li></ol></li><li> Sendai transfección virus: <ol><li> En el día 5, recoger las células CD34 y centrifugar las células a 170 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en medio fresco a 1 x 10 5 / pocillo en una placa de 24 pocillos en 1 ml de medio. </li><li> Descongelar un kit de reprogramación cytotune-iPS Sendai sumergiendo primero la parte inferior de los tubos en un baño a 37 ° C durante 10 segundos y luego descongelar completamente unt RT. Brevemente centrifugar los tubos y los puso en hielo. Preparar la mezcla de virus Sendai mezclando el volumen recomendado de cada virus que aparece en el certificado de análisis (COA) para el lote correspondiente. Se recomienda MOI 15. </li><li> Añadir la mezcla de virus Sendai a cada pocillo de células CD34. Mezclar los pozos sacudiéndolo suavemente. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Observar la eficacia de transfección después de 24 horas. Observe que los agregados de células y formación de esferas son indicadores para la transfección con éxito (Figura 1B). </li><li> Cambie la mitad del medio transfiriendo cuidadosamente la mitad superior del medio a otro también. Si hay esferas de células en el nuevo bien, añadir la misma cantidad de medio fresco. </li><li> Cambio de medio cada otro día a paso 2.2.6 repetir. </li></ol></li><li> Neural la inducción de células madre: NOTA: Dependiendo de las condiciones de células, a unos 5 o 7 días después de la transfección, las células adherentes monocapa alcanzarán 30 -50% de confluencia (Figura 1C). <ol><li> Retirar los sobrenadantes que contienen células flotantes y esferas y luego añadir 1 ml de medio de progenitor neural (Medio Eagle Modificado de Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEM / F12), que contiene suplemento 1x N2, 0,1% (w / v) de albúmina de suero bovino ( BSA), 1% (v / v) antibióticos, 20 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF)) en las células adherentes. </li><li> Opcionalmente, disociar las esferas de células pipeteando suavemente y centrifugar las células a 170 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de progenitor neural en una nueva placa de 24 pocillos recubierta con Matrigel por instrucción como una copia de seguridad. </li><li> Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcanzan 60-80% de confluencia, por lo general después de 1 semana. </li><li> Descartar el sobrenadante y añadir en 1 ml de medio de células madre neurales (medio libre de suero, NSC SFM). Disociar las células utilizando un raspador de células seguidocon la pipeta muy suave. </li><li> Retire las células y sembrar todos ellos en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Añadir otro 1 ml de medio de células madre neurales para hacer 2 ml de medio para cada pozo. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambie medio cada otro día. </li><li> Cuando las células alcanzaron 60% de confluencia, disociar y replate las células en relación 1: 3 siguiendo los pasos de los puntos 2.3.4 y 2.3.6. </li></ol></li><li> La congelación de las células madre neurales: <ol><li> Preparar célula madre neural medio de congelación mediante la adición de 20% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) en el medio de células madre neural. Mantenga el medio de congelación en el hielo. </li><li> Disociar las células en una placa de 6 pocillos, con un raspador celular seguido pipeteando suavemente. Contar las células. Centrifugar las células a 170 xg durante 10 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en medio de células madre neurales a 1 x 10 6 / ml. Añadir el mismo volumen de medio de congelación a las células. </li><li> Añadir 1 ml (5 x 10 5 células totales) de células en un criovial. Congelar las células utilizando un recipiente de congelación Sr. Froster después de la instrucción. </li></ol></li></ol> 3. Neural Diferenciación Celular <ol><li> Células neuronales de diferenciación: <ol><li> Cuando las células madre neurales alcanzan el 80% de confluencia, separar las células madre neurales utilizando una goma de policía y luego disociarse pipeteando suavemente. </li><li> Contar las células y ajustar la concentración de 1 x 10 5 / ml en medio de células madre neurales. </li><li> Para la diferenciación neuronal, la placa de las células en la cubierta de poli-D-lisina / laminina recubierto desliza en placas de 24 pocillos a 1 x 10 5 / pocillo. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Reemplazar el medio con medio de diferenciación neural (DMEM / F12 que contiene suplemento N2 1x, 1x suplemento de B27, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM de vitamina C, 10 cerebro ng / ml factor neurotrófico derivado (BDNF) y 10 ng / ml de células gliales deriva factor neurotrófico (GDNF)) after 24 hr. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambiar medio de diferenciación neural dos veces a la semana durante 2 semanas. </li></ol></li><li> Diferenciación astroglial: <ol><li> Disociar las células madre neurales con la pipeta. </li><li> Contar las células y ajustar la concentración de células a 5 x 10 4 células / ml. Sembrar las células en placas de 24 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Reemplazar el medio con DMEM / F12 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambio de medio dos veces a la semana durante 2 semanas. Si las células alcanzan la confluencia antes de 2 semanas, replate las células siguientes pasos 3.2.1 y 3.2.2. </li></ol></li><li> La diferenciación de oligodendrocitos: <ol><li> Disociar las células madre neurales con la pipeta. </li><li> Contar las células y semillas de 1 x 10 5 células de recubrimiento 24 y placas de poli-L-ornitina en 1 ml de differenti oligodendrocitosación medio que consiste en DMEM / F12 que contiene suplemento N2, 10 ng / ml de derivado de plaquetas factor de crecimiento-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml de neurotrofina-3 (NT-3), 2 ng / ml de sonic hedgehog ( Shh), y 3 nM de triyodotironina (T3). Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Cambio de medio dos veces a la semana durante 2 semanas. </li><li> Sustituya el medio por DMEM / F12 con suplemento 1xN2 y 3 nM de T3 y cultivar las células para una semana adicional para la proteína básica (MBP) la producción de mielina. </li></ol></li></ol> 4. La tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Reemplace medios con 4% de paraformaldehído (PFA). Incubar durante 10 min a TA. </li><li> Desechar PFA y lavar con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBS-T) 3 veces, 5 minutos cada vez. </li><li> Permeabilizar las células con PBS que contenía 0,5% de Triton X-100 durante 10 min a RT. </li><li> Bloquear las células con PBS-T que contiene 4% de suero de cabra durante 20 min a TA. </li><li> Se incuban las células con Antibo primaria correspondientemuere diluido en PBS-T que contiene 0,1% de BSA durante 2 horas a RT o O / N en la habitación fría. </li><li> Lavar las células durante 3 veces con PBS-T, 5 min cada vez. Se incuban las células con los correspondientes anticuerpos secundarios acoplados con un fluorocromo usando dilución 1: 400 en PBS-T que contiene 0,1% de BSA durante 1 hora en un agitador en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS-T que contiene 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min a TA. </li><li> Lavar las células dos veces más con PBS-T durante 5 min cada uno a TA. </li><li> Observar las células marcadas con un microscopio y tomar fotos (Figura 3). </li></ol>

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</ol>

El estudio está financiado por fondos intramuros de los NIH.

Se proporciona un protocolo detallado para generar directamente las células madre neurales a partir de células progenitoras hematopoyéticas periféricas. En comparación con células de fibroblastos, la sangre periférica humana es más accesible. Utilizando el protocolo presentado, más de 1 x 10 5 células progenitoras hematopoyéticas o células CD34 positivas, pueden enriquecerse a partir de 10 ml de sangre entera. Aunque la contaminación con plaquetas por lo general no se puede preven...

In vitro cultivos neuronales se han utilizado como una herramienta fundamental para estudios de enfermedades neurológicas. Primarios de origen animal (principalmente roedores) los cultivos neuronales 1, 2 y líneas de células neurales humanas derivadas de gliomas u otros tumores son los más comúnmente utilizados en tales estudios. Sin embargo, se ha reconocido que existen diferencias significativas entre roedores y células humanas. Muchos hallazgos basados ​​en roedores no pueden ser traducidos a los seres humanos. Por otra parte, con el rápido desarrollo de análisis de la información genómica masiva y la edición de genes relativamente fácil y la secuenciación del genoma, la tendencia es cada vez más orientado a descubrir la enfermedad genes propensos y delinear sus funciones y roles en enfermedades específicas, lo que hace que los pocos neuronal humano líneas celulares sólo han limitado su uso. En teoría, los cultivos neuronales primarios humanos derivadas de muestras de sistema nervioso del paciente son la mejor opción, pero son imposibles de obtener; meth por lo tanto alternativaSAO son necesarios. En los últimos años, se hayan interpuesto algunos enfoques, con dos que son los más distinguibles. Tras el desarrollo de la técnica de generar células madre pluripotentes inducidas (IPSC) a través del ratón y células somáticas humanas 3, 4, células neurales podría estar más diferenciada de ellos 5-7. Sin embargo, la generación y caracterización de IPSC exige mucha mano de obra, las técnicas, y la entrada de tiempo, a veces incluso prohibitivo. Poco después, otro enfoque fue desarrollado para transformar directamente las células neuronales a partir de células somáticas 8, 9. Como las neuronas resultantes son no proliferativa, limita su aplicación en estudios intensivos y la detección de drogas, que requiere una gran cantidad de células. Para aprovechar las ventajas de ambas técnicas, la derivación directa de la madre neurales / células progenitoras a partir de células somáticas ha sido explorado por varios grupos 10-12, que no pasa por el tedioso proceso de generación y caracterización de IPSC pero todavía Provides un buen número de células madre neurales de diferenciación neuronal después. Hemos demostrado previamente que, tras la introducción de los factores de transcripción Yamanaka en células progenitoras hematopoyéticas, células madre neurales pueden ser generados directamente utilizando una célula progenitora neural seleccionando medio 13. Aquí, se presenta el método en detalle.

<table><tbody><tr><td>Medio de separación de linfocitos</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Suero humano</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CL</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Columna MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medio</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Productos biológicos de calidad</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Kit de reprogramación IPS Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Viales CryoTube</td><td>Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty container</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0,1% (p/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>medio libre de suero NSC</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina/laminina</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poly-L-ornitina</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Calidad Biológico</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal anti-Nestina</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 anticuerpo</td><td>Applied Stemcell</td><td>ASA0120</td><td>Listo para usar</td></tr><tr><td>Anti-& beta de ratón; Anticuerpo III-tubulina</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFAP de conejo</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>dilución 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-O4</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticuerpo anti-conejo de cabra</td><td>Life techniologies</td><td>A11012</td><td>dilución 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo anti-ratón</td><td>de cabra Life techniologies</td><td>A11001</td><td>dilución 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo IgM anti-ratón de cabra</td><td>Life techniologies</td><td>A21042</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 y mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

la inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Enfermedad humana cultivos neuronales específicas son esenciales para la generación de modelos in vitro para enfermedades neurológicas humanas. Sin embargo, la falta de acceso a los cultivos primarios neuronales adultas humanas plantea desafíos únicos. La evolución reciente de las células madre pluripotentes inducidas (IPSC) ofrece un enfoque alternativo para derivar culturas neuronales de fibroblastos de la piel a través de paciente específico IPSC, pero este proceso es laborioso, requiere conocimientos especiales y grandes cantidades de recursos, y puede tomar varios meses. Esto impide la amplia aplicación de esta tecnología para el estudio de enfermedades neurológicas. Para superar algunos de estos problemas, hemos desarrollado un método para obtener células madre neurales directamente de la sangre periférica humano adulto, sin pasar por el proceso de derivación de IPSC. Las células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de sangre periférica humana adulta se cultivaron in vitro y se transfectaron con los vectores de virus Sendai que contienen factores de transcripción Sox2, Oct3/4, Klf4 y c-Myc. Los resultados de transfección en cambios morfológicos en las células que se seleccionan aún más mediante el uso de medio progenitora neural humano que contiene factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las células resultantes se caracterizan por la expresión de marcadores de células madre neuronales, tales como nestina y SOX2. Estas células madre neurales podrían diferenciarse aún más a las neuronas, oligodendrocitos astroglia y en medio de diferenciación especificado. Usando muestras de sangre periférica humana de fácil acceso, este método podría utilizarse para obtener células madre neuronales para una mayor diferenciación de las células neuronales para el modelado in vitro de los trastornos neurológicos y puede avanzar en estudios relacionados con la patogénesis y el tratamiento de esas enfermedades.

<html> La calidad de las células CD34 es crítico para el éxito de la transducción de células madre neural. Células CD34 de alta calidad proliferan durante el primer par de días de cultivo y aparecen como no adherente, células homogéneamente redondas, flotando justo por encima de la parte inferior de los recipientes de cultivo (Figura 1). Los resultados de infección exitosas en agregados de células, que se expande a través del tiempo (Figura 1B), mientras que se pueden producir agregados ...

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir directamente células madre neurales a partir de células sanguíneas. Esto se logra primero enriqueciendo células progenitoras hematopoyéticas positivas para CD34 a partir de sangre. El segundo paso consiste en transfectar las células CD34 con virus sendai que contiene factores de transcripción.A continuación, se obtienen las células madre neurales utilizando un medio selectivo. El paso final consiste en diferenciar las células madre neurales inducidas en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. En última instancia, se utiliza la microscopía de inmunofluorescencia para caracterizar las células resultantes.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la obtención de neuronas directamente a partir de fibroblastos o la generación de células iPS, es que este método evita el proceso tedioso de generación y caracterización de células iPS, pero aún así proporciona una gran cantidad de células neuronales que pueden derivarse y diferenciarse en neuronas. Tuve por primera vez la idea de este método cuando observé que las células CT 34 transfectadas adheridas mostraban en realidad un aspecto muy similar al de las células progenitoras neuronales cultivadas primariamente, lo que demostraba que el procedimiento sería viable. Un técnico de mi laboratorio, Marines, participó en este proceso. Tras aislar las células CD 34 de los linfocitos mononucleares periféricos según las instrucciones del protocolo descrito, inicie el proceso de cultivo de las células CD 34 mediante resuspensión, suspendiendo las células CD 34 en medio CD 34, y luego siembre las células en una placa de 24 pocillos a una densidad de tres veces 10 a la quinta células por pocillo en un mililitro de medio.Después de incubar durante 24 horas en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, recolecte las células en suspensión y centrifugue la suspensión celular a 110 veces G a temperatura ambiente. Luego deseche el sobrenadante y resuspenda las células en medio de mantenimiento CD34 fresco. Siembre una nueva placa de 24 pocillos a una concentración de un por diez a la quinta células por pocillo en un mililitro de medio, incube a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono durante cinco días adicionales, reemplazando la mitad del medio cada dos días.Aspirando cuidadosamente la mitad superior del sobrenadante mientras las células CD34 se encuentran en el fondo de los pocillos, como se muestra aquí en el quinto día. Después de sembrar, recolecte las células CD34 y centrifugue las células a 170 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente, deseche el sobrenadante, resuspenda las células como antes y siembre una placa fresca de 24 pocillos a una concentración de 1 × 10⁵ células por pocillo en un mililitro de medio. A continuación, descongele un kit de reprogrameación cyto tune IPS Sendi.Primero sumerja los extremos inferiores de los tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 segundos y luego descongele completamente a temperatura ambiente. Centrifugue brevemente los tubos y colóquelos sobre hielo. Prepare la mezcla del virus Sendai mezclando el volumen recomendado de cada virus indicado en el certificado de análisis para el lote correspondiente.Se recomienda una multiplicidad de infección de 15. Añada la mezcla de virus Sendai a cada pocillo de células CD 34. A continuación, mezcle los pocillos agitando suavemente la placa.Incube las células a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Observe la eficiencia de transducción. Observe que los agregados celulares y esferas como los mostrados aquí son indicadores de una transducción exitosa.Luego, incubar las células en el incubador de cultivo de tejidos durante cinco a siete días hasta que aparezcan células adheridas y alcancen una confluencia del 30 al 50 %, como se muestra aquí, cada dos días. Cambiar la mitad del medio transfiriendo cuidadosamente la mitad superior del medio a otro pocillo. Si las esferas celulares se transfieren al nuevo pocillo, añadir una cantidad igual de medio fresco.Verifique la confluencia de las células utilizando el microscopio invertido. Cuando las células alcancen una confluencia del 30 al 50 %, aspire el sobrenadante y resérvelo; luego, agregue un mililitro de medio de progenitor neural a cada pocillo para preparar una placa de respaldo utilizando las esferas presentes en el sobrenadante. Centrifugue el sobrenadante reservado a 170 × g durante 10 minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y resuspenda el botón celular en medio de progenitor neural; siembre las células en una placa de 24 pocillos recubierta con Matrigel.Como antes, cambie el medio en cada placa de células cada dos días hasta que las células alcancen una confluencia del 60 al 80%. Normalmente después de una semana. Una vez que las células alcancen la confluencia requerida, aspire el sobrenadante y agregue un mililitro de medio de células madre neural a cada uno.A continuación, disocie las células utilizando un raspador celular, seguido de una pipetación muy suave. Luego, transfiera las células de un pocillo de la placa de 24 pocillos a un pocillo de una placa de seis pocillos.Agregue otro mililitro de medio al pocillo y, tras repetir el procedimiento para todos los pocillos, coloque la placa de seis pocillos en el incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Cambie el volumen completo de medio cada dos días hasta que las células alcancen una confluencia del 60%, momento a partir del cual se deben disociar y repasar las células en una proporción de uno a tres, como se acaba de mostrar, para congelar una porción de células madre neurales indiferenciadas. Primero, prepare el medio de congelación para células madre añadiendo un 20% de dimetilsulfóxido o DMSO al medio de células madre neurales y colóquelo en hielo.Luego, disocie las células en la placa de seis pocillos utilizando un raspador celular y pipeteo suave. Reserve una alícuota de la suspensión para un recuento celular y luego centrifugue las células a 170 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mientras las células están centrifugándose, cuente las células en la alícuota de suspensión utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado y calcule el volumen de medio necesario para obtener una concentración celular de 1 × 10⁶ células por mililitro.Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en medio de células madre neurales a una concentración de un millón de células por mililitro. A continuación, añada un volumen igual de medio de congelación, pipeteando quinientos mil células en un volumen de un mililitro dentro de un vial criogénico y congele las células en un recipiente de congelación según las instrucciones del fabricante. Cuando las células madre neurales en la placa de seis pocillos alcancen el 80 % de confluencia, desprenda las células utilizando una espátula de goma y luego disocie mediante pipeteo suave.Reúna la suspensión celular en un tubo estéril. Cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado y ajuste la concentración de la suspensión celular a uno por diez a la quinta células por mililitro con medio para células madre neurales. Luego, pipetee un mililitro de la suspensión celular sobre un cubreobjetos recubierto con poli-D-lisina y laminina en un pocillo de una placa de 24 pocillos, después de repetir el procedimiento para el número deseado de pocillos.Incubar como antes durante 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, aspirar el medio y reemplazarlo por medio de diferenciación neural. Incubar durante dos semanas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, cambiando el medio dos veces por semana tras las dos semanas.Las células madre neuronales deben estar completamente diferenciadas como se muestra aquí y listas para aplicaciones posteriores, como la tinción de inmunofluorescencia. Las dos primeras imágenes muestran que las células madre neurales expresan nestina y SOX2. Mientras que la tercera imagen demuestra que OCT4 no se expresa, se utiliza DPI como marcador nuclear y la barra de escala representa 200 micrones.Después de seguir el protocolo de diferenciación descrito en el video, las neuronas diferenciadas expresan el marcador neuronal beta tres tubulina. Las células madre neurales humanas también pueden diferenciarse en células gliales. Cuando se diferencian en astrocitos, las células expresan el marcador astrocítico GFAP.Finalmente, en esta imagen, las células se han diferenciado en oligodendrocitos y expresan el marcador de oligodendrocitos O cuatro. Una vez dominada, la generación de células madre neurales humanas inducidas a partir de sangre periférica puede realizarse en aproximadamente tres semanas.Si se realiza adecuadamente, las células madre neurales podrían diferenciarse aún más en neuronas y eliminar el método mediante el cual se lleva a cabo el largo y complicado proceso de generación de IPS, lo que podría convertirse en una opción sencilla para generar cultivos neuronales específicos del paciente tras su desarrollo. Esta técnica abre un camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren modelos de cultivo celular individual para diversos trastornos neurológicos, lo que podría representar mejor las diferencias genéticas en trastornos específicos, especialmente a partir de muestras individuales de pacientes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Este video muestra la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) en células madre neurales inducidas (iNSCs) utilizando el virus de Sendai. El virus Sendai es un virus no integrador que ofrece un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación de células.

Generación de Células Madre Neurales Inducidas (iNSCs) a partir de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMNCs): Un Procedimiento Basado en el Virus de Sendai para Reprogramar PBMNCs en iNSCs

Este video muestra la reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas modificadas genéticamente en células madre neuronales. Los factores de transcripción expresados por las células progenitoras hematopoyéticas desencadenan una cascada de eventos moleculares que facilitan su transformación. Se utilizan otros medios específicos para seleccionar y cultivar células madre neuronales inducidas.

Reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas en células madre neurales

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

Proponemos un protocolo para reprogramar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Al colocar las células sanguíneas transducidas en placas recubiertas de matriz con centrifugación, las iPSC se inducen con éxito a partir de células flotantes. Esta técnica sugiere un protocolo de reprogramación simple y efectivo para células como PBMC y CBMC.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Aprende a inducir células madre neurales directamente desde células progenitoras hematopoyéticas CD34+ de sangre periférica mediante transfección con virus Sendai. Este método permite obtener neuronas, astroglía y oligodendrocitos para investigación en neurociencia y medicina regenerativa.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas (Video) | JoVE Journal

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

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