La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

El objetivo general de este procedimiento es inducir directamente células madre neurales a partir de células sanguíneas. Esto se logra enriqueciendo primero las células progenitoras hematopoyéticas positivas CD 34 de la sangre. El segundo paso es transfectar células CD 34 con el virus sendi que contiene factores transcripcionales.

A continuación, las células madre neurales se derivan utilizando un medio selectivo. El paso final es diferenciar las células madre neurales inducidas en neuronas, astroglía y oligodendrocitos. En última instancia, se utiliza la microscopía de inmunofluorescencia para caracterizar las células resultantes.

La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente, como la duración de las neuronas directamente de los fibroblastos, también la generación de IPS, es que este método evita el tedioso proceso de generación y cálculo de IPS, pero aún así proporciona una gran cantidad de células neuronales que pueden relacionarse, diferenciarse a las neuronas. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando me di cuenta de que las células CT 34 transfectadas adjuntas en realidad se muestran muy similares a las células neuroprógenas cultivadas primarias, lo que demuestra que el procedimiento será de Marines, un técnico de mi vida. Después de aislar las células CD 34 de las células mononucleares de sangre periférica de acuerdo con las instrucciones del protocolo de texto, comience el proceso de cultivo de las células CD 34 mediante Resus, suspendiendo las células CD 34 en medios CD 34 y luego siembre las células en una placa de 24 pocillos a tres veces 10 a la quinta célula por pocillo en un mililitro de medio.

Después de incubar durante 24 horas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono, recoja las células flotantes y centrifugue la suspensión celular a 110 veces G a temperatura ambiente. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio de mantenimiento CD 34 fresco. Vea una nueva placa de 24 pocillos a una vez 10 a la quinta celda por pocillo en un mililitro de medio, incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante cinco días adicionales, reemplazando la mitad del medio cada dos días.

Aspirando cuidadosamente la mitad superior del sobrenadante mientras las células CD 34 están en el fondo de los pocillos, como se muestra aquí en el quinto día. Después de la siembra, recoja las células CD 34 y centrifugue las células a 170 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente, deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células como antes y siembre una placa nueva de 24 pocillos a una vez 10 a la quinta célula por pocillo en un mililitro de medio. A continuación, descongele un kit de reprogramación Cyto Tune IPS Sendi.

Primero sumergiendo la parte inferior de los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 segundos y luego descongelándolos completamente a temperatura ambiente. Centrifuga brevemente los tubos y ponlos en hielo. Prepare la mezcla de virus Sendai mezclando el volumen recomendado de cada uno de los virus enumerados en el certificado de análisis para el lote correspondiente.

Se recomienda una multiplicidad de infección de 15. Agregue la mezcla de virus Sendai a cada pocillo de células CD 34. A continuación, mezcle los pocillos agitando suavemente el plato.

Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% después de 24 horas. Observe la eficiencia de la transducción. Tenga en cuenta que los agregados de células y las esferas como las que se muestran aquí son indicadores de una transducción exitosa.

A continuación, incube las células en la incubadora de cultivo de tejidos durante cinco a siete días hasta que aparezcan las células adheridas y alcancen un 30 a 50% de confluencia, como se muestra aquí cada dos días. Cambie la mitad del medio transfiriendo con cuidado la mitad superior del medio a otro pozo. Si las esferas celulares se transfieren a la nueva, agregue una cantidad igual de medio fresco.

Comprobar la cofluidez de las células utilizando el microscopio invertido. Cuando las células estén confluentes entre un 30 y un 50%, aspire el sobrenadante y reserve y luego agregue un mililitro de medio progenitor neural a cada pocillo para hacer una placa de respaldo usando las esferas en la centrífuga sobrenadante, el sobrenadante de reserva a 170 veces G durante 10 minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en una placa de medio progenitor neural en una placa de 24 pocillos recubierta de matrigel.

Al igual que antes, cambie el medio en cada placa de células cada dos días hasta que las células alcancen un 60 a 80% de confluencia. Por lo general, después de una semana. Una vez que las células alcancen la confluencia requerida, aspire el sobrenadante y agregue un mililitro de medio de células madre neurales a cada una.

A continuación, disocie las células mediante el uso de un raspador de células, seguido de un pipeteo muy suave. A continuación, transfiera las celdas de un pocillo de la placa de 24 pocillos a un pocillo de seis. Plato de pozo.

Agregue otro mililitro de medio al pocillo y después de repetir el procedimiento para todos los pocillos, coloque la placa de seis pocillos en la incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Cambie el volumen completo del medio cada dos días hasta que las células alcancen el 60% de confluencia, después de lo cual disocie y refline las células en una proporción de uno a tres, como se acaba de mostrar para congelar una porción de células madre neurales indiferenciadas. Primero, prepare el medio de congelación de células madre agregando un 20% de óxido de sulfo de dimetilo o DMSO al medio de células madre neurales y colóquelo en hielo.

A continuación, disocie las células de la placa de seis pocillos. Usando un raspador de células y pipeteo suave. Reserve una alícuota de la suspensión para un recuento de células y luego centrifugue las células a 170 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras las células están girando, cuente las células en la alícuota de suspensión utilizando un hemo, citómetro o contador de células automatizado y calcule el volumen de medio necesario para dar una concentración de células de uno por 10 a las seis células por mililitro.

Una vez finalizado el centrifugado, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en medio de células madre neurales a una vez 10 a las seis células por mililitro. A continuación, añada un volumen igual de pipeta de medio de congelación cinco veces 10 a la quinta célula en un volumen de un mililitro en un vial criogénico y congele las células en un recipiente de congelación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando las células madre neurales en la placa de seis pocillos alcancen el 80% de confluencia, sepárelas con un policía de goma y luego disocie mediante un pipeteo suave.

Agrupe la suspensión celular en un tubo estéril. Cuente las células utilizando un hemo, citómetro o contador de células automatizado y ajuste la concentración de la suspensión celular a una vez 10 a la quinta célula por mililitro con medio de células madre neurales. A continuación, pipetee un mililitro de la suspensión de la célula en un cubreobjetos recubierto de lisina poli D y laminado en un pocillo de una placa de 24 pocillos después de repetir el procedimiento para el número deseado de pocillos.

Incubar como antes durante 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, aspire el medio y reemplácelo con diferenciación neuronal. El medio, incubar durante dos semanas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, cambiando el medio dos veces por semana después de dos semanas.

Las células madre neuronales deben estar completamente diferenciadas, como se muestra aquí, y listas para aplicaciones posteriores, como la tinción de inmunofluorescencia. Las dos primeras imágenes muestran que las células madre neurales expresan anidamiento en y SOX dos. Mientras que la tercera imagen muestra que OCT cuatro no se expresa, DPI se utiliza como marcador nuclear y la barra de escala representa 200 micras.

Tras seguir el protocolo de diferenciación descrito en el vídeo, las neuronas diferenciadas expresan el marcador neuronal beta tres tubulina. Las células madre neurales humanas también se pueden diferenciar en células gliales. Cuando se diferencian en astrocitos, las células expresan el marcador astrocítico GFAP.

Finalmente, en esta imagen, las células se han diferenciado en oligodendrocitos y expresan el marcador de oligodendrocitos. O cuatro. Una vez dominada, la generación de células madre neurales humanas inducidas a partir de sangre periférica se puede realizar en aproximadamente tres semanas.

Si se realiza correctamente, las células madre neurológicas podrían ser neuronas más diferenciadas y poco claras por los largos y complicados procesos de generación de IPS y podría ser una opción fácil para generar cultivos neuronales específicos del paciente después de su desarrollo. Esta técnica es la vía para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren el modelado de cultivos celulares individuales para diversos trastornos neurológicos, que podrían representar mejor las diferencias genéticas en trastornos específicos, especialmente a partir de muestras de pacientes individuales.