Name: Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende manipulaciones ambientales para estudiar la plasticidad cerebral en ratones adultos mediante emparejamiento por género y enriquecimiento ambiental. Este método permite analizar cambios en neuronas dopaminérgicas mesencefálicas.

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Este estudio fue financiado por el 1022839 de subvenciones del Proyecto del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (NHMRC). AJH es un FT3 Future Fellow (FT100100835) del Consejo Australiano de Investigación (ARC). El Instituto Florey de Neurociencia y Salud Mental agradece el apoyo de la Subvención de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno de Victoria.

NOTA: Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Instituto Florey del Comité de Ética de Salud Animal Neurociencia y Salud Mental y se ajustan a Nacional de Salud de Australia y el Consejo de Investigación Médica publica código de prácticas para el cuidado y uso de animales para fines científicos (7ª edición, 2004). 1. Las manipulaciones ambientales <ol><li> El emparejamiento de Género <ol><li> Use la madurez sexual (&gt; 8 semanas de edad), hombres de la misma edad y ratones hembras. NOTA: normalmente utilizamos ratones C57BL / 6, pero hemos tenido los mismos resultados utilizando ratones Swiss en este protocolo. Utilizamos típicamente n = 8 hombres y n = 8 hembras para cada experimento, dividida en n = 2 pares entre varones (n = 4 machos), n = 2 pares hembra-hembra (n = 4 mujeres), y n = 4 parejas hombre-mujer (n = 4 machos y 4 hembras = n). </li><li> A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales, el grupo de la casa los ratones por género para&gt; 3 días para aclimatarse. Aquí y througHout el emparejamiento de género, a mantener los estímulos ambientales extraños (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones. </li><li> Aleatoriamente asignar cada ratón a un par macho-macho, un par hembra-hembra, o un par masculino-femenino. Coloque cada par en una jaula limpia en el aislamiento (2 ratones / jaula) con acceso ad libitum a comida y agua, y simplemente alojarlos en esta manera de forma continua durante 7 días. NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones. Tenga cuidado de evitar el emparejamiento de camada masculinos y femeninos. </li></ol></li><li> Enriquecimiento Ambiental <ol><li> Utilice (&gt; 8 semanas de edad), hombres o mujeres ratones de la misma edad sexualmente maduros. NOTA: Por lo general utilizamos n = 18 ratones para cada experimento, divididos en grupo n = 6 / tratamiento. </li><li> A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales ellos mantener encuentra alojada en grupo en la norma idéntica (SH) (por ejemplo, </em&gt; Ver más abajo) las condiciones en esta etapa durante&gt; 3 días para aclimatarse. Aquí y en todo el experimento, mantener los estímulos ambientales extraños (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones. </li><li> Para comenzar con el enriquecimiento ambiental, asignar aleatoriamente cada ratón a uno de los 3 grupos: SH; rueda de correr (RW), o el medio ambiente enriquecido (EE) y coloque cada grupo de ratones juntos en una jaula limpia idéntica con acceso ad libitum a comida y agua. NOTA: Aquí, jaulas más grandes de ratas celebración para todos los grupos, que miden 27 cm de ancho, 42 cm de largo y 16 cm de profundidad se utilizaron. <ol><li> Además, proporcionará las siguientes condiciones ambientales para cada grupo: SH comprende sólo la basura (pellets de papel o serrín) en el suelo; RW comprende SH más 2 ruedas de funcionamiento; EE comprende RW además de juguetes (cuerdas, escaleras, túneles, y objetos como rollos y trozos de papel de seda de toallas de papel vacío) con el que a explore, jugar, trepar, esconderse, y el nido. </li><li> Casa ellos de esta manera de forma continua durante 14 días. NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones. </li></ol></li><li> Ratones EE Sujeto a &#39;super-enriquecimiento&#39; adicional (SE) colocándolos juntos en una jaula más grande que contiene nuevos juguetes para 1 hora / día (la misma hora cada día), 5 días / semana. NOTA: Aquí, se utilizó una tina de plástico 46 cm de ancho, 69 cm de largo y 40 cm de profundidad. <ol><li> Mantener la novedad al presentar un conjunto diferente de juguetes cada sesión. Limpie los juguetes que se van a volver a ser presentados a los ratones con agua jabonosa y etanol al 80% para eliminar los olores. </li><li> Después de cada sesión de SE, devolver los ratones a su jaula EE. SH Mango y ratones RW igual que los ratones SE (a excepción de SE en sí) a lo largo de este período (por ejemplo, eliminar y volver cada SH y el ratón RW desde y hacia su jaula). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Preparación <ol><li> Utilice bombas osmóticas estériles y kits de infusión de cerebro, que están disponibles comercialmente. El día antes de la implantación, utilizando una técnica aséptica, primos los implantes llenando cada bomba, tubo y la cánula de conectar con una solución de fármaco o vehículo estéril (como se describe en las instrucciones suministradas con las bombas). Conectarlos entre sí y se incuba en solución salina estéril durante la noche a 37 ° C. Incubar implantes drogas y vehículos llenos por separado para evitar la contaminación cruzada. </li></ol></li><li> Cirugía. NOTA: En función del país del experimentador, se requieren permisos o autorizaciones de experimentación de animales especiales para perseguir ese tipo de cirugía y experimentos postoperatorias. <ol><li> Esterilizar todo el equipo quirúrgico y emplear una técnica aséptica en todo. Anestesiar el ratón (por ejemplo, utilizando 2.1% isofluorano en el aire) y colocarlo en un estéreocastillete otaxic. Compruebe la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento y administrar más anestésico si es necesario (por ejemplo, ausencia de retirada extremidad para pizca pata nociva es indicativo de una anestesia adecuada). Asegurar los ojos están protegidos de la desecación por pomada ocular lubricante, y que la temperatura corporal del ratón sigue siendo normal durante todo el procedimiento. </li><li> Hacer una incisión en la línea media a través de la piel a partir de entre los ojos y acabado de 2 cm por detrás del borde posterior del cráneo. Blunt diseccionar la piel lejos de la fascia subyacente en la parte posterior del ratón para crear un subcutánea &#39;bolsillo&#39; lo suficientemente grande como para caber cómodamente la bomba y el tubo de conexión una vez se implanta la cánula (el tubo de conexión no debe estar doblada sobre la terminación). Raspe borrar la fascia de más de la cara dorsal del cráneo. </li><li> El uso de una fresa dental de aproximadamente 1,5 mm de diámetro, profundizar en el cráneo en el estereotáxica apropiado coordina uasta una capa delgada, flexible de restos óseos. Peel esta capa de distancia utilizando unas pinzas finas (esto evita dañar la duramadre subyacente y el cerebro con la fresa dental). Asegúrese de que el cráneo se limpió de cualquier fragmento de sangre y hueso, y no que hay más sangrando. </li><li> Con la cánula en manos de un portador de cánula, coloque la bomba y el tubo de conexión en el &#39;bolsillo&#39; subcutánea que recubre la parte posterior del ratón. A continuación, la posición de la punta de la cánula en las coordenadas estereotáxicas apropiadas y en la superficie del cerebro. Baje con cuidado la cánula en el cerebro, pero dejar de aproximadamente 1 mm de cortos de la profundidad requerida. NOTA: La profundidad restante se negoció después de la aplicación de la primera capa de acrílico dental. </li><li> Asegúrese de nuevo la superficie del cráneo esté limpia y seca, y luego preparar un pequeño volumen de acrílico dental y usar un palillo de dientes para alisarlo sobre toda el área expuesta de cráneo, incluidos en la rebaba-agujero a través del cráneo alrededor ªe cánula. Antes de que el acrílico se endurece, baje la cánula de punta la profundidad restante en el objetivo. </li><li> Se prepara otro pequeño volumen de acrílico dental y la capa de esto sobre el primero, así como sobre el soporte plástico blanco para la cánula, para fijar la cánula en su lugar. Repita con capas adicionales de acrílico como necesario. </li><li> Una vez que el acrílico ha endurecido, retirar con cuidado el soporte de cánula y cortar el plástico pestaña cánula extraíble blanco con una hoja de bisturí calentado con una llama de butano. Por último, suturar la piel cerrado sobre todo el implante. </li></ol></li><li> Tratamiento post-quirúrgico de los Animales <ol><li> Aplicar ungüento antiséptico a los márgenes de la piel, y administrar un anti-inflamatorio para el ratón (por ejemplo, Meloxicam, 3 mg / kg sc). Retire el ratón desde el marco, colocarla bajo una lámpara de calor, y observar hasta que se recupera la conciencia. No devuelva un ratón que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. NOTA: Expmanipulaciones erimental como el emparejamiento entre los géneros y el enriquecimiento medio ambiente se pueden iniciar o reanudar el día después de la cirugía a la mayor brevedad. </li><li> Controlar su peso corporal, el comportamiento y el aspecto general diaria. Tratar signos de infección (por ejemplo, hinchazón, enrojecimiento, pus) alrededor de las incisiones quirúrgicas con ungüento antiséptico tópico. Tratar cualquier signos de enfermedad, el dolor, el estrés o malestar (por ejemplo, pérdida de&gt; 10% del peso corporal, el aislamiento social, la falta de preparación, &quot;esponjar&quot;, disfunción del movimiento, convulsiones) con analgésicos y / o antibióticos sistémicos como necesario. </li><li> La eutanasia a los ratones si la pérdida de peso&gt; 15% o síntomas de la enfermedad, el dolor, el estrés o malestar no son recuperables dentro de 1 semana de tratamiento curativo. </li></ol></li></ol> 3. Tejido Cerebral Preparación, producción inmunohistoquímica, y Estereología <ol><li> Perfusión <ol><li> Inmediatamente después de manipulaciones / drogas ambientales, preparar el cerebro para el estudio. <br/&gt; NOTA: En los experimentos publicados aquí se mide y se compara en cada uno de los diferentes grupos de tratamiento el número de TH + SNc neuronas. </li><li> Primera administrar una sobredosis de anestesia para matar los ratones (por ejemplo, 100 mg / kg ip de sodio pentobarbital). Una vez anestesiado, pero antes de que el corazón deja de latir, poner el ratón sobre su espalda y corbata o precisar ambas extremidades anteriores. </li><li> Usando un escalpelo cortó la piel que recubre el tórax entonces incise a través del músculo justo debajo de la caja torácica en la cavidad abdominal. Coloque una abrazadera en el proceso xifoides de la caja torácica y levantar la caja torácica hacia arriba y lejos del hígado exponer el diafragma. </li><li> Corte a través del diafragma y por medio de las costillas lateralmente en ambos lados con grandes tijeras hasta que la caja torácica se puede plegar hacia atrás la cabeza para exponer los pulmones y el corazón. Con unas tijeras finas hacen una pequeña incisión en la aurícula derecha como un punto de salida para la sangre y soluciones perfundidos, luego se corta a través de la base de la Ventri izquierdaCLE y colocar una cánula a través del ventrículo izquierdo, la aurícula izquierda, y en la aorta. </li><li> Sujetar la cánula en su lugar a continuación, la bomba caliente (37 ° C) heparinización y 0,1 M tampón fosfato salino fisiológico (PBS) a través de la vasculatura hasta que la solución que sale de la aurícula derecha es totalmente libre de sangre. A continuación, la bomba de frío (4 ° C) solución de fijación (tales como 4% de paraformaldehído en PBS) a través de la vasculatura hasta que todo el ratón está bien fijado. Retire el cerebro y el lugar en PBS con 30% de sacarosa durante 2-3 días hasta que los sumideros cerebrales. NOTA: Otros tipos de preparación de tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el laboratorio correspondiente. </li></ol></li><li> Preparación de criosecciones de flotación libre <ol><li> Cortar secciones de serie a través de las regiones cerebrales de interés y recoger estos en PBS. NOTA: Cortamos 40 micras de espesor secciones usando un criostato. Otros tipos de seccionar los tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el corresponding de laboratorio. </li></ol></li><li> La inmunohistoquímica <ol><li> Realizar inmunohistoquímica estándar para proteínas de interés. Incubar las secciones en 5% de suero normal de cabra y 0.3% de Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 30 min, a continuación, inmunorreaccionan con policlonal de conejo anti-TH (1: 400) a 4 ° C durante 48 horas, a continuación, policlonal de cabra anti biotinilado -rabbit (1: 1000) a temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> A continuación, se incuban en avidina-peroxidasa (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, en cobalto y diamino-bencidina níquel-intensificado (0,5 mg / ml) a temperatura ambiente durante 18-20 min; para el último 3-5 min de la incubación diamino-bencidina añadir peróxido de hidrógeno (0,01%) para catalizar la precipitación cromógeno. Lavar las secciones tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS antes de, después de, y entre cada uno de los pasos anteriores. </li><li> Montar las secciones en portaobjetos gelatinizados, aire los seque, luego mancha Nissl (rojo neutro), deshidratar en alcohol, claro (X-3B), y tapar. </li></ol></li><li&gt; Estereología <ol><li> Estimar el número total de neuronas TH + y TH SNc (LC y VTA) y usando métodos estereológicos imparciales. Asegúrese de que el stereologist es ciega al tratamiento recibido. Excluir glia sobre la base de diámetro soma &lt;5 micras y contar sólo aquellas células con un núcleo visible. </li><li> Identificar la SNC (y VTA y LC) por las localizaciones espaciales de células TH + y referencias anatómicas / límites de acuerdo con el atlas del cerebro de Paxinos y Watson 7. Contar + células TH dentro de un marco de cuenta (55 x 55 micras = 3,025 micras 2) a intervalos predeterminados regulares (x = 140 m, y = 140 m para SNc; x = 100 m, y = 100 m para VTA y LC) a través de cada núcleo en cada cuarta sección. </li></ol></li></ol>

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<li>Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+preference+for+nesting+material+as+environmental+enrichment+for+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Animal+Behaviour+Science%22%5BJournal%5D)">Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice.</a> Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Manipulaciones ambientales La motivación detrás del diseño de estas manipulaciones ambientales (emparejamiento de género y de enriquecimiento ambiental) fue determinar si el medio ambiente y / o la conducta motivada por el medio ambiente, se asocia con cambios en el número de neuronas DA mesencéfalo. La atención se centró por tanto en proporcionar entornos y estimular comportamientos que son propensos a participar señalización DA mesencéfalo. Estos maridaje incluido con el sexo opue...

DArgic de señalización por las neuronas en el área ventral tegmental (VTA) y substantia nigra pars compacta (SNc) del mesencéfalo se piensa que es importante para los comportamientos cognitivos, emotivos y de motor de recompensa-motivados. Sin embargo, la señalización DA mesencéfalo demasiado o demasiado poco causa muchos síntomas incapacitantes en una variedad de trastornos neurológicos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción). Las drogas que aumentan o disminuyen DA señalización aliviar estos síntomas, sin embargo, también producen efectos secundarios atribuibles a la señalización desregulada y fuera de objetivo efectos. La eficacia del fármaco también disminuye con el tiempo debido a las respuestas compensatorias del cerebro. Por tanto, el reto es restaurar la señalización de DA del cerebro medio normal de manera más específica y fisiológica, y un enfoque preferido es aumentando o disminuyendo el número de neuronas DA del cerebro medio. La evidencia ha ido acumulando para sevdécadas va- que la expresión de genes y proteínas implicados en el metabolismo y DA trata y otras catecolaminas en células adultas madura es modificable (revisado en 1). En el mesencéfalo, el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de las neuronas DA) disminuye luego aumenta después de la administración de neurotoxina 2,3, mientras que el número de TH immunonegative (TH) neuronas muestra el patrón opuesto (es decir, aumenta luego disminuye 3). Esto es consistente con la pérdida de entonces ganancia de la &#39;DA fenotipo&#39; por algunas células. El número de neuronas TH + y TH SNc También se ha demostrado que cambiar en direcciones iguales pero opuestas después de diversos tratamientos que alteran la actividad eléctrica de estas células a 4,5. Por ejemplo, la infusión de la pequeña conductancia, potasio activado por calcio (SK) canal apamina antagonista en cerebro medio durante 2 semanas disminuye el número de TH + y aumenta (en la misma cantidad) la numbre de TH SNc neuronas 4,5. En contraste, la infusión de la SK agonista de canal de 1 EBIO aumenta el número de TH + y disminuye (en la misma cantidad) el número de neuronas TH SNc 4,5. Se observaron cambios similares después de una gran variedad de tratamientos dirigidos actividad neuronal SNc, incluyendo algunos que dirige impulsos aferentes 4. Esta aparente regulación del número de neuronas SNc DArgic por la actividad neuronal aferente de entrada y plantea la posibilidad de que el medio ambiente o el comportamiento pueden influir en el número de neuronas del SNC. De hecho ratones adultos expuestos a diferentes ambientes tienen más o menos cerebro medio (SNc y VTA) TH + neuronas, y al menos algunos de estos cambios inducidos por el medio ambiente se abolido por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en el cerebro medio 6. Los objetivos de esta comunicación son: (1) proporcionar más detalles sobre la forma de aplicar nuestras manipulaciones ambientales e infusiones de drogas; y (2) proporcionar más datos que apoyan nuestra afirmación de que el embiente regula el número de neuronas DA del cerebro medio, a través de los impulsos aferentes.

<table><tbody><tr><td>Isofluorano</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>Bomba osmótica ALZET 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Kit de infusión cerebral 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para cánula ALZET 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Autopolimerizable (disolvente acrílico dental)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Países Bajos</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing (polvo acrílico dental)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Países Bajos</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitona sódica</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, Nueva Gales del Sur, Australia</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26 litros</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sede de Merck Millipore&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Conejo policlonal anti-tirosina hidroxilasa</td><td>Sede de Merck Millipore&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Cabra biotinilada policlonal anti-conejo</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidin peroxidasa</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-bencidina</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Investigador estereoscópico</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

modulaciones ambientales del número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Cambios duraderos en el cerebro o la &quot;plasticidad cerebral&quot; subyacen a la conducta adaptativa y la reparación cerebral después de una enfermedad o lesión. Por otra parte, las interacciones con el medio ambiente pueden inducir plasticidad cerebral. Cada vez más, la investigación está tratando de identificar qué entornos estimular la plasticidad del cerebro beneficioso para el tratamiento de trastornos del cerebro y del comportamiento. Dos manipulaciones ambientales que se describen aumentar o disminuir el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la dopamina (DA) de síntesis) neuronas en el cerebro medio del ratón adulto. El primero comprende macho emparejamiento y ratones hembra juntos de forma continua durante 1 semana, lo que aumenta TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente 12% en los hombres, pero disminuye TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 12% en las mujeres. El segundo comprende los ratones de vivienda de forma continua durante 2 semanas en &#39;ambientes enriquecidos &quot;(EE) que contienen ruedas corriendo, juguetes, cuerdas, material de nidificación, etc., que increases TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 14% en los hombres. Además, un protocolo se describe para infundir simultáneamente fármacos directamente en el cerebro medio durante estas manipulaciones ambientales para ayudar a identificar los mecanismos subyacentes plasticidad cerebral inducida por el medio ambiente. Por ejemplo, EE-inducción de más TH + neuronas del cerebro medio es abolida por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en las neuronas del cerebro medio. En conjunto, estos datos indican que la información sobre el medio ambiente se transmite a través de la entrada sináptica de las neuronas del cerebro medio para activar o desactivar la expresión de los genes &#39;da&#39;. Por lo tanto, la estimulación ambiental apropiada, o fármaco que se dirige de los mecanismos subyacentes, podría ser útil para el tratamiento de trastornos cerebrales y conductuales asociados con desequilibrios en el cerebro medio DA (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, el déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción).

Los ratones adultos sometidos a estas manipulaciones ambientales han alterado los números de cerebro medio (SNC y VTA), pero no LC, neuronas TH +, y EE más infusión cerebro medio concurrente de ambos picrotoxina o bicuculina (GABA antagonistas del receptor) suprime EE-inducción de más SNc TH + neuronas. Estos datos fueron publicados previamente en 6. Los datos actuales se compilaron en replicar experimentos realizados como parte de ese estudio previo, pero no se han publicado en otros lugares. ...

Este protocolo describe dos manipulaciones ambientales diferentes y un protocolo de infusión cerebral concurrente para estudiar los cambios cerebrales inducidos por el medio ambiente que subyacen al comportamiento adaptativo y la reparación cerebral en ratones adultos.

Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en proporcionar situaciones ambientales controladas que estimulen la plasticidad cerebral y los cambios conductuales en ratones. Esto se logra alojando a los ratones en parejas macho-hembra frente a parejas de control macho-macho y hembra-hembra para estudiar los efectos del emparejamiento prolongado por sexo en el cerebro; como alternativa, los ratones pueden alojarse juntos en jaulas llenas de diversos objetos para explorar y jugar, en comparación con jaulas estándar, con el fin de estudiar los efectos del enriquecimiento ambiental en el cerebro. Otros tratamientos, como la administración de fármacos, pueden añadirse a estas estimulaciones ambientales para ayudar a identificar los mecanismos subyacentes a los cambios cerebrales y conductuales observados.Los resultados muestran que estos enriquecimientos y tratamientos ambientales inducen cambios en el número de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo que dependen de la transmisión sináptica GABAérgica del mesencéfalo. El enriquecimiento ambiental es un paradigma que aumenta la estimulación somatosensorial, motora y cognitiva en ratones. Mediante este enfoque, estudios han demostrado un aumento de la neuroplasticidad y también mejoras en el aprendizaje y la memoria en muchos modelos de enfermedad.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión de los mecanismos de la plasticidad cerebral adulta provocados por influencias ambientales. Y esto es relevante para tratar muchas de estas enfermedades del cerebro y la mente. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que el número de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo cambia en respuesta a la alteración de la actividad neuronal del mesencéfalo inducida por entradas sinápticas.La demostración visual de la bomba osmótica y de la cánula de infusión cerebral puede ser fundamental, ya que estos procedimientos pueden ser bastante difíciles de aprender. Descripciones escritas para el emparejamiento por sexo. Mantenga en grupo ratones macho y hembra sexualmente maduros, apareados por edad y por sexo, evitando camadas; coloque aleatoriamente cada ratón en un par macho-macho, un par hembra-hembra o un par macho-hembra, en una jaula limpia y en aislamiento, con acceso ad libitum a alimento y agua aquí y durante todo el emparejamiento por sexo.Mantenga constantes todos los estímulos ambientales ajenos o distribúyalos por igual entre todos los ratones, y aloje continuamente a los animales durante siete días. Para el enriquecimiento ambiental, asigne aleatoriamente ratones machos o hembras sexualmente maduros y con edades compatibles a uno de tres grupos: alojamiento estándar, rueda para correr o ambiente enriquecido durante al menos tres días. Manténgalos de esta manera.Con acceso ad libitum a alimento y agua durante 14 días. Durante el enriquecimiento ambiental, la jaula convencional debe contener solo cama. La jaula con rueda de ejercicios debe tener cama más dos ruedas de ejercicios, y la jaula con enriquecimiento ambiental debe tener cama, dos ruedas de ejercicios y juguetes.Someta a los ratones con enriquecimiento ambiental a un superenriquecimiento adicional colocándolos juntos en una jaula más grande que contenga juguetes novedosos durante una hora al día. Al mismo tiempo cada día, durante cinco días a la semana, devuelva a los ratones a su jaula con enriquecimiento ambiental. Después de cada sesión, mantenga la novedad presentando un conjunto diferente de juguetes para cada sesión.Limpie cualquier juguete que se vaya a presentar a los ratones con agua jabonosa y etanol al 80 %. Para eliminar cualquier olor, desplace los grupos de ruedas de ejercicio y alojamiento estándar de la misma manera y durante un periodo de tiempo similar cada día, pero sin añadir los materiales de enriquecimiento adicional el día anterior a la implantación. Utilizando técnica aséptica, llene cada bomba osmótica estéril, tubo de conexión y cánula con solución estéril del fármaco o del vehículo según las instrucciones del fabricante.Luego, conecte las piezas entre sí e incúbelas durante la noche en solución salina estéril a 37 grados Celsius el día de la cirugía. Después de confirmar la sedación mediante el pellizco de la cola, aplique pomada oftálmica al animal y colóquelo en posición supina sobre una almohadilla térmica. A continuación, utilizando técnica aséptica, realice una incisión media a través de la piel, comenzando dos centímetros posteriores al borde posterior del cráneo y terminando entre los ojos; separe cuidadosamente la piel de la fascia subyacente hacia la parte posterior del ratón, creando un bolsillo subcutáneo lo suficientemente grande como para alojar cómodamente la bomba y el tubo de conexión.Luego, raspe la fascia para limpiarla por encima del aspecto dorsal del cráneo y utilice una fresa dental de aproximadamente 1,5 milímetros de diámetro para perforar el cráneo en las coordenadas estereotáxicas adecuadas hasta que quede una capa delgada y flexible de hueso; retire esta capa con pinzas finas. Una vez que el cráneo esté libre de sangre y fragmentos óseos y no haya más sangrado, use un portacánulas para colocar la bomba y el tubo de conexión en el bolsillo recién creado. Ahora coloque la punta de la cánula en las coordenadas estereotáxicas adecuadas sobre la superficie del cerebro y luego baje cuidadosamente el tubo hacia el cerebro, un milímetro por encima de la profundidad requerida.Asegúrese de que la superficie del cráneo esté limpia y seca nuevamente, y luego use un palillo para alisar acrílico dental recién preparado sobre toda el área expuesta del cráneo, incluyendo el orificio de trepanación alrededor de la cánula antes de que el acrílico se endurezca. Baje la punta de la cánula la profundidad restante hasta el objetivo. Luego, cuando la cánula esté en su lugar, aplique cuidadosamente una segunda capa de acrílico dental recién preparado sobre el cráneo, así como sobre el soporte de plástico blanco para fijar la cánula en su posición.Una vez que el acrílico haya endurecido, retire cuidadosamente el soporte de la cánula y use una hoja de bisturí calentada para fundir la lengüeta plástica de la cánula. Luego, sutúre la piel cerrando completamente el implante. Aplique una pomada antiséptica sobre los márgenes de la piel y administre un antiinflamatorio al animal.Finalmente, retire el ratón del marco. Colóquelo bajo una lámpara de calor y supervise al animal hasta que se recupere completamente. Los ratones machos adultos apareados con ratones hembra adultas durante siete días tienen aproximadamente un 12 % más de neuronas en el área SNC positivas para tirosina hidroxilasa en el mesencéfalo que los machos apareados con machos.Por el contrario, las hembras emparejadas con machos tienen aproximadamente un 12 % menos de neuronas TH positivas en la SNC que las hembras emparejadas con hembras. El número de neuronas TH positivas en la SNC y en el área tegmental ventral también aumenta en ratones machos adultos sometidos a un emparejamiento en entorno enriquecido más superenriquecimiento durante 14 días. Con el enriquecimiento ambiental más superenriquecimiento, los animales que recibieron infusión de vehículo mostraron aproximadamente un 14 % más de neuronas TH positivas en la SNC.Luego, los animales criados bajo condiciones estándar infundidos con vehículo y los animales sometidos a un alojamiento ambientalmente enriquecido más un enriquecimiento superior con infusión de antagonista del receptor gabaa, sin embargo, no presentan este aumento. Al intentar manipulaciones ambientales, es importante recordar minimizar al mínimo cualquier perturbación para los animales, como mantener el ruido al mínimo y evitar cambios de jaula. Con demasiada frecuencia, al configurar un ambiente enriquecido, es fundamental incluir materiales variados para el nido y mantener constante el lugar del nido para minimizar el estrés en sus animales.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular el entorno de ratones adultos para inducir cambios en el cerebro y el comportamiento. No olvide que, al trabajar con fármacos, estos pueden ser extremadamente peligrosos; por lo tanto, siempre use ropa protectora al preparar las bombas osmóticas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Primaria disociada del cerebro medio de cultivos celulares permiten la dopamina para el estudio de las características pre-sináptica de las neuronas dopaminérgicas. Pueden ser utilizados para monitorear en tiempo real la cinética de la liberación de dopamina y de la proteína / niveles de ARNm de los reguladores de la exocitosis de dopamina. Aquí te mostramos cómo generar estas culturas de los recién nacidos de roedores.

Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

Un protocolo para realizar unilaterales 6-OHDA lesiones del haz medial del cerebro anterior en ratones se ha descrito. Este método tiene una baja tasa de mortalidad (13,3%) con el 89% de los animales sobrevivientes que muestran la pérdida de&gt; 95% de la dopamina estriatal y 90,63 ± -4,02% sesgo ipsiversive de rotación hacia el lado de la lesión.

Desarrollo de una manera unilateral-lesionado 6-OHDA modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson

La dopamina está claramente regulado en los núcleos del cerebro medio, que contiene la celda de los cuerpos y las dendritas de las neuronas de dopamina. Aquí se describe un método de disección y manejo de la muestra-para maximizar los resultados, y por lo tanto las conclusiones y puntos de vista, sobre la regulación de la dopamina en el núcleo del cerebro medio de la sustancia negra (SN) y el área tegmental ventral (VTA) en los roedores.

Perfiles Integral del Reglamento de la dopamina en la sustancia negra y el área tegmental ventral

En las enfermedades y trastornos del movimiento de Parkinson en general, los ensayos de comportamiento sensibles y fiables son esenciales para probar nuevas terapias potenciales. A continuación, describimos una batería manejable de pruebas sensoriomotoras de ratones que son sensibles a los diferentes grados de lesión en el sistema nigroestriatal y útil para los estudios preclínicos.

Evaluación de la función sensoriomotora en modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson

Se describen métodos para la manipulación y análisis de NF-kappa B dependiente de neurogénesis en el hipocampo adulto. Un protocolo detallado se presenta para una prueba de comportamiento circunvolución dentada-dependiente (denominado el patrón espacial de separación-Barnes laberinto) para la investigación de resultado cognitivo en ratones. Esta técnica también debería ayudar a permitir investigaciones en otros parámetros experimentales.

Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

Las isoenzimas de la lipooxigenasa (LOX) pueden generar los productos que pueden aumentar o disminuir la neuroinflamación y el neurodegeneration. Un estudio de la interacción gen-ambiente podría identificar efectos isoenzima-específicos de LOX. Usando el modelo 1 methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) del daño nigrostriatal en dos líneas transgénicas isozyme-deficientes de LOX permite la comparación de la contribución de isozymes de LOX en integridad y la inflamación dopaminérgicas.

Modelos De Interacción Gen-Ambiente Para Desenmascarar Los Mecanismos De Susceptibilidad En La Enfermedad De Parkinson

Las neuronas dopaminérgicas desempeñan un papel regulador vital en el cerebro. Su pérdida se asocia con la enfermedad de Parkinson. En este vídeo, mostramos cómo generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas centrales a partir de mesencéfalo de ratón embrionario. Tales cultivos son útiles para estudiar la extrema vulnerabilidad de estas neuronas a diversos estreses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Absorción de la dopamina Synaptosomal y cromatografía líquida de alto rendimiento representan experimental las herramientas de análisis para investigar la homeostasis de la dopamina en ratones mediante la evaluación de la función de transportador de la dopamina y los niveles de dopamina en el tejido estriado, respectivamente. Aquí presentamos los protocolos para medir contenido de tejido de dopamina y evaluar la funcionalidad del transportador de dopamina.

Evaluación de la Homeostasis dopaminérgica en ratones por medio de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento y absorción de la dopamina Synaptosomal

Este trabajo presenta un protocolo paso a paso para la estimación imparcial estereológicos del número de células neuronales dopaminérgicas en la sustancia negra de ratón utilizando equipo de microscopía estándar (es decir, un microscopio de luz, una tabla de objeto motorizado (x, y, z plano) y software de dominio público para el análisis de imagen digital.

Estereológicos estimación de número de la neurona dopaminérgica en el Nigra del Substantia de ratón usando el fraccionador óptico y equipo de microscopía estándar

Desarrollamos un modelo de estrés de derrota social acelerado para ratones C57BL/6 adolescentes, que funciona tanto en machos como en hembras y permite la exposición durante períodos discretos de la adolescencia. La exposición a este modelo induce la evitación social, pero solo en un subconjunto de ratones machos y hembras derrotados.

Modelo de Estrés de Derrota Social para Ratones Adolescentes C57BL/6 Machos y Mujeres

Aprende manipulaciones ambientales para estudiar la plasticidad cerebral en ratones adultos mediante emparejamiento por género y enriquecimiento ambiental. Este método permite analizar cambios en neuronas dopaminérgicas mesencefálicas.

Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

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