Name: El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprende la cicloadición Diels-Alder bioortogonal para imagen PET pretargeted en cáncer colorrectal usando anticuerpos TCO y radioligandos de tetrazina. Este método mejora el contraste tumoral y reduce la dosis de radiación.

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Los autores agradecen al Prof. Ralph Weissleder, al Dr. Pat Zanzonico y al Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty por sus útiles conversaciones y a los NIH por su financiación (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ÉTICA DECLARACIÓN: Todos los experimentos con animales en vivo descritos fueron realizados de acuerdo con un protocolo aprobado y bajo las directrices éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). 1. Síntesis de Tz-Bn-NOTA <ol><li> En un pequeño recipiente de reacción, se disuelven 7 mg NH 2--Bn NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) en 600 l de NaHCO3 tampón (0,1 M, pH 8,1). Comprobar el pH de la solución. Si es necesario, ajustar el pH de la solución a 8,1 usando pequeñas alícuotas de 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Añadir la solución de NH 2--Bn NOTA a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. NOTA: El Tz-NHS o bien se puede pesar a cabo en seco o se añade de una solución madre de DMF seco o DMSO (&lt;50 l). </li><li> Dejar que la solución de reacción resultante reaccionara durante 30 min a RTcon agitación suave. </li><li> Después de 30 min, purificar el producto mediante cromatografía de C 18 HPLC de fase inversa para eliminar sin reaccionar NH 2--Bn NOTA. El NH 2 -Bn-NOTA puede ser monitoreado en una longitud de onda de 254 nm, mientras que el Tz-NHS y Tz-Bn-NOTA están mejor controlados a una longitud de onda de 525 nm. NOTA: Los tiempos de retención son, evidentemente, muy dependiente de la configuración del equipo de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.). Sin embargo, para presentar un ejemplo, si un gradiente de 0: 100 MeCN / H 2 O (ambos con 0,1% TFA) a 100: 0 MeCN / H 2 O durante 25 min y una columna analítica 4,6 x 250 mm C 18 se utiliza , los tiempos de retención de Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, y NH-2 -Bn NOTA será de alrededor de 15 min, 16,5 min y 10 min, respectivamente. El producto puede ser purificado de los otros componentes de la reacción, ya sea en una sola carrera o carreras múltiples utilizando una columna de HPLC C 18 semi-preparativa o preparativa. 1 H-NMR, analytical HPLC y ESI-MS son todos los métodos que se pueden utilizar para verificar la pureza del precursor Tz-Bn-NOTA completado. 11 </li><li> Congelar el eluyente HPLC recogido utilizando nitrógeno líquido. </li><li> Envolver el tubo de recogida de congelados en papel de aluminio opaca. </li><li> Colocar el tubo de recogida congelado en un recipiente de liofilización de O / N para eliminar la fase móvil de HPLC. </li><li> Almacenar el producto purificado (un rosa brillante sólido) en la oscuridad a -80 ° C. NOTA: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El precursor Tz-Bn-NOTA completado es estable durante al menos 1 año en estas condiciones. </li></ol> 2. Preparación de huA33-TCO Inmunoconjugado <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 1 mg / ml (2,7 mM) de solución TCO-NHS en DMF seca. </li><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 2 mg / ml (13,3 mM) de huA33 en 1 ml de tampón fosfato salino, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-, </sub&gt; 0,154 M NaCl). </li><li> El uso de pequeñas alícuotas (&lt;5 mu l) de 0,1 M Na 2 CO 3, ajustar el pH de la solución de anticuerpo a 8,8-9,0. Utilice papel de pH o un medidor de pH con un microelectrodo para monitorear el pH, y tener cuidado de no permitir que el pH se eleve por encima de pH 9,0. </li><li> Una vez que la solución de anticuerpo está en el pH correcto, añadir un volumen de la solución TCO-NHS correspondiente a 8 equivalentes molares del éster activado. Por ejemplo, añadir 7,9 l de la solución de 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) a los 1 ml de solución de 2 mg / ml de anticuerpo huA33 (1,33 x 10 -8 mol huA33). No superar el 5% de DMF en volumen en la solución. </li><li> Mezclar suavemente la solución invirtiendo el tubo de microcentrífuga varias veces. </li><li> Envuelva el tubo de microcentrífuga en papel de aluminio opaco. </li><li> Deje que la solución se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Después de 1 hora a temperatura ambiente, purificar el inmunoconjugado resultante utilizando un siz desechable preenvasadose exclusión columna de desalación. En primer lugar, enjuagar la columna de exclusión de tamaño como se describe por el proveedor para eliminar cualquier conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento. A continuación, añadir la mezcla de reacción a la columna de exclusión por tamaño, enjuagar la columna con 1.5 ml 0.9% de solución salina estéril, y posteriormente recoger el producto usando 2 ml de 0,9% de solución salina estéril como eluyente. NOTA: Este paso será dar el terminado huA33-TCO como una solución de 2 ml. </li><li> Medir la concentración de la resultante huA33-TCO en un espectrofotómetro UV-Vis. </li><li> Si se desea una mayor concentración, concentrar la solución huA33-TCO utilizando una unidad de filtro centrífugo con un peso molecular 50.000 de corte. NOTA: Es importante observar que mientras que huA33 y una variedad de otros anticuerpos conocidos (por ejemplo, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, y J591) son muy tolerantes de concentrarse, la agregación y la precipitación pueden ocurrir después de la concentración en otros casos. Los investigadores de intentar este procedUre con un nuevo anticuerpo debe confiar en la literatura o su propio conocimiento del anticuerpo en cuestión con respecto a si es o no concentrar el anticuerpo. </li><li> Guarde el inmunoconjugado huA33-TCO completado a 4 ° C en la oscuridad. NOTA: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El conjugado de mAb-TCO completado debe ser estable durante al menos 3 meses en estas condiciones de almacenamiento. </li></ol> 3. 64 Cu radiomarcaje de Tz-Bn-NOTA NOTA: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos - o la realización de cualquier otro trabajo con radiactividad - investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante. <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar una 0,5 mg / ml (723 mM) de solución de Tz-Bn-NOTA. </li><li> En una MicroC 1,7 mltubo entrifuge, añadir 10 l de la solución Tz-Bn-NOTA (5 mg) a 400 l de NH4OAc 0,2 M, pH 5,5. </li><li> En aras de la radioquímica nota de mantenimiento de la correcta, medir y registrar la cantidad de radiactividad en la muestra usando un calibrador de dosis antes y después de los pasos siguientes en el protocolo a continuación (3.4 a 3.8). Esto le ayudará con la determinación precisa de los rendimientos de radioquímica. </li><li> Agregar 2000 Ci (74 MBq) de 64 Cu a la solución Tz-Bn-NOTA. NOTA: Típicamente, [64 Cu] CuCl 2 se suministra en un volumen pequeño (&lt;30 l) de HCl 0,1 N, y por tanto sólo pequeños volúmenes (&lt;10 l) de esta solución madre se necesitan para la reacción de radiomarcado. Si se necesitan mayores volúmenes de la [64 Cu] CuCl 2 stock, la reacción de radiomarcaje es tolerante de aumentar el volumen de reacción total. Sin embargo, el pH de la solución de reacción de radiomarcaje debe controlarse cuidadosamente para asegurarque no caiga por debajo de pH 4,0. </li><li> Deje que la solución se incuba durante 10 min a TA con agitación suave. </li><li> Después de 10 min de incubación, purificar el producto mediante cromatografía de HPLC de fase inversa C 18. Los tiempos de retención son, evidentemente, muy dependiente de la configuración del equipo de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.). Sin embargo, para presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN / H 2 O (ambos con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN / H 2 O durante 15 min se utiliza, el tiempo de retención de 64 Cu-Tz- Bn-NOTA debe estar alrededor de 9,8 minutos, mientras gratis, no acomplejada 64 Cu eluirá con el frente del disolvente en torno a 2-4 min. </li><li> Usando un evaporador rotatorio, retire el eluyente HPLC. </li><li> Se vuelve a disolver el producto 64 Cu-Tz-Bn-nota en el 0,9% de solución salina estéril. NOTA: Dado el 12,7 hr vida media física de 64 Cu, esto no es un punto de parada aceptable en el procedimiento. Realizar la síntesis de 64 Cu-Tz-Bn-NOA inmediatamente antes de la inyección del radioligando, y seguir paso a paso inmediatamente 3,7 4,5. </li></ol> 4. En Vivo Pretargeted TEP NOTA: Como en la sección Protocolo 3, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante. <ol><li> En un ratón atímicos hembra, implante subcutáneamente 1 x 10 células de cáncer colorrectal 6 SW1222 y permita que éstas se conviertan en un xenotrasplante 100-150 mm 3 (9-12 días después de la inoculación). 11 </li><li> Diluir una alícuota de la solución huA33-TCO de la sección Protocolo 2 a una concentración de 0,5 mg / ml en 0,9% de solución salina estéril. </li><li> Inyectar 200 l de la solución huA33-TCO (100 g) en la vena de la cola del ratón de xenoinjerto de soporte. </li><li> Permita 24 horas para la acumulación de la huA33-TCO en el tumor del ratón. </li><li> Diluir el 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligando a una concentración de 1,5 mCi / ml en 0,9% de solución salina estéril. </li><li> Inyectar 200 l de la solución de radioligando Cu-Tz-Bn-NOTA 64 (300 Ci; 11,1 MBq; 1,6 nmol de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, asumiendo una actividad específica de 6,7 MBq / nmol) en la vena de la cola de la xenoinjerto ratones portadores. </li><li> En el punto de tiempo de formación de imágenes deseado (por ejemplo, 2, 6, 12, o 24 horas después de la inyección), anestesiar al ratón con un isoflurano 2%: mezcla de gas de oxígeno. </li><li> Coloque el ratón sobre la cama del pequeño escáner PET animal. Mantener la anestesia durante el análisis utilizando un isoflurano al 1%: mezcla de gas de oxígeno. Antes de colocar el animal en el escáner, verifique la anestesia utilizando el método del dedo del pie-pinch y aplicar ungüento veterinario a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la anestesia. </li><li> Adquirir los datos de PET para el ratón a través de una estáticaescanear con un mínimo de 20 millones de eventos coincidentes utilizando una ventana de energía de 350-700 keV y una ventana de tiempo coincidencia de 6 nseg. Después de completar la adquisición de la imagen, no deje el ratón sin atención y no lo coloque en una jaula con otros ratones hasta que se haya recuperado la conciencia. </li></ol>

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<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
<li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting%3A+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La principal ventaja de esta estrategia de formación de imágenes PET pretargeted es que es capaz de delinear los tumores con contraste de la imagen-objetivo a fondo a sólo una fracción de la dosis de radiación de fondo producida por los anticuerpos marcados directamente. Por ejemplo, en el sistema de imágenes de cáncer colorrectal se describe aquí, se emplearon datos de los experimentos de biodistribución agudos para realizar cálculos de dosimetría para la estrategia de predireccionamiento a base de Cu 64 jun...

Durante los últimos treinta años, la tomografía por emisión de positrones (PET) se ha convertido en una herramienta clínica indispensable en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Los anticuerpos han sido considerados vectores prometedores para la entrega de radioisótopos emisores de positrones a los tumores debido a su exquisita afinidad y especificidad para biomarcadores de cáncer. 1,2 farmacocinética Sin embargo, la relativamente lentos in vivo de anticuerpos ordena el uso de radioisótopos con multi-día semividas físicas. Esta combinación puede producir altas dosis de radiación a los órganos que no son objeto de los pacientes, una complicación importante que es de particular importancia clínica ya radioinmunoconjugados se inyectaron por vía intravenosa, por lo que - a diferencia de las tomografías computarizadas cuerpo parciales - resultado en dosis absorbidas en cada parte del cuerpo, independientemente de los tejidos interrogados. Para evitar este problema, esfuerzo significativo se ha dedicado a la desallo de estrategias de formación de imágenes de PET que desacoplar el radioisótopo y el resto de dirección, aprovechando así las propiedades ventajosas de anticuerpos bordeando simultáneamente sus limitaciones intrínsecas farmacocinéticos. Estas estrategias - más a menudo denominados predireccionamiento o focalización de varios pasos - emplean típicamente cuatro pasos: (1) la administración de un anticuerpo capaz de unirse tanto un antígeno y un radioligando; (2) la acumulación del anticuerpo en el tejido diana y su aclaramiento de la sangre; (3) la administración de una pequeña molécula de radioligando; y (4) la ligación in vivo del radioligando con el anticuerpo seguido por la rápida eliminación del exceso de radioligando. 3-8 En algunos casos, se inyecta un agente de compensación adicional entre los pasos 2 y 3 con el fin de acelerar la excreción de cualquier anticuerpo Sin embargo, eso tiene que obligar a la tumor y permanece en la sangre. 5 En términos generales, twtipos o de estrategias predireccionamiento son más frecuentes en la literatura. Mientras que ambos han demostrado su eficacia en modelos preclínicos, también poseen limitaciones clave que han impedido su aplicabilidad clínica. La primera estrategia se basa en la alta afinidad entre los anticuerpos conjugados con estreptavidina y radiomarcadores modificados con biotina; Sin embargo, la inmunogenicidad de los anticuerpos modificados con estreptavidina ha demostrado ser un problema preocupante con respecto a la traducción. 5,6,9,10 La segunda estrategia, en cambio, emplea anticuerpos biespecíficos que han sido genéticamente modificados para-unirse tanto un cáncer antígeno biomarcador y un pequeño hapteno marcado radiactivamente molécula. 3,11-14 Mientras que esta última ruta es ciertamente creativo, su amplia aplicabilidad está limitada por la complejidad, gasto, y la falta de modularidad del sistema. Recientemente, hemos desarrollado y publicado una metodología de formación de imágenes PET pretargeted basado en la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEdda) reacción de cicloadición entre -cyclooctene trans (TCO) y tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Mientras que la reacción misma se conoce desde hace décadas, la química IEDDA ha experimentado un renacimiento en los últimos años como una técnica bioconjugación de química, como se ilustra en el fascinante trabajo de los grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, y Peter Conti entre otros. 12.15 El IEDDA cicloadición se ha aplicado en una amplia gama de entornos, incluyendo imágenes de fluorescencia con péptidos, anticuerpos, y nanopartículas, así como imágenes nucleares . con ambas radiohalogens y radiometales 16-26 La ligadura es de alto rendimiento, limpia, rápida (k 1&gt; 30000 M -1 s -1), selectiva y - crítica -. bioorthogonal 27 Y mientras que una serie de tipos de química modular - incluyendo cicloadiciones Cu-catalizada por azida alquino, cicloadiciones-azida alquino deformación-promovido y Staudinger ligciones -. bioorthogonal son, así, es la combinación única de la cinética de reacción rápidos y bioorthogonality que hace que la química IEDDA tan bien adecuado para el predireccionamiento aplicaciones en organismos enteros 28,29 A lo largo de estas líneas, es importante tener en cuenta que el reciente informe de nuestro laboratorios no fue el primero en aplicar la química IEDDA a predireccionamiento: el primer informe de la imagenología pretargeted con IEDDA surgió del trabajo de Rossin, y otros, y contó con una metodología que emplea un SPECT 111 tetrazina En marcado 30.. Como ya comentamos anteriormente, la metodología predireccionamiento tiene cuatro pasos muy simples (Figura 2). En el protocolo a la mano, se describirá una estrategia pretargeted para la formación de imágenes PET de cáncer colorrectal que se emplea un 64 marcado con Cu-NOTA radioligando tetrazina y un conjugado modificado-TCO del anticuerpo huA33. Sin embargo, en última instancia, la modularidad de esta metodología es uno de sus grcomieres activos, como el resto -cyclooctene trans se pueden adjuntar a cualquier anticuerpo no internalización, y la tetrazina se pueden unir a una amplia variedad de reporteros radiactivos.

<table><tbody><tr><td>Tetrazine NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764701</td><td>tienda a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Transcicloocteno NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764523</td><td>Tienda a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Macrocyclics</td><td>B-601</td><td>Tienda a -80 &deg; C</td></tr></tbody></table>

el aprovechamiento de la demanda bioorthogonal inverse electron diels-alder cicloadición para pretargeted tep

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Debido a su exquisita afinidad y especificidad, los anticuerpos se han convertido en vectores extremadamente prometedores para la entrega de radioisótopos a las células cancerosas para la obtención de imágenes PET. Sin embargo, la necesidad de marcar anticuerpos con radionúclidos con vidas medias físicas prolongadas a menudo da lugar a altas tasas de dosis de radiación de fondo en tejidos no objetivo. Con el fin de eludir este problema, hemos empleado una estrategia de imágenes PET predirigidas basada en la reacción de cicloadición de Diels-Alder de demanda inversa de electrones. La metodología desacopla el anticuerpo de la radiactividad y, por lo tanto, explota las características positivas de los anticuerpos, al tiempo que evita sus inconvenientes farmacocinéticos. El sistema se compone de cuatro pasos: (1) la inyección de un conjugado mAb-trans-cicloocteno (TCO); (2) un período de tiempo de localización durante el cual el anticuerpo se acumula en el tumor y se elimina de la sangre; (3) la inyección de la tetrazina radiomarcada; y (4) la ligadura de clic in vivo de los componentes seguida de la eliminación del exceso de radioligando. En el ejemplo presentado en el trabajo en cuestión, se utilizó con éxito un radioligando de tetrazina marcado con 64Cu-NOTA y un anticuerpo humanizado conjugado con transcicloocteno (huA33) para delinear tumores de cáncer colorrectal SW1222 con alto contraste entre el tumor y el fondo. Además, la metodología de prefocalización produce imágenes de alta calidad a solo una fracción de la dosis de radiación en el tejido no objetivo creado por radioinmunoconjugados marcados directamente con 64Cu o 89Zr. En última instancia, la modularidad de este protocolo es una de sus mayores ventajas, ya que la fracción transcicloocteno se puede agregar a cualquier anticuerpo no internalizante, y la tetrazina se puede unir a una amplia variedad de radioisótopos.

Los tres pasos iniciales del experimento - la síntesis de Tz-Bn-NOTA, la conjugación de TCO para huA33, y el radiomarcado del Tz-Bn-NOTA construyen (Figuras 3 y 4) - son altamente confiables. En el caso del procedimiento anterior, el constructo Tz-Bn-NOTA se sintetizó de alto rendimiento y pureza. El anticuerpo huA33 fue modificado con 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, y Tz-Bn-NOTA fue radiomarcado con 64 Cu para producir el radioligando purificada en&gt; 99% de pureza radioquímica,&gt; 8...

La cicloadición de Diels-Alder de demanda de electrones inversos bioortogonales se ha aprovechado para crear una estrategia de imagen PET predirigida eficaz y modular para el cáncer. En este protocolo, los pasos de esta metodología se describen en el contexto de un sistema modelo que emplea el anticuerpo dirigido al cáncer colorrectal huA33 y un radioligando marcado con 64Cu.

El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en pre-dirigirse al tejido canceroso utilizando una reacción bioortogonal entre tetrazina y trans-cicloocteno para la obtención de imágenes por PET. Esto se logra inyectando en un ratón con tumor un anticuerpo marcado con trans-cicloocteno, seguido de un periodo de intervalo durante el cual el anticuerpo se acumula lentamente en el tumor y se elimina de la sangre. Posteriormente, se inyecta un radio-ligando de tetrazina en el mismo animal.El radiofármaco se conjuga con un anticuerpo marcado con TCO en el tumor, y debido a que es una molécula pequeña, se elimina rápidamente de la sangre. La imagen de PET en pequeños animales resultante muestra una clara delimitación del tumor con alto contraste y altas relaciones de actividad tumor/fondo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la imagen de PET con anticuerpos marcados directamente es que proporciona imágenes de alto contraste con solo una fracción de la dosis de radiación para el paciente.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia, ya que las técnicas de pre-dirigimiento pueden administrar cantidades muy elevadas de radiación a los tumores, mientras que al mismo tiempo las dosis entregadas a órganos sanos y tejidos sanos serán muy bajas. Demostraré esta técnica junto con Catherine Kaza, una técnica en nuestro laboratorio. La reacción de síntesis comienza disolviendo siete miligramos de NH2-BN-Notta en 600 microlitros de bicarbonato sódico 0,1 molar a pH 8,1.Verifique el pH y utilice alícuotas pequeñas de carbonato de sodio 0,1 molar para ajustar el pH a 8,1 si es necesario. A continuación, añada esta solución a 0,5 miligramos de TZ NHS en un tubo de microcentrífuga. Deje que esta reacción incube durante media hora a temperatura ambiente con agitación suave.El stock de TZ NHS se puede disolver en DMF o DMSO después de media hora. Purifique el producto mediante HPLC de fase reversa C 18 para eliminar el NH dos BN notta no reactivo, que se registrará a 254 nanómetros. La TZ NHS y la TZ BN Notta se deben monitorear mejor a 525 nanómetros.El tiempo de retención de la muestra variará según el equipo, pero utilizando un gradiente de acetonitrilo a agua de cero a 100 a 100 a cero durante 25 minutos y una columna analítica C18 de 4,6 por 250 milímetros, los tiempos de retención serán de 16,5, 15 y 10 minutos para los tres compuestos respectivamente. Congele el eluyente recolectado de HPLC en nitrógeno líquido y luego envuelva el tubo en papel de aluminio opaco. A continuación, coloque el tubo congelado en un recipiente para liofilización y déjelo en un liofilizador durante toda la noche.Para eliminar la fase móvil de HPLC y verificar la pureza del precursor finalizado de TZ bn sin tapa superior, utilice HPLC analítica por RMN de protones y/o espectrometría de masas ESI. Comience esta reacción preparando una solución de 2,7 milimolar de T-C-O-N-H-S en DMF en un tubo de microcentrífuga y, en un segundo tubo de microcentrífuga, prepare una solución de dos miligramos por mililitro de HUA 33 en un mililitro de PBS pH 7,4.Luego, mediante adiciones pequeñas de carbonato de sodio 0,1 molar, ajuste el pH de la solución entre 8,8 y 9,0, pero no más alto. A continuación, agregue un volumen de T-C-O-N-H-S que corresponda a ocho equivalentes molares del éster activado. Mezcle suavemente la solución con algunas inversiones y envuélvala con papel de aluminio.Luego, coloque el tubo para incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora con agitación suave. Después de una hora, utilice una columna desaladora de exclusión por tamaño desechable y preempacada para purificar el inmunoconjugado de la reacción. Añada un mililitro de la mezcla de reacción a la columna y posteriormente añada 1,5 mililitros de solución salina estéril al 0,9%.Luego, eluya el producto humanizado HUA 33 TCO con dos mililitros de solución salina al 0,9 %. Mida la concentración del producto con un espectrómetro UV-vis. Si la concentración es más baja de lo deseado, concentre el producto utilizando un filtro centrífugo de 50.000 de peso molecular.Comience preparando una solución de 0,5 miligramos por mililitro de TZ BN notta en un tubo de microcentrífuga. En un segundo tubo de microcentrífuga, agregue 10 microlitros de la solución de TZ BN Notta preparada a 400 microlitros de tampón de acetato de amonio 0,2 molar a pH 5,5. Asegúrese de medir y registrar la cantidad de radioactividad de su muestra antes y después de cada uno de los siguientes pasos.Esto es esencial para el cálculo preciso de los rendimientos radioquímicos y el mantenimiento de registros. A continuación, agregue 2000 microcurios de cobre 64 a la solución de TZ BN Notta. Incube esta mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave.Para purificar el producto, utilice HPLC de fase reversa C18; diluya los productos mediante un gradiente de acetonitrilo a agua del cinco al 95 al 95 al cinco durante 15 minutos con TFA al 0,1 %. La tz marcada con radioisótopos, BN nota, eluirá a los 9,8 minutos, mientras que el cobre 64 libre eluirá con el frente del disolvente a los dos a cuatro minutos. Después de usar un evaporador rotatorio para eliminar el eluyente de HPLC, disuelva el producto marcado con radioisótopos en solución salina estéril al 0,9 % y proceda a utilizar el producto lo antes posible. Este procedimiento comienza diluyendo un eloqua de la solución de HEA 33 TCO preparada hasta una concentración de 0,5 miligramos por mililitro en solución salina estéril al 0,9 %.Luego, inyecte 200 microlitros de la solución en la vena de la cola del ratón portador del xenoinjerto. Deje que el anticuerpo humanizado a 33 TCO circule y se acumule en el tumor durante 24 horas. Después de 24 horas, prepare el TZ BN Notta marcado con cobre 64 a una concentración de 1,5 MILICURIES por mililitro en solución salina estéril al 0,9%.Luego, utilice una inyección en la vena de la cola para administrar 200 microlitros de la solución de radioligando preparada al ratón en el momento deseado. Anestesie al ratón y colóquelo sobre la camilla de un escáner para pequeños animales. La anestesia debe mantenerse mediante administración a través de un cono nasal, y el estado anestesiado debe confirmarse mediante un pellizco en el dedo del pie.Asimismo, para prevenir el secado, aplique una capa fina de ungüento oftálmico. Ahora, adquiera los datos del animal mediante un escaneo estático con 60 millones de eventos coincidentes a 350-700 kiloelectrón voltios y con un tiempo de coincidencia de seis nanosegundos. Después del imagenado, espere a que el ratón recupere la conciencia antes de devolverlo a su jaula, posiblemente junto con otros ratones. Un ratón nu nu timectomizado portador de un cáncer colorrectal SW 1222 que expresa el antígeno 33.Los xenoinjertos se examinaron utilizando el protocolo descrito. Tanto la biodistribución aguda como los experimentos de imagen por PET revelan que la estrategia de premarcado es capaz de delinear el xenoinjerto de cáncer colorrectal con un contraste de imagen excelente y altas relaciones de actividad tumor/fondo. A lo largo de varias horas, el ligando radiactivo se elimina por las heces y las relaciones de actividad tumor/fondo se vuelven bastante elevadas.Algunas variables en este enfoque de pre-dirigimiento requirieron optimización, al igual que ocurriría con cualquier estrategia de imagen. La administración de 300 microgramos del conjugado de anticuerpo TCO en lugar de 100 microgramos resultó en un aumento de la radioactividad visible en el corazón del ratón, al igual que la reducción del intervalo de 24 a 12 horas. En ambos casos, la reacción de tipo "clic" aún ocurrió en el tumor, ilustrado claramente por la captación tumoral en los puntos temporales tempranos.Sin embargo, la reacción de tipo click también ocurre claramente en la sangre, lo cual no es deseado. Debe lograrse un equilibrio delicado de todas las variables de pre-dirigimiento al intentar este procedimiento. Es muy importante que se optimice la masa del inmunoconjugado de TCO, así como el intervalo de tiempo entre las inyecciones.No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como usar equipo de protección personal adecuado y asegurarse de que la radiación esté blindada en todo momento durante el experimento.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Este vídeo describe la técnica de radioinmunoterapia predirigida o PRIT, en la que se administran inmunoconjugados seguidos de radioligandos para el tratamiento de tumores. Esta radioinmunoterapia reduce las dosis de radiación a los tejidos sanos y utiliza radionúclidos con vidas medias muy bajas incompatibles con los vectores basados en anticuerpos.

Radioinmunoterapia predirigida: un método para la administración dirigida de radionúclidos terapéuticos a los tumores

Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.

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El bioconjugación y Radiosíntesis de<sup&gt; 89</sup&gt; Los anticuerpos marcados con Zr-DFO

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