Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización In Vitro Y En Vivo

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la eficacia de la sensibilización a fármacos contra el cáncer mediante la medición de los cambios en el metabolismo celular in vitro y la frecuencia metastásica in vivo. Esto se logra seccionando primero las células cancerosas in vitro con moléculas antisentido para derribar el objetivo de interés. A continuación, las células transfectadas se colocan en chips biosensores y se cargan en un sistema de medición del metabolismo para enumerar los cambios en la acidificación, la respiración y la adherencia durante el tratamiento farmacológico.

Por separado, las células transfectadas se tratan con un fármaco y se inyectan en la circulación venosa de un embrión de pollo con el fin de evaluar los efectos sobre la frecuencia metastásica. Los resultados muestran la sensibilización a los fármacos contra el cáncer, ilustrada por los cambios en el metabolismo celular y la frecuencia metastásica. Esta técnica amplía el desarrollo de la terapia contra el cáncer porque permite la evaluación simultánea de parámetros que no siempre se tienen en cuenta durante las pruebas preclínicas convencionales de dianas o compuestos farmacológicos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre nuevas dianas farmacológicas implicadas en la reparación del ADN, también puede aplicarse a la validación de dianas en otros sistemas, como el control del ciclo celular. Después de seccionar células tumorales con oligonucleótidos antisentido, de acuerdo con el protocolo de texto en un entorno estéril, use 400 microlitros de PBS para lavar cuidadosamente seis chips de biosensores Para esterilizar los chips, retire el PBS y agregue 400 microlitros de etanol al 70% incubar durante 20 minutos antes de usar PBS para lavar los chips tres veces. Coloque tres chips cada uno en platos de cultivo estériles, etiquetados como control y objetivo de interés, y etiquete dos tubos de 50 mililitros de manera similar.

A continuación, use PBS para lavar las células transfectadas antes de agregar un volumen apropiado de 0.25% de tripsina EDTA, espere hasta que la monocapa se desprenda y transfiera la suspensión celular al tubo apropiado. Después de contar las celdas, ajuste el volumen para alcanzar una concentración final de 6.0 por 10 a la quinta celda por mililitro agregando medio o concentrando las celdas. Preparando un grupo a la vez, agregue 250 microlitros de solución celular a cada chip biosensor.

Colocar las placas estériles que contienen los chips dentro de una cámara de humedad para evitar la evaporación e incubar durante la noche para realizar mediciones del metabolismo siguiendo el esquema experimental detallado en la etiqueta del protocolo de texto Tubos de 1450 mililitros y añadir 50 mililitros de crecimiento, medio más 0,2% FBS y una x penicilina y estreptomicina. O PD. Coloque seis tubos en un sistema de medición del metabolismo, seis en otro y el tubo restante en un tercer tubo que también contenga tubos con cisplatino. Utilice una membrana permeable al aire para sellar las dos primeras rejillas y evitar la evaporación.

A continuación, prepare un volumen adecuado de seis micromolares de cisplatino en medio con 0,2% de FBS y un XPS. Dispense el volumen requerido de medio en cuatro tubos de 50 mililitros etiquetados y vuelva a colocarlos en las cuatro ranuras del tercer soporte de tubos de medición del metabolismo. Utilice una membrana permeable al aire para sellar los tubos.

Etiquete seis tubos de 50 mililitros y agregue 20 mililitros a cada uno de 0.1%Triton X solución En medio, la solución Triton X se ubicará en las celdas restantes y proporcionará un valor cero para cada chip. Coloque los tubos en una cuarta rejilla para tubos y séllelos. A continuación, cargue los chips en los módulos biológicos.

Cargue los dos bastidores en el soporte de dos brack y, a continuación, inicie el experimento. Después de preparar los embriones de pollo como se menciona en el protocolo de texto en el segundo día de la transfección celular, subdivida los grupos de interés de control y objetivo en dos frascos para vehículo y dos para cisplatino. Aspire el medio y use tres mililitros de cisplatino fresco, medio o medio con seis micromolares de cisplatino para reponerlo.

Los matraces se incuban durante seis horas. Después de la incubación, aspire el medio, luego lave y pruebe las células, transfiera la suspensión celular a cuatro tubos de 15 mililitros debidamente marcados antes de girar y usar PBS para lavar tres veces Resus resuspender las células. Y luego, después de contar, use PBS para diluir o centrifugación para concentrar las células a una concentración final de 1.0 veces 10 a la sexta célula por mililitro.

Transfiera la suspensión celular a tubos de cinco mililitros etiquetados para inyección y colóquelos en hielo. A continuación, reserve 24 embriones de pollo de 9 días para inyectarlos bajo un microscopio estereoscópico y utilizando una aguja de vidrio conectada a un tubo flexible conectado a una jeringa de un mililitro con un movimiento pulsante lento. Inyecte 1,0 veces 10 a la quinta célula en un volumen de 100 microlitros en la circulación venosa de la membrana o leva coaltoica con una toallita suave.

Frote suavemente el lugar de la inyección para detener el flujo de sangre y absorber cualquier derrame de centrifugado. Etiquete cada envase de embrión adecuadamente después de cada inyección bajo un microscopio fluorescente. Confirmar la presencia y distribución de células fluorescentes en la vasculatura de la CAM.

Tome nota de cualquier embrión en el que el número de células tumorales parezca bajo o la distribución sea pobre. Finalmente, coloque los embriones de pollo en una cámara de humedad e incube durante siete a nueve días antes de enumerar los focos metastásicos como se describe en el protocolo de texto como se muestra aquí después de 24 horas de cáncer de pulmón humano, A 5 49 células de cáncer de pulmón tratadas con BRCA dos dirigidas a SO y cisplatino exhibieron una disminución temprana e irreversible de la respiración en comparación con las células que recibieron un SO de control y cisplatino solo. La disminución del 39% en comparación con las células tratadas con el control comenzó aproximadamente 10 horas antes de una caída detectable en la adhesión celular, lo que sugiere que ocurrió independientemente de los cambios en el número de células y que puede ser un evento formativo que precede a la muerte celular, como se demuestra aquí.

No se observaron diferencias en la acidificación durante el experimento de 72 horas, lo que sugiere que el tratamiento con BRCA dos a SO y cisplatino tuvo poco o ningún efecto sobre el metabolismo de la glucosa. En este experimento, se trataron células humanas de cáncer de pulmón A 5 49 con SO de control a o BRCA dos A SO en presencia o ausencia de cisplatino y se inyectaron en la circulación venosa de la leva. Nueve días después, las células tratadas con BRCA dos a SO y cisplatino mostraron una frecuencia un 77% menor de focos metastásicos en comparación con las células tratadas con control a SO y cisplatino o BRCA dos A SSO solos, lo que sugiere que el tratamiento con BRCA dos a SO y cisplatino tiene el potencial de disminuir o prevenir la carga metastásica en pacientes con tumores sólidos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos más tradicionales, como la proliferación celular, los ensayos y los estudios de xenoinjertos in vivo, con el fin de explorar más a fondo la contribución de un objetivo concreto a la mejora de la sensibilidad de los fármacos.