Name: Utilizando murino Inducible telomerasa alelos en los Estudios de la degeneración del tejido / Regeneración y Cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende a generar alelos de telomerasa inducibles en ratones para estudiar degeneración tisular, regeneración y cáncer usando hidroxitamoxifeno. Este método permite evaluar la reactivación de telomerasa in vivo e in vitro.

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J.H. cuenta con el apoyo del Premio Camino a la Independencia K99/R00 de los NIH (5K99CA172700) y el Premio al Desarrollo Profesional SPORE del Cáncer Cerebral del NCI (2P50CA127001).

NOTA: Todos los pasos de este protocolo han sido aprobados por el Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas. 1. Generación de mTERT-ER alelo <ol><li> Introducir ronda en la orientación de vector que contiene el ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) aguas arriba y en marco con la secuencia genómica mTERT (exón 1 a través de intrón 2) y un Lox - PGK - Neo - fragmento Lox (Figura 1A) en células ES de ratón con la electroporación. </li><li> Cultura de las células madre embrionarias en la neomicina para 6-10 días. Escoja clones resistentes a la neomicina y expandirse en placas de 48 pocillos. Extraer el ADN genómico utilizando un kit comercial y confirmar la knock-in alelo por Southern blot. </li><li> Inyectar dos ES líneas con más del 95% cariotipos normales en ratones C57BL / 6 blastocistos con un kit de micromanipulación bajo un microscopio invertido. Implante los blastocistos en el útero de madres de alquiler 23. Mate de las quimeras macho de alto grado (70-90%) a C57BL / 6 femachos. </li><li> Confirmar el genotipado de animales heterocigotos mTERT-ERneo por Southern blot. </li><li> Mate de los heterocigotos animales mTERT-ERneo y animales EIIa-Cre borrar el cassette NeoR. Mate a los animales heterocigotos para C57BL / 6 animales por lo menos tres veces, y otras inter-raza heterocigotos animales mTERT-ER para generar homocigosis. </li></ol> 2. Generación de LSL-mTERT alelo <ol><li> Introducir el knock-in focalización vector que contiene un LoxP - triples Stopper - Neo - fragmento LoxP y la secuencia genómica mTERT (entre el exón 1 y el intrón 2, Figura 1B) en células ES de ratón con la electroporación 23. </li><li> Cultura de las células madre embrionarias en la neomicina para 6-10 días. Escoja clones resistentes a la neomicina y expandirse en placas de 48 pocillos. Extraer el ADN genómico utilizando un kit comercial y confirmar la knock-in alelo por Southern blot 23. </li><li> Inject dos ES líneas con más del 95% cariotipos normales en ratones C57BL / 6 blastocistos con un kit de micromanipulación bajo un microscopio invertido. Implante los blastocistos en el útero de madres de alquiler 23. Mate de las quimeras macho de alto grado (70-90%) a C57BL / 6 hembras. </li><li> Confirmar el genotipado de animales heterocigotos LSL-mTERT por Southern blot. </li><li> Aparearse los animales heterocigotos para C57BL / 6 animales por lo menos tres veces, y aún más inter-raza heterocigotos animales LSL-mTERT para generar homozygosity. </li></ol> 3. La reactivación de la telomerasa en mTERT-ER y Ratones LSL-mTERT En Vivo Para mTERT-ER <ol><li> Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos antes de la inyección. </li><li> Anestesiar a los ratones con cámara de isoflurano (4% para la inducción, 2% para el mantenimiento) en 50% (v / v) de oxígeno / 50% (v / v) mezcla de gas de monóxido de dinitrógeno. O anestesiar a los ratones por una mezcla de ketamina xilazina (100 mg / kg de peso corporal + 10 mg / kg de peso corporal). </li><li> Después de alcanzar la anestesia profunda, retire el animal anestesiado de la cámara de inducción, y mantener su cabeza en el interior del tubo conectado a la cámara de isoflurano (2%). </li><li> Apriete las almohadillas de las patas de los ratones para asegurar que el animal está profundamente anestesiado. Ponga pomada en ambos ojos con el fin de evitar que los ojos se sequen. Limpiar la parte posterior de los ratones con solución de povidona yodada. </li><li> Inyectar la liberación lenta pellet 4-OHT con trocar de precisión (10 G) debajo de la piel de la espalda y empujar el sedimento todo el camino a la línea media entre dos hombros. </li><li> Selle la incisión con el clip herida aplicador y monitorear los ratones para la recuperación de la anestesia. Retire los clips de 10 días después. Calor suplementario no es necesario debido a que el procedimiento ha terminado en breve. </li><li> Período de tratamiento con 4-OHT pellet debe ser optimizado de acuerdo con el propósito del estudio. </li></ol> Para LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> El tamoxifeno (10 mg / ml, disuelto en aceite de maíz) se inyecta por vía intraperitoneal dos días consecutivos (200 ul / 25 g / día). </li></ol> 4. Aislamiento de células madre neurales y reactivación de la telomerasa in vitro <ol><li> Los ratones son sacrificados con dióxido de carbono y se quitan los cerebros. Siga el protocolo de kit disociación tejido neural disponible comercialmente como por fabricante. </li><li> Resuspender el polvo liofilizado en el vial etiquetado con Solución 4 con 1 ml de medio de cultivo celular para la Solución 4. No vórtice. Esta solución debe ser entonces alícuotas y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior. </li><li> Pre-calienta la mezcla a 37 ° C durante 15 minutos antes de su uso. </li><li> Hacer Enzyme Mix 1: Solución 1 (50 l) y solución 2 (1,900 l). Haga Enzyme Mix 2: Solución 3 (20 l) y la solución de 4 (10 l). </li><li> Preparar 1950 l mezcla de enzimas 1 para un máximo de 400 mg de tejido y de vórtice. Pre-calienta la mezcla a 37 ° C durante15 min antes de usar. </li><li> Saque los cerebros de ratón 1-día, y mantener a los prosencéfalos quitando los bulbos olfatorios y el cerebelo. Mantenga los tejidos del cerebro anterior en 1 ml de medio de cultivo frío ya que la remoción y almacenar en 4 ° C. Asegúrese de procesar el tejido neural dentro de 1 hr. </li><li> Determinar el peso de tejido para asegurarse de que no se supere el límite de 400 mg por la digestión. Coloque el cerebro en la tapa de una placa de 35 mm de diámetro de Petri, y aplastar el cerebro utilizando un bisturí. </li><li> Utilizando una punta de pipeta de 1 ml, añadir 1 ml de HBSS (w / o Ca / Mg) y piezas de pipeta de nuevo en un tubo de 15 ml. Enjuague con HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifugar a 300 xg durante 2 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante con cuidado. </li><li> Añadir 1.950 l de mezcla de enzima precalentado 1 (Soluciones 1 y 2) por hasta 400 mg de tejido. Incubar en el tubo de 15 ml durante 15 min a 37 ° C, mezclando por inversión o agitando el tubo cada 5 min. </li><li> Preparar 30 l mezcla de enzimas 2 por muestra de tejido mediante la adición de 20 &amp; #956; l de la solución de 3 a 10 l de solución de 4. A continuación añadir a la muestra. Invierta suavemente para mezclar. No lo hagas vórtice. </li><li> Disociar el tejido mecánicamente usando una amplia punta, pipeta Pasteur pulida al fuego por la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces lentamente. Evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 10 min, invirtiendo el tubo cada 3 min. </li><li> Repita el paso de 4,11 y 4,12 paso si los tejidos son más grandes que 200 mg. </li><li> Aplicar la suspensión celular a un filtro de células de 70 micras, colocado en un tubo de 50 ml. Aplicar 10 ml de PBS a través de filtro de células. Desechar filtro de células y la suspensión de células se centrifuga a 300 g durante 20 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Resuspender las células con medio de células madre hasta el volumen requerido para otras aplicaciones. </li><li> Para activar la telomerasa en LSL-mTERT NSC, el tratamiento de las células con 100 mM de 4-OHT durante dos días. Para activar la telomerasa en mTERT-ER NSC, mantener las células en medio de cultivo con 100 mM 4-OHT. </li></ol> 5. telómeros FISH <ol><li> Preparar los cromosomas en metafase de células cultivadas. </li><li> Para FFPE (fijados con formalina y embebidos en parafina) secciones de tejido, Desparafinar en xileno y rehidratar en series de etanol durante 5 minutos cada uno (100%, 90%, 70%, 50% de etanol) y PBS durante 5 min. </li><li> Post-fix en el metanol: ácido acético (3: 1) durante 1-2 horas. Deshidratar en serie etanol frío durante 5 min cada uno (70%, 90%, 100% de etanol) y secar al aire. Lave en 1x PBS a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Desnaturalizar cromosomas en formaldehído al 4% a 37 ° C durante 2 min. Deshidratar en serie etanol frío 5 min cada uno (70%, 90%, 100% de etanol) y secar al aire. </li><li> Aplicar de 12 a 25 l de la mezcla de hibridación PNA a cada diapositiva. (Mezcla de hibridación: formamida al 70%, SSC 0.06x, 0,2% de BSA, 0,5 ng / l tRNA, 0,5 ng / l telómero o centrómero sondas) </li><li> Selle la hoja de la cubierta con cemento de goma. Preparaciones cromosómicas Post-desnaturalizar y secciones de tejido a 80 ° C durante 4 men. Hibridar a temperatura ambiente o 37 ° C durante 2-4 horas en cámara húmeda. </li><li> Lavar a temperatura ambiente con tampón de lavado 2 x 15 min. (Tampón de lavado: 70% de formamida, SSC 0.06x, pH 7,2). Lavar a temperatura ambiente de 3 x 5 minutos con PBST. Diapositivas tinción de contraste con DAPI o fluorescencia roja lejana para el examen microscópico. </li></ol>

<ol><li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li>
<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li>
<li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity%2C+stress+response%2C+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li>
<li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li>
<li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndromes+of+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li>
<li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li>
<li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%2C+checkpoints+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+surveys%22%5BJournal%5D)">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li>
<li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarlseder%2C+J+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 283, 1321-1325 (1999).</li>
<li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li>
<li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li>
<li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li>
<li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a%28delta2%2F3%29+cancer-prone+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li>
<li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se presenta la generación de dos alelos telomerasa murino inducibles y cómo reactivar la telomerasa in vivo e in vitro. El paso fundamental para la reactivación de la actividad mTERT-ER es mantener una concentración continua de tamoxifeno, por lo que optan por utilizar 4-OHT gránulos de liberación vez fabricados por Innovative Research of America. Los pellets siguen liberando 4OHT a un nivel en sangre en estado estacionario de 1 ng / ml durante un máximo de 60 días. En un estudio anterior, hemos demostrado que la reactivación de la actividad de la telomerasa con esta estrategia fue capaz de mejorar los fenotipos degenerativos tales como el agotamiento de células madre, el deterioro de las respuestas de la lesión tisular y la insuficiencia de órganos en múltiples órganos que fueron inducidos por la disfunción de los telómeros en G4 mTERT ER / ER ratones 20. Aparte de estudiar la función de la telomerasa en el envejecimiento, estos dos alelos telomerasa inducibles también pueden utilizarse para estudiar el cáncer. Los estudios anteriores se llevaronventaja de estos alelos para explorar el papel de desgaste de los telómeros y la telomerasa reactivación en la conformación de los genomas y que afectan la biología de las células T linfoma tímico 21 y cáncer de próstata 22. Estos dos estudios demostraron que la disfunción telomérica en la generación de finales G4 Atm - / - mTERT ER / ER y G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L ratones proporciona un mecanismo alimentando la adquisición de eventos mutagénicos temprana para la iniciación del tumor, sin embargo, prevención de la progresión de los tumores completamente malignos. Cuando la telomerasa se ​​reactivó en el contexto de la inestabilidad genómica inducida por la disfunción de los telómeros, los puntos de control de daños del ADN y la inestabilidad cromosómica rampante fueron suprimidas, lo que permitió la progresión lleno de tumores malignos con nuevas propiedades biológicas tales como la metástasis ósea del cáncer de próstata 21 y la infiltración de cerebro de timosc linfoma 21. Fenómenos similares se observaron también en otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon y el cáncer de páncreas (comunicaciones personales con los Dres. Haoqiang Ying, Adam Boutin y Ronald DePinho). Puesto que la proteína de TERT-ER se puede conmutar fácilmente entre ON y OFF estados dependiendo de si los animales son tratados con tamoxifeno o vehículo, los modelos de tumores generados por alelo mTERT-ER pueden ser utilizados para probar la terapia anti-telomerasa. En el estudio anterior, los tumores generados en G4 Atm - / - mTERT ER animales / ER fueron liberados de 4-OHT; en reducción de la telomerasa, los tumores se redujeron finalmente debido a la reincorporación de los telómeros puestos de control para la disfunción inducida 21. Sin embargo, algunos de los tumores resistencia adquirida en respuesta a la telomerasa extinción mediante la activación de un alargamiento alternativo de los telómeros (ALT) mecanismo. Además de la caracterización de estos tumores ALT + resistentes mostró que tbueno tener la transcripción aberrante de genes implicados en la biología mitocondrial y de defensa oxidativo incluyendo un regulador maestro de la síntesis mitocondrial y oxidativa defensa PGC-1β. Derribo de PGC-1β o SOD2 (otro regulador de defensa oxidativa) elimina significativamente células ALT + tumorales, mientras que mantienen las células telomerasa + tumorales permanecen relativamente intactos 21. Una limitación de estos dos alelos knock-in es que sólo se pueden permitir la reactivación de la telomerasa en el nivel endógeno porque están en el locus nativo del gen de la telomerasa. En la mayoría de los cánceres humanos, la telomerasa se sobreexpresa en realidad a un nivel mucho más alto. Con el fin de mejorar el nivel de la telomerasa, una modificación podemos considerar es insertar el constructo mTERT-ER con un promotor más fuerte, tal como PGK (fosfoglicerato quinasa), el promotor en locus Rosa26. En conclusión, estos dos nuevos alelos telomerasa murinos inducibles proporcionan Genet sin precedentesic herramientas para estudiar las funciones de la telomerasa en el envejecimiento y la homeostasis del tejido, así como la progresión del tumor, especialmente bajo el fondo de pre-adquirido telómero disfunción inducida por la inestabilidad genómica. El alelo mTERT-ER también puede ser usado para estudiar la terapia anti-telomerasa mediante el cruce en otros modelos de ratón de tumor en decúbito prono.

La telomerasa es una enzima responsable de mantener los telómeros. Estos son secuencias repetitivas en los extremos de los cromosomas que protegen su integridad. Los componentes básicos de holoenzima telomerasa son una subunidad catalítica de la transcriptasa inversa (terc) y una subunidad de ARN (TERC) que sirve como la plantilla para la adición de la telomérica repite 1,2. Aunque generalmente suprimida en las células somáticas diferenciadas, la telomerasa presenta actividad robusta y juega un papel importante en las células germinales, células cancerosas y células madre. mTERC y mTERT ratones knockout proporcionan grandes en sistemas modelo in vivo para estudiar las funciones de la telomerasa en las células madre y el cáncer. El mTERC y mTERT ratones knockout (G1) no mostraron fenotipos obvios debido a la larga reserva de los telómeros en ratones 3. Sin embargo, entrecruzándose en serie mTERC y mTERT ratones knockout en generación tardía (G5-G6) resultó enprogresiva erosión de los telómeros y, finalmente, provocó una grave degeneración de los tejidos de proliferación 4. Generación Tardío (G5-G6) mTERC - / - ratones son infértiles debido a los altos índices de apoptosis en los testículos y el agotamiento de las células germinales. G5-G6 mTERC - / - ratones también muestran fenotipos degenerativos en los tejidos de proliferación incluyendo la médula ósea, intestino y piel debido a los altos índices de apoptosis y la capacidad de auto-renovación defectuosa en tallo tejido / compartimentos celulares progenitoras 4. Las células madre hematopoyéticas en la médula ósea de la generación tardía mTERC - / - ratones de pérdida de exposición de potencial proliferativo, la capacidad de auto-renovación comprometida, aumento de la apoptosis y, finalmente agotamiento funcional 5,6. Del mismo modo, se observó un aumento progresivamente cuerpos apoptóticos en las criptas intestinales en cada generación sucesiva de G1-G6 mTERC - / - ratones 7,8. Tél efecto deletéreo de los telómeros disfuncionales no parece limitarse a los tejidos alta rotación ya que tanto la proliferación de las células madre neurales adultas in vitro y la neurogénesis en vivo fueron severamente afectados en la generación tardía (G4-G5) mTERC - / - ratones 9 . El papel de la telomerasa en las células madre se ve apoyado por los hallazgos en un raro trastorno genético disqueratosis congénita humana (DKC), que en algunos aspectos se asemeja a un envejecimiento prematuro 10,11. DKC es causada por mutaciones en TERC, de TERT, y los genes que codifican la disquerina, una subunidad de la telomerasa núcleo, y otra disquerina proteínas asociadas 12. En promedio, los telómeros en pacientes DKC son más cortos que el 99% de los controles de la misma edad. La morbilidad grave de la enfermedad es debido a la anemia aplásica, que es causada por el mantenimiento defectuoso de las células madre hematopoyéticas. Otros aspectos de la enfermedad, tales como la leucoplasia oral, distrofia de la uña, retardati mentalesen, testículos atrofia y complicaciones pulmonares todos sugieren funciones de las células madre de tejidos y células progenitoras 10, los hallazgos en estrecha concordancia con los deteriorados a fines de generación de los ratones knockout de la telomerasa. DKC pacientes son propensos a síndrome mielodisplásico y tienen una mayor prevalencia de neoplasias malignas de la mucosa. Por lo tanto, la deficiencia de la telomerasa en pacientes humanos recapitula los defectos de funciones de las células madre y la predisposición tumor que se observan en los ratones knockout de la telomerasa generación tarde. Los telómeros cortos y alta actividad de la telomerasa son características del cáncer. Como las células normales o premalignas se dividen, los resultados bajos o ausentes de la actividad de la telomerasa en la eventual erosión de los telómeros y la activación de los puestos de control celulares similares a los provocados por el doble-breaks varados ADN (DSBs) 13. Como DSBs clásicos, disfunción de los telómeros se ha demostrado que induce p53 y asociado respuestas celulares, tales como la senescencia y / o apoptosis 14,15. Tras la inactivación mutacional de p53, el ciclo celular y la supervivencia celular se han mejorado en las células con disfunción de los telómeros, que proporciona un mecanismo mutador pro-cancerígeno caracterizado por translocaciones y regionales amplificaciones y deleciones 16,17. Al mismo tiempo, continuó la disfunción de los telómeros y la inestabilidad cromosómica asociada desenfrenada (incluso en las células p53 nulos) parecen limitar la progresión maligna completa de tales cánceres. Por ejemplo, la generación de finales de G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - ratones mostraron reducido significativamente la incidencia de linfoma en comparación con Ink4a / Arf ratones nulos debido al desgaste de los telómeros. En otro estudio, las lesiones adenomatosos más avanzados en G4 mTERT - / - min ratones APC fueron suprimidas en gran medida en comparación con los ratones APC min debido a la detención del crecimiento significativo y la apoptosis 18,19. Laobservación de que los telómeros disfunción inducida por la inestabilidad genómica inhibe la progresión del tumor induce al especulación de que la activación de la telomerasa puede permitir la progresión maligna en parte por sofocar la inestabilidad genómica a un nivel compatible con la viabilidad de células de cáncer y / o neutralizante de p53-dependiente o mecanismos de control -independiente. Con el fin de estudiar si la reactivación de la telomerasa puede detener o incluso revertir el envejecimiento de las células madre, y si la reactivación de la telomerasa puede promover la tumorigénesis en el contexto de la inestabilidad genómica, generamos dos alelos telomerasa murinos inducibles. El primero es de 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) (mTERT-ER) fusión de TERT-receptor de estrógeno-inducible ronda en alelo. En ausencia de 4-OHT, los ratones homocigotos para mTERT-ER (designado mTERT ER / ER) son deficientes en actividad de la telomerasa y sostener mismos fenotipos citogenéticas y celulares como mTERT convencional o mModelo nocaut TERC. A 4-OHT tratamiento, actividad de la proteína de TERT-ER puede ser restaurado a niveles comparables a la proteína nativa de TERT 20, 21. El segundo alelo es una novela de TERT inducible ronda en el alelo que contiene un casete LoxP-Stopper-LoxP intrónico (LSL- mTERT); tras la escisión de LSL Cre-mediada, mTERT se re-expresa bajo mecanismos de control de la expresión endógena 22.

<table><tbody><tr><td>Kit de micromanipulación Leica AM6000</td><td>Leica</td><td>Por cotización</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Leica DMI6000 B</td><td>Leica</td><td>Por cotización</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de neomicina</td><td>Life</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>vaporizador de isoflurano</td><td>Sistemas de anestesia veterinaria</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>mezcla de ketamina y xilacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT en polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pellet</td><td>Investigación Innovadora de América</td> Trochar de Precisión <td>Custermizada</td><td></td></tr><tr><td>(Calibre 10)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>clip de herida aplicador</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación de tejido neural</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Tecnologías de vida</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tecnologías de</td><td>vida</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xileno</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA sonda de telómero</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de centrómero PNA</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>cemento de caucho</td><td>Walmart</td><td>Elmer's</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando murino inducible telomerasa alelos en los estudios de la degeneración del tejido / regeneración y cáncer

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Pérdida de la integridad del genoma y su señalización de daño del ADN asociado y respuestas de control del telómero disfunción inducida por los conductores son bien establecidas que causan la degeneración de los tejidos durante el envejecimiento. Cáncer, con tasas de incidencia aumenta considerablemente con la edad, se caracteriza por longitudes de los telómeros cortos y alta actividad de la telomerasa. Para estudiar el papel de la disfunción de los telómeros y la reactivación de la telomerasa en el cáncer y el envejecimiento, el protocolo muestra cómo generar dos telomerasa inducible murino ronda en alelos de 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) inducible de TERT-receptor de estrógeno (mTERT-ER) y Lox -Stopper-Lox de TERT (LSL-mTERT). El protocolo describe los procedimientos para inducir la disfunción telomérica y reactivar la actividad de la telomerasa en ratones mTERT-ER y LSL-mTERT in vivo. Los datos representativos muestran que la reactivación de la actividad telomerasa puede mejorar los fenotipos degenerativos tisulares inducidas por la disfunción de los telómeros. En order para determinar el impacto de la reactivación de la telomerasa en la tumorigénesis, hemos generado próstata PB-Cre4 modelo tumoral PTEN G4 L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L y el modelo de linfoma de células T del timo G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Los datos representativos muestran que la reactivación de la telomerasa en el contexto de la inestabilidad genómica inducida por la disfunción de los telómeros puede mejorar enormemente la tumorigénesis. El protocolo también describe los procedimientos utilizados para aislar células madre neurales (NSC) de ratones mTERT-ER y LSL-mTERT y reactivar la actividad telomerasa en células madre neurales in vitro. Los datos representativos muestran que la reactivación de la telomerasa puede mejorar la capacidad de auto-renovación y la neurogénesis in vitro. Por último, el protocolo se describen los procedimientos para realizar los telómeros FISH (Hibridación Fluorescente In Situ) tanto FFPE ratón (fijados con formalina y ParafEmbedded) tejidos cerebrales aleta y metafase los cromosomas de las células cultivadas.

Las estrategias para generar murino mTERT-ER y LSL-mTERT knock-in alelos se describen en la Figura 1A y 1B. En concreto, un LoxP - triples Stopper - Neo - se insertó un fragmento LoxP entre el exón 1 y el exón 2 del locus mTERT para generar alelo LSL-mTERT. Para generar alelo mTERT-ER, dominio ERT2-LBD en marco con el gen de mTERT se insertó en el extremo N-terminal del exón 1. Hemos demostrado que cuando la telomerasa se ​​reactivó transitoriamente en ratones disfunción de los telómeros tratándolos con pellets de 4-OHT para 4 semanas, el fenotipo degenerativo podrían ser mejorados en múltiples órganos tales como el cerebro (Figura 2A) y los testículos (Figura 2B). Con el fin de determinar el impacto de la reactivación de la telomerasa en las células cultivadas in vitro, se aislaron células madre neurales (NSC) de G4 generación finales LSL-mTERT y G4 mTERTRatones -ER. Hemos demostrado que cuando la telomerasa se ​​reactivó en los telómeros NSCs disfuncionales, la capacidad de auto-renovación de células madre neurales se incrementó considerablemente (Figura 3), y en la neurogénesis vitro también fue significativamente mayor (Figura 3B). Con el fin de determinar el impacto de la reactivación de la telomerasa en la tumorigénesis en el contexto de la disfunción de los telómeros, que generó PB-Cre4 PTEN L-mTERT LSL / L (modelo de próstata tumor) / L p53 L / L L y Atm - / - mTERT ER / ER (modelo de linfoma de células T del timo) cohortes generación tarde. Cuando la telomerasa fue reactivado por tratamiento con tamoxifeno en estos ratones con la inyección (Figura 4A) o pellets de 4-OHT durante 8 semanas (Figura 4B), la tumorigénesis se mejoró en gran medida tanto en modelo de tumor de próstata (Figura 4A) y del timo modelo de linfoma de células T ( <strong&gt; Figura 4B). Por último, se informó de los protocolos de la realización de FISH de los telómeros en los tejidos del cerebro FFPE ratón (Figura 5) y metafase los cromosomas (Figura 5, recuadro). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mTERT-ER ronda en la estrategia. TV, vector dirigido; WT, alelo de tipo salvaje; KI, ronda en alelo; LA, brazo izquierdo; RA, el brazo derecho; E1, el exón 1; E2, el exón 2; neo, pgk promotor impulsado gen resistente a la neomicina; ER, receptor de estrógeno modificado (ERT2) la unión del ligando de dominio; DT, dyphteria gen de la toxina. (B) LSL-mTERT ronda en la estrategia. TV, vector dirigido; WT, alelo de tipo salvaje; KI, ronda en alelo; LA, brazo izquierdo; RA, el brazo derecho; E1, el exón 1; E2, el exón 2; neo, pgk promotor impulsado gen resistente a la neomicina; TAPÓN, tres secuencias de parada transcripcional repetitivos; DT, dyphteria gen de la toxina. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figura 2: Los datos representativos que muestran una reactivación de la telomerasa aminora fenotipos degenerativos de órganos Imágenes representativas de cerebros (izquierda). y los testículos (derecha) de ratones G0 y G4 mTERT ER-tratados con placebo o 4-OHT durante 4 semanas. Las barras de escala indican 50 micras. Vuelva a imprimir con permiso de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figura 3:. Los datos representativos que muestran una reactivación de la telomerasa aumenta la auto-renovación y la neurogénesis de células madre neurales in vitro (A) Imágenes representativas de células madre neuraless aislado de G4 LSL-mTERT (panel superior) y G4 mTERT-ER (panel inferior) que crece en medio de células madre tratadas con vehículo o 4-OHT. (B) Imágenes representativas de la neurogénesis in vitro (Tuj1 +) de las células madre neurales aisladas de G4 mTERT-ER cultivaron en medio de diferenciación (con 1% de FBS) tratados con vehículo o 4-OHT. Las barras de escala indican 100 micras. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figura 4:. Los datos representativos para mostrar la reactivación de la telomerasa aumenta la tumorigénesis en un contexto de inestabilidad genómica (A) Imágenes representativas de los tumores de próstata disecados de G0 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, Y G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L tratadas con tamoxifeno. Vuelva a imprimir con permiso de 22. (B) Imágenes representativas de los linfomas de células T del timo disecados de G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER tratado con vehículo, y G4 Atm - / - mTERT ER / ER trató con 4- OHT durante 8 semanas. Las barras de escala indican 1 cm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figura 5: Imágenes representativas de telomérica y FISH centromérica en FFPE ratón tejido cerebral y metafase (recuadro). El color rojo indica ADN, verde indica tinción de los telómeros, y cian indica cetinción ntromere. Las barras de escala indican 1 mm.

Los telómeros y la telomerasa juegan un papel esencial en el envejecimiento y la tumorigénesis. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo generar dos alelos knock-in de telomerasa inducibles en murinos y cómo utilizarlos en los estudios de degeneración/regeneración de tejidos y cáncer.

Utilizando murino Inducible telomerasa alelos en los Estudios de la degeneración del tejido / Regeneración y Cáncer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

El objetivo general del siguiente experimento es manipular dos alelos de golpeteo de mase inducibles en murino in vivo e in vitro para estudios de degeneración y regeneración de tejidos y estudios de cáncer. Esto se logra mediante la implantación de tabletas de hidroxitamoxifeno en animales para reactivar la mase in vivo. Como segundo paso, se aíslan células madre neurales de animales que luego se tratan con hidroxitamoxifeno para reactivar la mase in vitro.A continuación, se realiza la fluorescencia de los telómeros en la hibridación C dos o fish tanto en las células cultivadas como en los tejidos cerebrales formales y fijados embebidos en parafina con el fin de comprobar la actividad de la masa. Los resultados mostraron que los tratamientos con hidroxitamoxifeno pueden reactivar de manera robusta la actividad de la masa, lo que puede aliviar los fenotipos de envejecimiento y promover la formación de tumores según el examen histopatológico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del envejecimiento y el cáncer, como si podemos o no ralentizar el proceso de envejecimiento modulando la actividad del trauma de TH, o cómo dirigirse específicamente a Thomas para tratar el cáncer.Demostrando este procedimiento estarán el instructor Dr. Takashi Shingu y un técnico April Un de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la generación de los alelos Turt ER y lock stop locks turt como se describe en el protocolo de texto, esterilice todas las herramientas quirúrgicas antes de la inyección y proceda a anestesiar a los ratones como se describe en el protocolo de texto. Después de alcanzar la anestesia profunda, retire al animal anestesiado de la cámara de inducción y mantenga su cabeza dentro del tubo conectado a la cámara de iso flúor.Pellizca las almohadillas de las patas de los ratones para asegurarte de que el animal esté profundamente anestesiado. También ponga ungüento en ambos ojos Para evitar que los ojos se extraigan, limpie la espalda de los ratones con una solución de povidona yodada. A continuación, inyecte una bolita de hidroxi tamoxifeno de liberación lenta con un trocar de precisión debajo de la piel de la espalda.Y empuje el perdigón hasta la línea media entre dos hombros. Selle la incisión con un aplicador de pinza para heridas y controle la recuperación de los ratones. Para anestesia.Saca los cerebros de ratón de un día y quédate con los cuatro cerebros quitando los bulbos olfativos y el cerebelo. Mantenga los cuatro tejidos cerebrales en un mililitro de medio de cultivo en frío y guárdelos a cuatro grados centígrados. Asegúrate de procesar el tejido neural en una hora.Determine el peso del tejido para asegurarse de que no se exceda el límite de 400 miligramos por digestión. Coloque el cerebro en la tapa de una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro y aplaste el cerebro con un bisturí. Con una punta de pipeta de un mililitro, agregue un mililitro de solución salina equilibrada de Hank o HBSS.A continuación, pipetee las piezas de nuevo en un tubo de 15 mililitros después de enjuagar con una centrífuga HBSS a 300 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente. Después de retirar con cuidado el sobrenadante, agregue 1, 950 microlitros de enzima precalentada. Mezcle uno por cada 400 miligramos de pañuelo.Incubar la muestra en el tubo de 15 mililitros durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Mezcle la muestra invirtiendo o agitando el tubo cada cinco minutos. A continuación, prepare 30 microlitros de enzima Mezcle dos por muestra de tejido añadiendo 20 microlitros de solución, de tres a 10 microlitros de solución cuatro.A continuación, añadir a la muestra invirtiendo suavemente para mezclar, disociar el tejido mecánicamente con una pipeta de pasta pulida al fuego de punta ancha pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces, evitando lentamente la formación de burbujas de aire. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos, invirtiendo el tubo cada tres minutos. A continuación, aplique la suspensión celular a un filtro celular de 70 micras colocado en un tubo de 50 mililitros.Aplique 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS a través del filtro de celdas. A continuación, deseche el filtro de células y centrifugue la suspensión de células a 300 veces G durante 20 minutos. Ajuste la temperatura ambiente después de la centrifugación, aspire completamente el sobrenadante.Vuelva a suspender las células con medio de células madre al volumen requerido para aplicaciones posteriores para activar el tele array en bloqueos, detener bloqueos. Células madre neurales de Turt. Tratar las células con 100 micromolares hidroxi tamoxifeno durante dos días para activar la emasa y las células madre neurales de turt er.Mantener las células en medio de cultivo con hidroxitamoxifeno de 100 micromolares para realizar peces de telómeros. En primer lugar, prepare los cromosomas en metafase a partir de células cultivadas para secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina o FFPE. Descomponer la muestra en xileno y rehidratar en una serie de etanol durante cinco minutos cada una y en PBS durante cinco minutos.A continuación, coloque el prefijo de las secciones en una proporción de tres a uno de metanol y ácido acético durante una o dos horas. Deshidratar las secciones en una serie de etanol frío durante cinco minutos cada una y lavar al aire en un XPBS a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, en la naturaleza, los cromosomas en formaldehído al 4% a 37 grados centígrados durante dos minutos.Deshidrate las secciones en una serie de etanol frío como antes y seque al aire una vez secas, aplique de 12 a 25 microlitros de la mezcla de hibridación de ácido nucleico peptídico a cada portaobjetos. Selle el cubreobjetos con cemento de caucho, preparaciones cromosómicas y secciones de tejido a 80 grados centígrados durante cuatro minutos. Luego hibridar a temperatura ambiente o 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas en una cámara húmeda.A continuación, lave las muestras a temperatura ambiente con tampón de lavado durante 15 minutos dos veces. A continuación, lávelos a temperatura ambiente durante cinco minutos con PBS y despegue 23 veces. Finalmente, contratiña los portaobjetos con DPI o fluorescencia roja lejana para un examen microscópico.Cuando los telómeros se reactivaron transitoriamente en ratones disfuncionales con telómeros, los fenotipos degenerativos pudieron mejorarse en múltiples órganos, como el cerebro y los testículos, para determinar el impacto de la reactivación de los telómeros en las células. Las células madre neurales cultivadas in vitro se aislaron de ratones ER de última generación G four lock stop, TURT y G four turt. Cuando los telómeros se reactivaron en células madre neurales disfuncionales de los telómeros, la capacidad de autorrenovación aumentó considerablemente.La neurogénesis in vitro también se mejoró significativamente para determinar el impacto de la reactivación de la masa en la tumorgénesis en el contexto de la disfunción de los telómeros, la reactivación de la masa mediante el tratamiento con tamoxifeno se realizó en un modelo de tumor de próstata. Modelo de linfoma endotético de células T. El tratamiento dio lugar a una tumorgénesis muy mejorada en ambos modelos.Por último, se realizaron peces de telómeros en FFPE, tejidos de cerebro de ratón y cromosomas de metafase. En estas imágenes, el rojo indica ADN, el verde indica tinción de telómeros y el cian indica tinción de centrómero. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo activar la actividad del trauma en mTOR ER y bloquear las cerraduras de parada, los animales mTOR y las líneas celulares, y cómo usarlos para estudiar sus preguntas sobre el cáncer y el agente.

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