Utilizando murino Inducible telomerasa alelos en los Estudios de la degeneración del tejido / Regeneración y Cáncer

El objetivo general del siguiente experimento es manipular dos alelos de golpeteo de mase inducibles en murino in vivo e in vitro para estudios de degeneración y regeneración de tejidos y estudios de cáncer. Esto se logra mediante la implantación de tabletas de hidroxitamoxifeno en animales para reactivar la mase in vivo. Como segundo paso, se aíslan células madre neurales de animales que luego se tratan con hidroxitamoxifeno para reactivar la mase in vitro.

A continuación, se realiza la fluorescencia de los telómeros en la hibridación C dos o fish tanto en las células cultivadas como en los tejidos cerebrales formales y fijados embebidos en parafina con el fin de comprobar la actividad de la masa. Los resultados mostraron que los tratamientos con hidroxitamoxifeno pueden reactivar de manera robusta la actividad de la masa, lo que puede aliviar los fenotipos de envejecimiento y promover la formación de tumores según el examen histopatológico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del envejecimiento y el cáncer, como si podemos o no ralentizar el proceso de envejecimiento modulando la actividad del trauma de TH, o cómo dirigirse específicamente a Thomas para tratar el cáncer.

Demostrando este procedimiento estarán el instructor Dr. Takashi Shingu y un técnico April Un de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la generación de los alelos Turt ER y lock stop locks turt como se describe en el protocolo de texto, esterilice todas las herramientas quirúrgicas antes de la inyección y proceda a anestesiar a los ratones como se describe en el protocolo de texto. Después de alcanzar la anestesia profunda, retire al animal anestesiado de la cámara de inducción y mantenga su cabeza dentro del tubo conectado a la cámara de iso flúor.

Pellizca las almohadillas de las patas de los ratones para asegurarte de que el animal esté profundamente anestesiado. También ponga ungüento en ambos ojos Para evitar que los ojos se extraigan, limpie la espalda de los ratones con una solución de povidona yodada. A continuación, inyecte una bolita de hidroxi tamoxifeno de liberación lenta con un trocar de precisión debajo de la piel de la espalda.

Y empuje el perdigón hasta la línea media entre dos hombros. Selle la incisión con un aplicador de pinza para heridas y controle la recuperación de los ratones. Para anestesia.

Saca los cerebros de ratón de un día y quédate con los cuatro cerebros quitando los bulbos olfativos y el cerebelo. Mantenga los cuatro tejidos cerebrales en un mililitro de medio de cultivo en frío y guárdelos a cuatro grados centígrados. Asegúrate de procesar el tejido neural en una hora.

Determine el peso del tejido para asegurarse de que no se exceda el límite de 400 miligramos por digestión. Coloque el cerebro en la tapa de una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro y aplaste el cerebro con un bisturí. Con una punta de pipeta de un mililitro, agregue un mililitro de solución salina equilibrada de Hank o HBSS.

A continuación, pipetee las piezas de nuevo en un tubo de 15 mililitros después de enjuagar con una centrífuga HBSS a 300 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente. Después de retirar con cuidado el sobrenadante, agregue 1, 950 microlitros de enzima precalentada. Mezcle uno por cada 400 miligramos de pañuelo.

Incubar la muestra en el tubo de 15 mililitros durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Mezcle la muestra invirtiendo o agitando el tubo cada cinco minutos. A continuación, prepare 30 microlitros de enzima Mezcle dos por muestra de tejido añadiendo 20 microlitros de solución, de tres a 10 microlitros de solución cuatro.

A continuación, añadir a la muestra invirtiendo suavemente para mezclar, disociar el tejido mecánicamente con una pipeta de pasta pulida al fuego de punta ancha pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces, evitando lentamente la formación de burbujas de aire. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos, invirtiendo el tubo cada tres minutos. A continuación, aplique la suspensión celular a un filtro celular de 70 micras colocado en un tubo de 50 mililitros.

Aplique 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS a través del filtro de celdas. A continuación, deseche el filtro de células y centrifugue la suspensión de células a 300 veces G durante 20 minutos. Ajuste la temperatura ambiente después de la centrifugación, aspire completamente el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células con medio de células madre al volumen requerido para aplicaciones posteriores para activar el tele array en bloqueos, detener bloqueos. Células madre neurales de Turt. Tratar las células con 100 micromolares hidroxi tamoxifeno durante dos días para activar la emasa y las células madre neurales de turt er.

Mantener las células en medio de cultivo con hidroxitamoxifeno de 100 micromolares para realizar peces de telómeros. En primer lugar, prepare los cromosomas en metafase a partir de células cultivadas para secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina o FFPE. Descomponer la muestra en xileno y rehidratar en una serie de etanol durante cinco minutos cada una y en PBS durante cinco minutos.

A continuación, coloque el prefijo de las secciones en una proporción de tres a uno de metanol y ácido acético durante una o dos horas. Deshidratar las secciones en una serie de etanol frío durante cinco minutos cada una y lavar al aire en un XPBS a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, en la naturaleza, los cromosomas en formaldehído al 4% a 37 grados centígrados durante dos minutos.

Deshidrate las secciones en una serie de etanol frío como antes y seque al aire una vez secas, aplique de 12 a 25 microlitros de la mezcla de hibridación de ácido nucleico peptídico a cada portaobjetos. Selle el cubreobjetos con cemento de caucho, preparaciones cromosómicas y secciones de tejido a 80 grados centígrados durante cuatro minutos. Luego hibridar a temperatura ambiente o 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas en una cámara húmeda.

A continuación, lave las muestras a temperatura ambiente con tampón de lavado durante 15 minutos dos veces. A continuación, lávelos a temperatura ambiente durante cinco minutos con PBS y despegue 23 veces. Finalmente, contratiña los portaobjetos con DPI o fluorescencia roja lejana para un examen microscópico.

Cuando los telómeros se reactivaron transitoriamente en ratones disfuncionales con telómeros, los fenotipos degenerativos pudieron mejorarse en múltiples órganos, como el cerebro y los testículos, para determinar el impacto de la reactivación de los telómeros en las células. Las células madre neurales cultivadas in vitro se aislaron de ratones ER de última generación G four lock stop, TURT y G four turt. Cuando los telómeros se reactivaron en células madre neurales disfuncionales de los telómeros, la capacidad de autorrenovación aumentó considerablemente.

neurogénesis in vitro también se mejoró significativamente para determinar el impacto de la reactivación de la masa en la tumorgénesis en el contexto de la disfunción de los telómeros, la reactivación de la masa mediante el tratamiento con tamoxifeno se realizó en un modelo de tumor de próstata. Modelo de linfoma endotético de células T. El tratamiento dio lugar a una tumorgénesis muy mejorada en ambos modelos.

Por último, se realizaron peces de telómeros en FFPE, tejidos de cerebro de ratón y cromosomas de metafase. En estas imágenes, el rojo indica ADN, el verde indica tinción de telómeros y el cian indica tinción de centrómero. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo activar la actividad del trauma en mTOR ER y bloquear las cerraduras de parada, los animales mTOR y las líneas celulares, y cómo usarlos para estudiar sus preguntas sobre el cáncer y el agente.