Surface Enhanced Raman Spectroscopy detección de biomoléculas mediante EBL Fabricados Nanoestructurados Sustratos

El objetivo general del siguiente experimento es fabricar y caracterizar sistemas nanobiológicos conjugados que interactúan sustratos sólidos nanoestructurados con biomoléculas inmovilizadas. Esto se logra mediante la utilización de litografía por haz de electrones de ultra alta resolución o EBL para obtener matrices de diminutas nanoestructuras metálicas sobre soportes de sílice fundida. Como segundo paso, los sustratos se colocan en solución y las biomoléculas se inmovilizan en sus superficies, produciendo las interfaces nanobiológicas.

Se emplea la espectroscopia de ramen mejorada de superficie siguiente o SIRS para sondear las moléculas biológicas en las interfaces. Los espectros sir resultantes exhiben las características del modo ramen de las moléculas particulares con intensidades fuertemente dependientes del diseño del sustrato. La principal ventaja de nuestro enfoque sobre las técnicas existentes, como la espectroscopia infrarroja, es que la sensibilidad puede mejorarse en gran medida gracias al plasma de superficie y la resonancia dentro de las nanoestructuras metálicas.

Nuestro enfoque crea superficies altamente selectivas que se pueden controlar fácilmente mediante la combinación de funcionalización molecular y litografía por haz de electrones. Este método puede responder a preguntas clave en múltiples campos, desde la exploración, la investigación en biología estructural o el servicio movilizado por polímeros, hasta el desarrollo de diversos dispositivos que involucran interfaces nanobiológicas. Estos métodos pueden proporcionar en la ciencia las propiedades estructurales de las biomoléculas con implicaciones que se extienden hacia el diagnóstico médico o la detección ambiental.

En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, ya que involucra aspectos de nanofabricación, funcionalización de superficies, bioquímica y espectroscopia, que tradicionalmente no han estado relacionados. Para lograr esto, use un girador de obleas con un mandril de vacío y coloque las muestras individualmente en el centro del mandril. Coloque una gota de resistencia de PMMA en el centro de las muestras con una pipeta de vidrio.

Luego gire a 3.500 RPM durante 60 segundos con un tiempo de aceleración de dos segundos. A continuación, hornee los sustratos a 180 grados centígrados durante tres a cinco minutos después de hornear los sustratos, enfríe las muestras a temperatura ambiente con los sustratos enfriados y regrese al mandril giratorio. Extienda una gota de polímero conductor sobre el sustrato.

Gire el sustrato durante 40 segundos a 3000 RPM con una rampa de dos segundos después del centrifugado. Hornee las muestras a 80 grados centígrados durante un minuto después de realizar la litografía por haz de electrones o la exposición EBL como se describe en el protocolo de texto, prepare un vaso de precipitados con el agua ionizada para eliminar el polímero conductor. A continuación, prepare un segundo vaso de precipitados con una mezcla de revelador y remueva durante cinco minutos, a temperatura ambiente.

Por último, prepare el isopropanol en un tercer vaso de precipitados como agente de enjuague con unas pinzas. Coloque las muestras en el agua durante tres segundos para eliminar la película de polímero conductor. Luego coloque la muestra en el revelador y mueva las pinzas lentamente hacia arriba y hacia abajo durante 20 segundos, transfiera inmediatamente los sustratos al isopropanol y enjuague durante 10 segundos más antes de secar la muestra con nitrógeno, cargue las muestras boca abajo en el sistema de evaporador de haz de electrones para permitir que el metal evaporado se deposite en la cara frontal de las muestras.

Deposite una capa de oro de 10 nanómetros de espesor sobre las muestras para los diseños uno y tres y una capa de plata de 10 nanómetros de espesor para el diseño. Dos a una velocidad aproximada de 0,1 nanómetros por segundo. A continuación, llene un sistema de sonicación con agua hasta la altura recomendada y llene un vaso de precipitados por separado con acetona.

Coloque una muestra boca arriba en el fondo del vaso de precipitados y deje que la muestra se remoje durante 10 minutos sosteniendo el vaso de precipitados. Colócalo en el baño de agua y deja que la altura de la acetona coincida con la altura del agua. A continuación, encienda el sistema de sonicación.

Permite que la sonicación se produzca durante un máximo de 60 segundos. Para preparar primero las muestras del diseño, prepare una solución milimolar de MUA y etanol a temperatura ambiente y sonique durante 10 minutos. Sumerja el sustrato nanoestructurado adecuado en la solución de MUA durante 48 horas.

A continuación, enjuague la muestra con etanol tres veces y séquela durante cinco minutos. Ajuste la temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución de 75 milimolares de EDC y agua destilada.

Prepare también una solución de 15 milimolares de NHS en agua destilada utilizando un depósito de micropipeta, 100 microlitros de NHS sobre el oro sobre el sustrato e inmediatamente agregue 100 microlitros de EDC en la misma área. Incubar durante un minuto para activar la monocapa autoensamblada de MUA. A continuación, coloque una gota de 100 microlitros de proteína, una solución en la misma zona del sustrato.

Coloque la muestra en un compartimento de una placa de Petri con un mililitro de agua destilada en otro compartimento. Selle la placa de Petri con una tapa y almacene la muestra durante 24 horas a cinco grados centígrados. A continuación, enjuague la muestra en agua destilada tres veces de forma continua las muestras en vasos de precipitados separados durante 20 segundos en cada vaso de precipitados, no deje que las muestras se sequen después del enjuague o durante el enjuague para el diseño de dos muestras.

Prepare una solución de 0,9 milimolares de proteína de unión a glucosa o GBP en tampón de fosfato de potasio. Prepare también una solución de 100 milimolares de glucosa DG en el tampón. A continuación, mezcle 30 microlitros de la solución de glucosa D y 30 microlitros de la solución GBP.

Utilizando un recipiente de microtubos de plástico de un mililitro y una micropipeta, incube durante 30 minutos, luego deposite 20 microlitros de la solución de GBP sin ligando y 20 microlitros de la solución de GBP unida al ligando sobre los sustratos preparados. Con una micropipeta, almacene las muestras a cinco grados centígrados durante 24 horas en una placa de Petri con una tapa sellada. Enjuague las muestras tres veces en la solución tampón de fosfato de potasio a temperatura ambiente para prepararlas.

Diseñe tres muestras para diluir el ápice de unión a la dopamina o la solución DBA a una concentración de un micromolar. Utilizando el tampón tris EDTA con un pH final de 7,4, prepare una solución de dopamina a una concentración de cinco micromolares midiendo el polvo de dopamina en una balanza analítica y mezclándolo con la solución salina tamponada con fosfato o PBS con una perla de agitación durante cinco minutos. A continuación, deposite una gota de 20 microlitros de la solución de DBA en la superficie de cada sustrato y deje reposar la muestra durante una hora a temperatura ambiente con una tapa sobre la placa de Petri.

Después de enjuagar las muestras tres veces en un tampón de fosfato de potasio, coloque las muestras en posición vertical sobre una toallita apta para sala limpia para secar la parte posterior mientras mantiene una película en la parte frontal del sustrato. Deje una muestra a un lado como control. A continuación, coloque una gota de cinco microlitros de la solución de dopamina sobre la superficie del PBS existente.

Deje caer las muestras restantes. Incubar las muestras durante 10 minutos antes de enjuagarlas tres veces en la solución tampón de fosfato de potasio. Para realizar espectroscopía de ramen.

Coloque cada muestra en una cámara impermeable para evitar la evaporación por exposición al láser. Llene una jeringa de plástico con grasa de alto vacío químicamente inerte. A continuación, coloque las muestras en portaobjetos de vidrio y dispense unos milímetros de grasa alrededor de las muestras sin tocar las muestras.

Coloque un cubreobjetos de microscopio encima de los sustratos. Presione suavemente hacia abajo para formar un sello, creando una interfaz líquida delgada entre los sustratos y los deslizamientos de la cubierta sin permitir que el tampón entre en contacto con la grasa de vacío. Utilizando un sistema de microscopio óptico Raman, obtenga un enfoque en la superficie de la región del patrón nanométrico metálico que se va a muestrear sin encender el láser.

Realice el muestreo Raman como se describe en el protocolo de texto que se muestra. Aquí están las matrices de puntos de patrón nano de níquel de oro y plata sobre sílice fundida. El uso de litografía por haz de electrones o EBL permite una posición y dimensión excelentes.

El control del tamaño del punto y el ancho del espacio se controla mediante la exposición EBL. Aquí se muestran las matrices de hexágonos de oro y plata níquel. El comportamiento de nucleación de capas metálicas tan delgadas da como resultado estructuras discontinuas.

Aquí está el espectro en serie de la proteína A inmovilizada por sustrato en diseño: una intensidad de señal de la matriz uno es mucho más fuerte que la de la matriz dos. La señal de la matriz tres era muy débil. El espaciado de los espacios es claramente un parámetro crítico para el desacoplamiento del plasma y la mejora de la superficie de la dispersión de ramen mostrada.

Aquí están los espectros de la proteína de unión a la glucosa que muestran los efectos de diferentes diseños de sustrato en el estado libre y unido al ligando. Finalmente, se muestran los espectros s del aptámero de unión a dopamina para moléculas libres y unidas a ligando. Se muestra un espectro de polvo de dopamina como referencia.

Al intentar este procedimiento, es importante evitar la contaminación de los sustratos. Al ser una técnica de espectroscopía muy sensible y se pueden tener lecturas falsas empleando este procedimiento. Se pueden identificar diseños de sustrato fuente óptimos para un analitos específicos.

Luego, se pueden realizar otros métodos nphy como phy no impreso para mejorar la escalabilidad de la fabricación del sustrato después de su desarrollo. Esta técnica ayudó a los investigadores en el campo de la bioquímica y la biodetección a detectar moléculas biológicas sin ciertas superficies en cantidades muy pequeñas mientras permanecían en solución. Después de ver este vídeo, debería tener una buena idea de cómo controlar el tamaño de la nanoestructura metálica y las propiedades de la película utilizando técnicas de fabricación y cómo explotar diferentes estrategias de reconocimiento biomolecular para dirigirse a diferentes analitos.