Name: Surface Enhanced Raman Spectroscopy detección de biomoléculas mediante EBL Fabricados Nanoestructurados Sustratos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprende a fabricar sustratos nanoestructurados mediante litografía de haz de electrones para detectar biomoléculas con espectroscopía SERS. Este método permite estudiar interacciones proteína-ligando con alta sensibilidad.

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Los autores desean agradecer: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside y Albert Cao por su ayuda en el desarrollo y preparación de los conjugados de proteínas, así como el aptámero de ADN; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar y Trevor Olsen por su asistencia en la preparación de la muestra, Jonathan Mane por su ayuda en la generación de imágenes de las estructuras moleculares; y las fuentes de financiación, incluido el Consejo Nacional de Investigación de Canadá – Al Instituto Nacional de Nanotecnología (NRC-NINT), al Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y a la Universidad de Alberta por apoyar el trabajo.

1. Preparación de las superficies <ol><li> Use una sierra de semiconductores dados para cortar una sílice fundida (FS) oblea en 1 cm x 1 cm o dados pequeños. </li><li> Muestras limpio en una solución de pirañas (H 2 SO 4 H 2 O 2, 3: 1; PRECAUCIÓN: fuerte oxidante) Baño de 28 durante 15 minutos, luego enjuague los dados en agua desionizada y se seca en nitrógeno. </li><li> Coloque las muestras en una placa caliente boca arriba a 180 ° C durante 15 minutos. Enfriar las muestras después de la eliminación de la placa de cocción a RT. </li><li> Para Diseños 1 y 3, vaya al paso 2. </li><li> Para Diseño 2, colocar la muestra en una cámara de evaporación por haz de electrones y la capa con una capa de 10 nm de Ni. </li></ol> 2. La fabricación de estampados-Nano Máscaras PMMA Uso de haz de electrones de litografía (EBL) <ol><li> Spin-capa del PMMA resistir y capas conductoras sobre los sustratos. <ol><li> Use un spinner oblea con un mandril vacío y colocar las muestras de forma individual en el centro de la pinza de sujeción. Lugar1 gota de polimetilmetacrilato (PMMA) resistir en el centro de las muestras usando una pipeta de vidrio y centrifugado a 3500 rpm durante 60 segundos con un tiempo de rampa de 2 seg. </li><li> Hornee los sustratos a 180 ° C durante 3-5 minutos. Después de la cocción de los sustratos, enfriar las muestras a RT. </li><li> Con los sustratos se enfriaron y se devuelven al mandril spinner, se extendió una gota de polímero conductor sobre el sustrato. Haga girar el sustrato durante 40 segundos a 3.000 rpm con un tiempo de rampa de 2 seg. Muestras Hornee a 80 ° C durante 1 min. </li></ol></li><li> Realizar una exposición EBL según el 16,17,18,29 procedimiento estándar. <ol><li> Usando las instrucciones del fabricante, preparar un diseño de la exposición empleando dosis de características de la Tabla 1 con el tamaño más pequeño posible el paso del haz. </li><li> Cargar la muestra en la cámara de litografía por haz de electrones. Si el sistema EBL no tiene el enfoque automático, utilizar un pequeño rasguño de distancia de donde el patrón se va a exponer y lejos del borde del grano para el enfoqueing. </li><li> Usando las instrucciones del fabricante, realice el enfoque requerido y corrección de astigmatismo, así como la alineación de campo de escritura en su caso, y exponer la muestra. Para tener en cuenta el perfil de la exposición adecuada y la mejor calidad patrón, utilice una energía del haz de electrones de 30 keV y 7,5 micras de abertura para las exposiciones. </li></ol></li><li> Retire el polímero conductor y desarrollar muestras expuestas. <ol><li> Preparar un vaso de precipitados con agua desionizada (DI) de agua para eliminar el polímero conductor y un segundo vaso de precipitados con una mezcla de revelador (IPA: H 2 O, 7: 3), y se agita durante 5 min a TA. Preparar isopropanol (de alta pureza) en un tercer vaso de precipitados como un agente de enjuague. </li><li> Usando las pinzas, coloque las muestras en el agua durante 3 segundos para retirar la película de polímero conductor, luego colocar la muestra en el desarrollador y mover las pinzas lentamente arriba y abajo durante 20 segundos. Transferir inmediatamente los sustratos para el isopropanol y enjuague de 10 segundos más, luego seque la muestra con nitrógeno. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Noble metal Nanoestructuras Fabrication <ol><li> Cargar las muestras boca abajo en el sistema de evaporador de haz de electrones para permitir que el metal se evaporó para ser depositado sobre la cara frontal de las muestras. Depósito a 10 nm de espesor Au capa sobre las muestras para los diseños de 1 y 3, y una capa de espesor de 10 nm Ag para el Diseño 2 a una velocidad de aproximadamente 0,1 nm / seg. </li><li> Llene un sistema de ultrasonidos para la altura recomendada con agua y llenar un vaso de precipitados separado con acetona. Coloque una cara de la muestra en el fondo del vaso y dejar que la muestra en remojo durante 10 minutos. Sosteniendo el vaso de precipitados, colóquelo en el baño de agua y deje que la altura de la acetona para que coincida con la altura del agua y encender el sistema de ultrasonidos. Permita ultrasonidos que se produzca durante un máximo de 60 segundos. </li><li> Utilizando el mismo procedimiento que se detalla en el paso 3.1, preparar sustratos del tampón uniformes Au y Ag por el depósito de 10 películas metálicas nm de espesor en FS (Designs 1 y 3) y FS recubiertos de Ni (Diseño 2) substrates saltarse el paso 2. </li></ol> 4. Bio-funcionalización de sustratos <ol><li> Preparar Diseño 1 muestras: <ol><li> Preparar una solución de 1 mM de ácido 11-mercaptodecanoic (MUA) en etanol a RT. Someter a ultrasonidos durante 10 min. </li><li> Sumerja sustrato nanoestructurado adecuada en la solución de MUA durante 48 horas. Enjuagar la muestra con etanol tres veces y seco durante 5 min a RT. </li><li> Preparar una solución de 75 mM de N-etil-N &#39;- (3- (dimetilamino) propil) carbodiimida (EDC) en agua DI. Prepare una solución de 15 mM de N hidroxisuccinimida (NHS) en agua DI. </li><li> El uso de un depósito de micropipeta 100 l de NHS en el Au sobre el sustrato, y añadir inmediatamente 100 l de EDC en la misma zona. Incubar durante 1 minuto para activar la monocapa auto-ensamblado (SAM) de MUA. </li><li> Coloque una gota 100 l de proteína A una solución (47 mM) en la misma área del sustrato y almacenar la muestra durante 24 horas a 5 ° C en un multi-compartimiento de Petri dish con 1 ml de agua DI en otro compartimiento, y con una cubierta de sellado. </li><li> Enjuague la muestra en agua DI 3 veces por agitación continua de las muestras en vasos de precipitados separados para 20 seg en cada vaso de precipitados. No dejes que las muestras se sequen después de enjuagar o durante el enjuague. </li><li> Continúe con el paso 5. </li></ol></li><li> Preparar Diseño 2 muestras: <ol><li> Preparar una solución 0,9 mM de proteína de unión a glucosa (GBP) en tampón de fosfato de potasio (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Preparar una solución de 100 mM de D-glucosa en el buffer. </li><li> Mezclar 30 l de solución de D-glucosa 100 mM y 30 l de solución 0,9 mM GBP usando un recipiente microtubo de plástico de 1 ml y una micropipeta. Incubar durante 30 min. </li><li> Depósito 20 l de la solución GBP-ligando libre y de la solución GBP ligando determinada cada uno en los sustratos preparados utilizando una micropipeta. Almacenar las muestras a 5 ° C durante 24 horas en una placa de Petri con una tapa sellada. </li><li> Enjuagar las muestras 3 veces en elsolución tampón de fosfato de potasio a RT. </li><li> Continúe con el paso 5. </li></ol></li><li> Preparar Diseño 3 muestras: <ol><li> Diluir la solución (DBA) aptámero de unión a la dopamina a una concentración de 1 mM utilizando el tampón de TRIS EDTA con un pH final de 7,4. </li><li> Preparar una solución de dopamina a una concentración 5 mM midiendo el polvo de la dopamina en una balanza analítica y mezclándolo en el tampón fosfato salino (PBS) con un cordón de agitar durante 5 min. </li><li> Depositar una gota de 20 l de la solución de DBA en la superficie de cada sustrato y dejar que las muestras se sientan durante 1 hora a RT con una cubierta sobre la placa de Petri. </li><li> Enjuagar las muestras 3 veces en un tampón de fosfato de potasio (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). </li><li> Colocar las muestras en posición vertical en la parte superior de un grado de sala limpia toallita para secar la parte trasera mientras se mantiene una película en el lado frontal del sustrato. Establecer una muestra de lado como un control. </li><li> Coloque una gota 5 l de la solución de la dopamina on la superficie de la gota existente de la solución tampón PBS en las muestras restantes con las concentraciones de dopamina deseados. Incubar la muestra durante 10 min. </li><li> Coloque una gota de la solución de la dopamina en la superficie Au almohadilla sin aptámero. Incubar durante 10 min. </li><li> Enjuagar las muestras en la solución tampón de fosfato de potasio 3 veces. </li></ol></li></ol> 5. Raman Spectroscopy <ol><li> Colocar cada muestra en una cámara a prueba de agua para evitar la evaporación por la exposición láser. <ol><li> Llene una jeringa de plástico con grasa de alto vacío químicamente inerte, colocar las muestras sobre portaobjetos de vidrio y dispensar unos pocos milímetros de grasa que rodea a las muestras sin tocar las muestras. </li><li> Coloque un cubreobjetos de microscopio en la parte superior de los sustratos y presiona suavemente para formar un sello, creando una interfaz líquida delgada entre los sustratos y los cubreobjetos sin permitir que el tampón entre en contacto con la grasa de vacío. </li></ol></li><li> El uso de unasistema de microscopio Raman óptico, obtener un enfoque en la superficie de la región de nano-modelado de metal a muestrear sin necesidad de encender el láser. </li><li> Realizar Raman de muestreo 18,19 con una intensidad del láser entre 2.4 a 3.1 mW con una duración total de menos de 20 seg para evitar el daño a la muestra con un objetivo de aumento de 10X. Adquirir los espectros Raman de las muestras de los diseños de 1, 2 y 3 utilizando las longitudes de onda de excitación, como se indica en la Tabla 1. También adquirir espectros Raman de control para soluciones de proteína A, GBP, y D-glucosa, y para el polvo de la dopamina empleando láminas de vidrio metal nanoestructuras como soportes para la comparación. </li></ol>

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<li>Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Protein+A+on+SAMs+for+the+elaboration+of+immunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Surf.+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors.</a> Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).</li>
<li>Lakowicz, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiative+decay+engineering%3A+2.+Effects+of+Silver+Island+Films+on+Fluorescence+Intensity%2C+Lifetimes%2C+and+Resonance+Energy+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer.</a> Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

SERS está ganando reconocimiento como una muy poderosa técnica de bio-detección que ofrece muchas ventajas únicas. La relación con las vibraciones moleculares permite identificar de manera selectiva &quot;huellas digitales&quot; de sustancias específicas de análisis de espectros SERS, mientras que la muy alta sensibilidad permite detectar cantidades muy pequeñas de analito 9,10,11,35. Además, SERS es una técnica no destructiva que también es relativamente insensible al agua, y por lo tanto se adapta muy bien para sondear materiales biológicos en su entorno natural, 9 acuosa. Los resultados presentados enfatizan estas ventajas también demuestran como más fuerte potencial de SERS como una técnica libre de etiquetas muy flexible de bio-detección. En tres diseños que emplean monocapas de diferentes biomoléculas sustrato inmovilizado, modos Raman se han detectado que podrían confianza atribuye a los analitos particulares. Que la detección de estas biomoléculas, or sus respectivos ligandos, se ha demostrado el empleo de superficies planas de sílice fundida como el soporte para sustratos SERS, hace que los diseños compatibles con la electrónica y ajustes actuales de microfluidos, prometiendo numerosas aplicaciones en relación con las arquitecturas de bio-electrónica de interfaz materiales biológicos con superficies de electrónica emergente y dispositivos electroquímicos 2,3. Es importante destacar que, en dos de tres diseños de detección SERS se ha demostrado para la unión específica de las pequeñas moléculas, tales como la glucosa y la dopamina, el empleo de monocapas de la proteína y aptámero inmovilizado en la superficie, respectivamente, como los elementos de reconocimiento. Sin embargo, varios aspectos deben ser atendidos con el fin de lograr un SERS bio-detección eficaz en el ajuste &quot;on-chip&quot;. En primer lugar, un desafío bien conocido que es común para la mayoría de biomoléculas es su propensión a degradarse, en particular cuando se expone a condiciones no naturales tales como ENVI secamedio o intenso de luz láser. A lo largo del protocolo, hemos hecho hincapié en la importancia de mantener siempre las muestras bio-funcionalizado sumergidos en soluciones adecuadas durante todo el experimento, desde la preparación de las muestras para la adquisición de espectros Raman. Para este último, una cámara a prueba de agua de encargo ha sido diseñado (Figura 7) para evitar la evaporación del líquido durante las exposiciones de láser. La duración de la exposición y de la intensidad del láser también se debe limitar, como se describe en el paso 5.3 del protocolo para evitar el daño de las muestras. Los resultados de la detección SERS se encuentran sensible a la geometría del sustrato empleado, y en particular la separación inter-característica de las nanoestructuras metálicas. Como se desprende de las figuras 8 y 9, la intensidad SERS de Diseño 1 muestras depende en gran medida de la anchura de los huecos entre Au nano-puntos en sílice fundida. Fuera de tres matrices de Au nanopuntos probados in este diseño (Figura 8), la mayor intensidad de Raman se logra con la matriz I, que tiene los huecos estrechos entre las características de Au y por lo tanto proporciona una mejora más eficiente campo electromagnético. Como muestra la Figura 9 ilustra, se requiere el control de las separaciones entre las características a nivel de 10 a 20 nm o menos. Empleando EBL para la fabricación de sustratos SERS, como se ha demostrado aquí, proporciona una resolución eficiente específicamente para el control de las anchuras de las brechas entre las funciones. Con una EBL-tono positivo resistir tales como PMMA, el tamaño de los agujeros en las máscaras de PMMA se puede variar simplemente cambiando las dosis de exposición. Después de lift-off esto resulta en diferentes tamaños de puntos de metal, y la anchura de los vacíos entre los puntos puede ser sintonizado como se desee mediante la selección de la exposición EBL adecuada dosis de 18. El otro reto es la optimización de la geometría sustrato SERS para la aplicación específica de detección de bio. Aunque el efecto de mejora increases con una disminución de las brechas entre las características, el tamaño relativamente grande de las moléculas biológicas impone limitaciones sobre la estrecha pueden ser los vacíos. Esto es evidente a partir de los resultados para el Diseño 2, donde el método de inmovilización es tal que la proteína se une de manera eficiente sólo a la superficie entre los puntos de metales nobles, pero no a los mismos puntos (véase la Figura 3B). Como se desprende de la Figura 10, los espectros SERS para los cojines de Ag no estructurados no muestran ninguna banda a partir del analito. Aunque las pastillas presentan una estructura nano-cristalino con brechas entre las islas muy delgadas (ver Figura 6F) estas brechas son demasiado estrechas para dar cabida a una molécula de proteína. Sin embargo, se añade otra dimensión de complejidad cuando tiene proteína ligando de unión a detectar. En la Figura 10, las bandas SERS CH son más pronunciadas en los espectros de ligando unido GBP que en el de un ligando libre, lo que puede explicarse hipotéticamente por un cambio en la conformación GBPtras la unión de D-glucosa 2 7,27, resultando en una estructura más rígida con una mayor actividad Raman. Si se comparan los dos sustratos nanoestructurados, la banda CH de la proteína-ligando libre es más fuerte en los espectros SERS obtenido con el sustrato nano-puntos, mientras que tanto las proteínas y glucosa CH bandas de proteína ligando determinada son más pronunciados con los nano-hexágonos sustrato. Se espera que dos factores para dar lugar a estas diferencias, la disponibilidad de espacio entre Ag cuenta que el GBP podría obligar a Ni, y la susceptibilidad de la proteína ligando determinada y ligando libre a la mejora electromagnético de la dispersión Raman en &quot;puntos calientes&quot; entre estas características. Por un lado, el patrón-nano puntos ofrece una zona inter-estelar relativamente grande donde recubrimiento de Ni está disponible para que la proteína se une, lo que puede explicar una banda CH más pronunciada observado para GBP libre de glucosa en Ag sustrato nano-puntos. Por otro lado, debido a su estruc no uniformetura (ver Figura 6D), Ag nano-hexágonos podría ser propensos a mostrar una mejora electromagnética fuerte en huecos estrechos entre las islas de Ag en nano-hexágonos resultando en fuertes bandas CH vibración desde GBP glucosa unida en el sustrato nano-hexágonos. Algunos detalles de esta interacción requieren mayor verificación y optimización de sustratos SERS para analitos complejos que implican proteínas de gran tamaño como el GBP se encuentra todavía en la tubería. Claramente, la detección SERS de la unión empleando biomoléculas inmovilizadas como un elemento de reconocimiento ligando se facilita cuando sólo el ligando es Raman activo en una región seleccionada, mientras que los otros componentes no son. Este es el caso de Diseño 3, donde se obtienen SERS pronunciadas bandas de dopamina aptámero unido (Figura 11). La pareja aptámero-dopamina exhibe excelente especificidad y el espectro SERS comprende bandas pronunciadas sin señal de fondo significativo. <p class="jove_content"&gt; Futuro avance de la tecnología SERS etiqueta-fee implicaría extensas pruebas de mejora de la señal SERS biomoléculas &quot;con una amplia gama de diferentes diseños nanoestructura superficie. El uso de escritura directa litografía por haz de electrones para fabricar varios nanoestructuras con un excelente nivel de control sobre el tamaño, forma, y ​​la separación inter-característica, combinada con los protocolos de preparación de muestras presentadas aquí, sería facilitar la comparación y validación cruzada de los resultados obtenidos por diferentes grupos de investigación. Esto sería abordar el importante reto de reproducibilidad cuando sustratos SERS se fabrican empleando alternativa &quot;abajo hacia arriba&quot; métodos 11,12,13, lo que permite un mejor control del tamaño de nanoestructura metálica y la posición hacia una identificación fiable de diseño óptimo sustrato para una amplia variedad de aplicaciones. Escalabilidad de estas técnicas puede posteriormente ser mejorada mediante la combinación de EBL con los métodos de nanolitografía complementarios, tales como nanoimpresión litográfica 19 hacia el futuro la producción en serie de diseños a escala nanométrica optimizado empleando las técnicas EBL sintonizables.

Capacidades para desarrollar y caracterizar los sistemas nano-biológica conjugadas interfaz nanoestructuras sólidos y polímeros biológicos se están convirtiendo cada vez más importante para nuevos avances en la próxima generación de bio-sensores y bio-tecnologías de accionamiento 1,2. Esto implica estudios multidisciplinarios a través de una serie de campos de investigación, tales como la fabricación de componentes pertinentes de estado sólido (electrodos micro-nano o, revestimientos nanoingeniería, nanocables, o nanopartículas) 2,3,4; la inmovilización de biomoléculas en las superficies para crear bioconjugados deseados 5,6,7; y el seguimiento de las interfaces de nano-biológica 1. En la mayoría de los casos, la selección de fabricación óptima, bio-funcionalización, y los métodos de caracterización es fuertemente relacionados entre sí. Claramente, la elección de las técnicas de nanofabricación sería impulsado por los requisitos de los componentes de estado sólido del sistema, siendo dependiente en gran medida del método de detección, que en tuRn es determinada por la naturaleza de los biopolímeros implicados y de la finalidad de la supervisión de la interfaz. Fuera de una amplia variedad de técnicas aplicadas a caracterizar los sistemas Bioconjugate 1,3, una mayor superficie de espectroscopia Raman (SERS) ha surgido como un método muy prometedor para la detección de especies químicas y biológicas en superficies 8,9,10,11. SERS emplea la dispersión inelástica de luz monocromática por biomoléculas inmovilizada en la superficie (Figura 1) que permiten la captura de firmas únicas correspondientes a las vibraciones moleculares. Esta capacidad para distinguir entre las diferentes moléculas sin la participación de etiquetas, química compleja, o pasos que consumen tiempo, hace SERS un método potencialmente muy eficiente de bio-detección. Otra ventaja importante de SERS es su alta sensibilidad. La excitación de plasmones de superficie localizados por la luz que interactúa con nanoestructuras de metales nobles (sustratos SERS) aumenta dramáticamente el intensity de dispersión Raman por el analito, lo que permite la detección de cantidades muy pequeñas de moléculas, a partir de monocapas hasta el límite de una sola molécula 8,9,10,11. Finalmente, la mayoría de las biomoléculas requieren soluciones acuosas para ser estable. Porque el agua a menudo tiene actividad Raman limitado, señal de fondo a partir de muestras acuosas se minimiza 9. Aplicaciones de la SERS han mostrado un aumento exponencial en la última década 10. Sin embargo, un reto muy discutido de SERS es que la mejora electromagnética de dispersión Raman depende críticamente del tamaño, la forma y el espaciamiento de nanoestructuras metálicas donde las olas plasmónicas se inducen 11,12,13. A fin de lograr SERS eficientes y reproducibles mediciones, el control sobre la geometría se requiere sustrato a las dimensiones a nanoescala. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" /> Figura 1. Scheme de la espectroscopia de Raman de superficie mayor. Numerosos métodos empleados para fabricar sustratos SERS 11,12,13 se pueden dividir en métodos de abajo arriba y de arriba hacia abajo. Los métodos de la primera tipo emplean varios procesos de auto-montaje o la síntesis química dirigida para producir nanoestructuras. A menudo abordan ejemplos incluyen la inmovilización de nanopartículas monodispersas sobre soportes sólidos 11,12,13, térmica, pulverización catódica o deposición electroquímica de películas metálicas rugosas 11,12, y diversos métodos de síntesis química 13. Aunque tales técnicas tienden a ser relativamente sencilla y económica, la mayoría de ellos son desafiados por una falta de control sobre la ubicación de las estructuras, y limitada reproducibilidad de muestra a muestra. En contraste, las técnicas de litografía de arriba hacia abajo emplean instrumentos manipulables, como haces de partículas para crear patrones deseados en las superficies. Uno de los más utilizadosmétodos de nanolitografía, litografía por haz de electrones (EBL), ofrece un control excelente sobre las características hasta por debajo de 10 nm y también una flexibilidad para permitir diferentes diseños de sustrato sobre soportes sólidos 11,12. En EBL, un haz de electrones enfocado a un lugar de unos pocos nanómetros de diámetro en las exploraciones a través de una superficie de un material sensible de electrones (resistir) causando un cambio químico en las regiones expuestas. Para tono positivo resiste como polimetilmetacrilato (PMMA), electrones resultados de exposición viga en la escisión de las cadenas poliméricas que componen la resisten, lo que lleva a un aumento de la solubilidad en un disolvente apropiado (desarrollador). El proceso de litografía por haz de electrones incluye spin-recubrimiento de una capa uniforme de resistir sobre un sustrato; la exposición del material de resistir objetivo en una cámara de vacío con un haz de electrones; y el desarrollo de la muestra para eliminar las regiones solubles. Soportes dieléctricos debajo de nanoestructuras metálicas, tales como sílice fundida, tienen been demostrado que aumenta significativamente las intensidades en SERS debido a la localización de las ondas plasmónicas comparación con otros materiales tales como el silicio 14,15. Sin embargo patrón EBL en sustratos dieléctricos, especialmente en la nanoescala, implica retos importantes debido a la acumulación de carga durante la exposición. Anteriormente, hemos demostrado 16,17 que estas dificultades se pueden superar mediante la colocación de capas de polímero conductor por encima de la resistencia. La Figura 2 muestra un esquema del proceso global de fabricación usando la exposición y el desarrollo EBL seguido por la deposición de metal y despegue para producir nanoestructuras metálicas sobre fusionado soportes de sílice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de correoLectron litografía por haz, la deposición de metal, y el proceso de despegue etapas empleadas para fabricar nanoestructuras metálicas sobre sustratos dieléctricos 16-19. En este trabajo, presentamos toda la secuencia de pasos del proceso que implican sustratos SERS fabricación por EBL, bio-funcionalización de los sustratos, y colección de los espectros de Raman. Tres diseños explorados en nuestros trabajos recientes 18,19 se abordan (ver figuras 3 y 4, y en la Tabla 1). En Diseño 1, proteína recombinante A se inmoviliza sobre bio-funcionalizado Au nanoestructuras sobre un soporte de sílice fundida (FS) 18, y la detección SERS de la proteína se demostró. En Diseño 2, la proteína 21,26,27 con y sin el ligando (D-glucosa) de unión a glucosa-recombinante se inmoviliza por medio de etiquetas de histidina en los espacios entre las nanoestructuras de Ag sobre FS recubiertos de Ni, y la unión de la glucosa a la proteína se detecta. En Diseño 3, tiolado DN unión dopamina-Un aptámero 19,23 se inmoviliza sobre Au nanoestructuras sobre FS, y la unión de la dopamina por aptámero inmovilizado se demostró. Inclusive de todos los pasos experimentales relevantes de la preparación del sustrato a la adquisición de espectros de Raman, y representativa de diferentes biomoléculas y estrategias de inmovilización, estos ejemplos son útiles para una amplia variedad de aplicaciones, desde la investigación de exploración interrogar interfaces de nano-biológica por SERS al desarrollo de SERS biosensores de moléculas pequeñas que emplean en proteínas o vinculante como método de reconocimiento de aptámero-ligando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" /> Figura 3. Esquemas de tres diseños representativas utilizando diferentes biomoléculas, los métodos de immobilización, y materiales de sustrato: (A) la proteína A inmovilizada sobre los metales nobles nano-puntos funcionalizados por una monocapa autoensamblada (SAM) de ácido 11-mercaptodecanoic (MUA) en agua DI; (B) la proteína de unión de glucosa marcado con histidina (GBP) complejado con D-glucosa inmovilizada sobre la superficie del sustrato entre el metal nano-puntos nobles; (C) terminada en tiol de unión a la dopamina aptámero completado con la dopamina (DBA) inmovilizada en metal noble nano-puntos. Véanse más detalles en la Tabla 1. En Diseño 2 se ilustra por el panel (B), una muestra sin el correspondiente ligando también se preparó para la comparación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" /> La Figura 4.Biomoléculas empleados en tres diseños: (A) la proteína A; Proteína (B) de unión de glucosa y D-glucosa; (C) de unión a DNA aptámero y la dopamina dopamina. Las estructuras terciarias de proteínas en (a) y (b) se han tomado de Protein Data Bank, AP ID 1BDD 20 y 2HPH 21, respectivamente, y dibujado con VMD para LINUXAMD64, versión 1.9.1 22. La estructura secundaria del aptámero en (c) se predice a partir de la secuencia de 23 usando ValFold 24 software y dibujado con PseudoViewer 3,0 25. Las letras G, A, T y C corresponden a la guanina, adenina, timina, citosina y nucleótidos, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Diseño 1 </td&gt; <td> Diseño 2 </td><td> Diseño 3 </td></tr><tr><td> Biopolímeros </td><td> Proteína A </td><td> Proteína de unión a glucosa (GBP) </td><td> Aptámero de unión de la dopamina (DBA) </td></tr><tr><td> Aglutinante </td><td> Ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA) monocapa autoensamblada (SAM) </td><td> Etiquetas de histidina </td><td> Enlazadores tiol </td></tr><tr><td> Ligando </td><td> Ninguno </td><td> D-glucosa </td><td> La dopamina </td></tr><tr><td> Solución </td><td> Desionizada (DI) </td><td> Tampón de fosfato potásico </td><td> Tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) y ácido etilendiaminotetraacético tampón (EDTA); Salina tamponada con fosfato (PBS) </td></tr><tr><td> Sustrato </td><td> Au estructuras en FS </td><td> Estructuras Ag en FS recubierto con Ni </td><td> Au estructuras en FS </td></tr><tr><td> Ar con dibujosea </td><td> 4 micras x 10 micras </td><td> 4 m x 8 micras </td><td> 4 micras x 10 micras </td></tr><tr><td rowspan="3"> Patrón </td><td rowspan="3"> Au puntos, 50 nm de paso </td><td> Puntos de Ag, 40 nm de paso </td><td> Hexágonos Au, pitch 200 nm </td></tr><tr><td> Hexágonos Ag, pitch 200 nm </td><td> Almohadillas no estructurados Au </td></tr><tr><td> Almohadillas no estructurados Ag </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> Dosis de exposición EBL </td><td> Puntos: </td><td> Puntos: 105 mC / cm 2 </td><td rowspan="4"> Hexágonos: 180 mC / cm 2 </td></tr><tr><td> Matriz I 120 mC / cm 2 </td><td> Hexágonos: 170 mC / cm 2 </td></tr><tr><td> Matriz II 96 mC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Matriz III 72mC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Excitación láser de longitud de onda </td><td> 532 nm </td><td> 532 nm </td><td> 780 nm </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tres proyectos de sistemas de nano-biológica.

<table><tbody><tr><td>Ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>450561&amp;nbsp; ALDRICH</td><td>Utilizado para la funcionalización superficial en el Diseño 1</td></tr><tr><td>Polímero conductor</td><td><a href="http://www.mrc.co.jp" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mitsubishi Rayon</a></td><td>aquaSAVE-57xs</td><td>Se utiliza una capa de 70 nm de espesor como recubrimiento antiacumulación de carga para exposiciones de litografía por haces de electrones (EBL)</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Laboratorio colaborador.</td><td></td><td>Ligando en el Diseño 2</td></tr><tr><td>Dopamina</td><td>Laboratorio colaborador.</td><td></td><td>Ligando en el Diseño 3</td></tr><tr><td>Aptámero de unión a la dopamina (DBA)</td><td><a href="http://www.idtdna.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integrated DNA Technologies Inc.</a></td><td>5'-/Modificador tiol C6 S-S/&amp;nbsp;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'&amp;nbsp;</td><td>Biopolímero en el Diseño 3</td></tr><tr><td>Obleas de sílice fundida</td><td><a href="http://www.markoptics.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mark Optics&lt;br/&gt;</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína fijadora de glucosa (GBP)</td><td><a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Laboratorio colaborador.</a></td><td>&lt;a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532"&gt;PDB ID 2HPH&lt;/a&gt;</td><td>Biopolímero en el Diseño 2</td></tr><tr><td>Grasa para alto vacío</td><td><a href="http://www.dowcorning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Dow Corning</a></td><td></td><td>Utilizado para sellar la cámara impermeable</td></tr><tr><td>Peroxido de hidrógeno 30%, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Utilizado para la solución de piraña</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-etilo-&lt;em&gt;N'&lt;/em&gt;-(3-(dimetilamino)propil) carbodiimida (EDC)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>03450 FLUKA</td><td>Utilizado para la inmovilización del biopolímero en el Diseño 1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Hidroxisuccinimida (NHS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>130672 ALDRICH</td><td>Utilizado para la inmovilización del biopolímero en el Diseño 1</td></tr><tr><td>Buffer de fosfato de potasio</td><td>Laboratorio colaborador.</td><td></td><td>Tampón utilizado en el muestreo de Raman</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado&amp;nbsp; salino (PBS)</td><td>Laboratorio colaborador.</td><td></td><td>Disolvente en el Diseño 3</td></tr><tr><td>Polimetilmetacrilato (PMMA) 950 A2</td><td><a href="http://www.microchem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MicroChem&amp;nbsp;</a></td><td></td><td>Se utiliza una capa de 90 nm de espesor como resist de tono positivo para litografía por haces de electrones (EBL)</td></tr><tr><td>proteína A recombinante</td><td><a href="http://www.proteinmods.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Protein Mods Inc</a></td><td>&lt;a href="http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd"&gt;PDB ID 1BDD&lt;/a&gt;</td><td>Biopolímero en el Diseño 1</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 96%, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Utilizado para la solución de piraña</td></tr><tr><td>Tampón Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>T9285 SIGMA</td><td>Buffer en el Diseño 3
&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipamiento&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Nombre&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Empresa&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Número de catálogo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comentarios&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td>Sierra cortadora</td><td>Diamond Touch Technology Inc.&lt;br /&gt;(17301 W Colfax Ave #&amp;nbsp;152, Golden, CO)</td><td></td><td>Utilizado para cortar obleas de FS</td></tr><tr><td>Evaporador por haz de electrones</td><td><a href="http://www.lesker.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Kurt J. Lesker</a></td><td></td><td>Utilizado para la evaporación de Au y Ag</td></tr><tr><td>Evaporador por haz de electrones</td><td><a href="http://www.ultrahivac.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Johnsen Ultravac (JUV)</a></td><td>JuV E-gun</td><td>Utilizado para evaporación de Ni</td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopio (25 mm)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>12-545-102</td><td>Utilizado en cámara impermeable</td></tr><tr><td>Láminas para microscopio (3&amp;times;1 pulg.)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td></td><td>Utilizado en cámara impermeable</td></tr><tr><td>Raith 150&lt;sup&gt;DOS&lt;/sup&gt; Sistema de exposición a EBL</td><td><a href="http://www.raith.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Raith Inc.</a></td><td>Raith 150&lt;sup&gt;DOS&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; sistema</td><td>Utilizado para exposiciones de EBL</td></tr><tr><td>microscopio Raman</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>Nicolet Almega XR</td><td>Utilizado para espectroscopia Raman</td></tr><tr><td>Sistema de sonicator</td><td><a href="http://www.bransonic.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Branson</a></td><td></td><td>Utilizado para el despegue y la mezcla de soluciones</td></tr><tr><td>Centrifugador de tubos</td><td><a href="http://www.brewerscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brewer Spinner y placa calefactora</a></td><td>Cee 200X y Cee 1300X</td><td>Utilizado para depositar PMMA y polímero conductor mediante centrifugado</td></tr></tbody></table>

surface enhanced raman spectroscopy detección de biomoléculas mediante ebl fabricados nanoestructurados sustratos

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Se informa de fabricación y caracterización de sistemas nano-biológica conjugadas interfaz nanoestructuras metálicas sobre soportes sólidos con biomoléculas inmovilizadas. La secuencia completa de pasos experimentales pertinentes se describe, que implica la fabricación de los sustratos nanoestructurados utilizando litografía de haz de electrones, la inmovilización de biomoléculas sobre los sustratos, y su caracterización utilizando una mayor superficie de la espectroscopia Raman (SERS). Se utilizan tres diseños diferentes de sistemas de nano-biológica, incluyendo la proteína A, proteína de unión a glucosa, y un aptámero de unión a ADN de la dopamina. En los dos últimos casos, la unión de ligandos respectivos, D-glucosa y la dopamina, también se incluye. Los tres tipos de biomoléculas se inmovilizan sobre sustratos nanoestructurados por diferentes métodos, y los resultados de formación de imágenes SERS se reportan. Las capacidades de SERS para detectar modos vibracionales de proteínas inmovilizadas en la superficie, así como para capturar el ligando de una proteína-La unión d aptámero-ligando se demuestran. Los resultados también ilustran la influencia de la geometría de la nanoestructura de la superficie, biomoléculas estrategia de inmovilización, la actividad Raman de las moléculas y la presencia o ausencia de la unión en los espectros SERS adquirido ligando.

Recogida de control de espectros Raman para los componentes principales, incluyendo las proteínas libres en solución y ligandos libres en solución o en forma de polvo sin usar sustratos que contienen metal, es importante para permitir una comparación adecuada, así como para fines de interpretación. Figura 5A presenta una Raman típico espectro para proteína libre A en agua DI en un portaobjetos de vidrio sin sustratos nanoestructurados. Dos bandas con la mayor intensidad de Raman, la banda en 2931 cm -1 ya 1091 cm -1, corresponden a vibraciones que implican enlaces CH y CS, respectivamente. Otras bandas con menor intensidad Raman como 563 cm -1, 1450 cm -1, 1653 cm -1 y 2426 cm -1, se puede atribuir a una superposición de modos de vibración 18,32,33,34. Espectros Raman de control para el GPB ligando libre en solución tampón con tres concentraciones diferentes, 0,3, 0,9 y 1,3 mm, se muestran en la Figura 5B. En t<html> él figura, la banda ancha alrededor de 3.400 cm-1 corresponde al disolvente 35, mientras que la banda en 2935 cm -1 representa las vibraciones que implican enlaces CH de la proteína 32,33. Figura 5C muestra la alta longitud de onda del espectro Raman para D-glucosa en solución tampón para diferentes concentraciones: 1, 6, 100, 200 y 400 mM. Cuando se aumenta la concentración de glucosa, bandas de enlaces CH vibración surgen a 2890 cm -1 y 2960 cm -1. Control de espectros Raman de dopamina en forma de cristal obtenido con ambas 532 nm y 780 nm longitudes de onda de excitación se muestra en la Figura 5D. Gran parte del espectro Raman viene del anillo de benceno de flexión y tramos CH de enlace de la molécula 19,36. Algunas de las bandas en torno a 3000 cm-1 sólo se observan en el 532 nm pero no 780 nm de excitación de longitud de onda. pload / 52712 / 52712fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Control espectro Raman de la proteína A en agua DI obtenerse a 532 nm de longitud de onda de excitación 18 (A); Espectros Raman de proteína de unión a glucosa-ligando libre en solución tampón obtenerse a 532 nm de longitud de onda de excitación (B); Espectros Raman de D-glucosa en la solución tampón obtenerse a 532 nm de longitud de onda de excitación (C); y los espectros de polvo de dopamina obtuvo a 532 nm y 780 nm longitudes de onda de excitación 19 (d). Todos los espectros son espectros de Raman regular de soluciones (a, b, c) y polvo de (d) en portaobjetos de vidrio sin sustratos nanoestructurados. En (D), la asignación de Raman regímenes de turnos a diferentes vibraciones moleculares se realizó utilizando general Atómica y Molecular Electronic System Estructura (GAMESS) 30 y el software MacMolPlt 31 como se detalla en otro lugar 19. Panel Reproducido (a) con permiso de 18 Americuna Sociedad de vacío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> A fin de obtener espectros SERS para biomoléculas inmovilizada en la superficie, los sustratos que comprenden nanoestructuras metálicas sobre soportes de sílice fundida se fabrican como se describe en los pasos 1-3. La calidad de sustratos fabricados se controla mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Los procedimientos estándar SEM se describen en otro 16,17,18, 19 y no se incluyen en el presente protocolo. La figura 6 muestra imágenes SEM representativas de Au y Ag nano-puntos y nano-hexágono como estructuras (paneles ad), así como la no -structured Au y Ag almohadillas (paneles E y F, respectivamente). Los próximos pasos implican la inmovilización de material biológico sobre los sustratos nanoestructurados que emplean tres diseños enumerados en la Tabla 1, y la adquisición de sus espectros SERS. En o<html> rder para mantener un entorno acuoso durante la exploración Raman, cada muestra se coloca en su solución correspondiente (véase la Tabla 1), tapado con una cubierta de vidrio delgado, y sellado como se ilustra en la Figura 7. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" /> Figura 6. microscopio electrónico de barrido (SEM) imágenes de nanoestructuras 10 nm de espesor Au y Ag de superficie utilizados como sustratos SERS: (A, B) matrices de nanopuntos; (C, D) matrices de nano-hexágonos; (E, F) almohadillas no estructurados. Sustratos con Au estructuras (izquierda) emplean soportes FS, mientras que los sustratos con estructuras Ag (derecha) utilizan una capa de Ni nm de espesor 10 en el FS. Las imágenes se obtuvieron como se describe en otro lugar 16,17,18.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" /> Figura 7. Esquema de la cámara a prueba de agua para Raman de imágenes de muestras bio-funcionalizado en solución. En Diseño 1, proteína recombinante A se inmoviliza sobre los sustratos funcionalizados por una capa monomolecular auto-ensamblada de 11-mercaptodecanoic ácido (MUA) en agua DI 18. Los sustratos en este diseño comprenden tres conjuntos de puntos de Au con un paso de 50 nm y diferentes distancias inter-punto en sílice fundida (véase Figuras 6A y 8). El proceso de la inmovilización de proteínas se inicia con la formación de una SAM sobre los sustratos. Para obtener la unión entre el SAM y la proteína covalente, los grupos ácido carboxílico de SAMs se transforman en amina reactiva-éster de NHS mediante tratamiento con una mezcla de N </em&gt;-etil-N &#39;- (3- (dimetilamino) propil) carbodiimida (EDC) N hidroxisuccinimida (NHS) en agua DI y solución. Inmovilización de la proteína A se produce por el desplazamiento del grupo NHS por residuos de lisina de la proteína 37. Un ejemplo de muestras de imagen para el diseño 1 con proteína A inmovilizada sobre Au nanoestructuras se muestra en la Figura 9. Figura 9A presenta una imagen de microscopía óptica de las muestras, que comprenden tres conjuntos de bio-funcionalizado Au nanopuntos con diferentes espacios entre puntos (véase también las figuras 3Aa y 8), y la Figura 9B muestra la asignación espectral Raman sobre estas matrices. Se puede observar que las mayores intensidades Raman se encuentran para Array I en la que los espacios entre puntos son los más estrechos, mientras que las intensidades más bajas se obtienen para Array III con mayores diferencias inter-punto. Esto puede explicarse por un efecto de acoplamiento de plasmón más fuerte producido por el aumento de fie eléctricalds en los estrechos espacios entre los puntos 18. Figura 9C muestra los espectros SERS más fuerte obtenida para matrices I y II. Los espectros muestran varias bandas (1630 cm -1, 1964 cm -1, 2280 cm -1, 2577 cm -1 y 2916 cm -1) en la proximidad de los modos Raman de proteína libre en una solución visto en la figura 5A. Atribuible a vibraciones de diversos enlaces que se encuentran en las proteínas, estas bandas o bien aparecen en lugares similares en ambos proteína inmovilizada y en solución, o se desplazan ligeramente hacia números de onda un poco más altos cuando se inmoviliza. Por el contrario, los espectros SERS de sustratos nanoestructurados similares funcionalizado por MUA SAM sin ​​la proteína muestran un patrón completamente diferente 18, lo que confirma que la Figura 9 representa la cartografía SERS de inmovilizado superficie de la proteína A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una</a><html> versión más grande de esta cifra. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" /> Figura 8. Imágenes SEM de tres matrices de Au nanopuntos sobre sustrato FS utilizados en el diseño 1 18. Las matrices tienen el mismo paso 50 nm y ligeramente diferentes radios de punto que resulta en diferentes anchuras de espacios entre puntos. Esto se logra mediante la aplicación de diferentes dosis de exposición EBL para producir máscaras de PMMA para las tres matrices (véase la Tabla 1). Dosis de exposición más altos producen agujeros más anchos en las máscaras de PMMA, lo que permite mayores tamaños de punto Au después de la metalización y el despegue. Reproducido con permiso del 18 Sociedad Americana de vacío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9. SERS de formación de imágenes de sustrato-proteína A inmovilizada en Diseño 1 18. (A) imagen de microscopio óptico de la muestra, que comprende tres conjuntos de Au nanopuntos con paso 50 nm y diferentes espacios entre puntos sobre un sustrato de sílice fundida (véase también la Figura 6), bio-funcionalizado como se muestra en la Figura 3A. (B) de mapeo Raman de la muestra. (C) SERS espectros de matriz de puntos I y II. En el panel (B), el eje vertical representa la distancia a través del sustrato, el eje horizontal representa el desplazamiento Raman, y la barra de leyenda indica las intensidades Raman. Vertical líneas discontinuas en los paneles (B) y (C) representan bandas Raman de referencia de proteína libre en una solución y (*) en el panel (C) indica bandas SERS de matriz I. El espectros Raman se obtuvieron 532 nm de excitaciónlongitud de onda. Reproducido con permiso del 18 Sociedad Americana de vacío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> En Diseño 2, la proteína recombinante de unión a glucosa (GBP) 21 complejado con D-glucosa (ligando) se inmoviliza sobre los sustratos apropiados en solución tampón de fosfato de potasio. Las muestras con inmovilizada GBP-ligando libre también se preparan para la comparación. En este diseño, la proteína de unión de glucosa se ​​une a la superficie por medio de una etiqueta de histidina, que se une así a Ni, pero no a los metales nobles 6. Desde los sustratos comprenden matrices de Ag nano-puntos, nano-hexágonos y almohadillas Ag no estructurados en FS con recubrimiento de Ni (Figuras 6B, 6D y 6F, respectivamente), uno puede esperar que la mayoría de las moléculas de proteínas inmovilizadas que se ubicará en las brechas entre Ag nanoestructuras donde recubrimiento de Ni es available. El espectros Raman obtenido para inmovilizada libre de glucosa y glucosa unida a GBP se muestra en las Figuras 10A y 10B, respectivamente. Todos estos exhiben espectros de una amplia banda a aproximadamente 3.300 cm -1, que corresponde a la solución tampón 35. Los espectros obtenidos con una almohadilla Ag no estructurada contiene sólo que esta banda única y no muestran ningún modos de vibración de proteína, lo que confirma que la proteína inmovilizada no se encuentra en la superficie de Ag como se esperaba. Por el contrario, los espectros obtenidos con matrices de Ag nano-puntos y bandas de exhibición nano-hexágonos alrededor de 1550 cm -1 y 2900 cm -1, que representan el 32,33 analito. En particular, la banda ancha alrededor de 1550 cm -1, conocida como la banda de amida II, es atribuible al péptido bonos vibraciones en proteínas 33,34. En el caso considerado, esta banda representa una superposición de los modos de vibración de GBP inmovilizadas en la superficie de Ni entre función Ags, y es indicativo de la mejora de SERS de estos modos en la zona de nanoestructuras de metales nobles cuando se usan los sustratos que contienen nano-puntos o nano-hexágonos. Esta banda es muy débil para la proteína en solución en ausencia de mejora SERS (Figura 5B) y ausente en los cojines de Ag sin la superficie de Ni disponible para la proteína de unión, pero es bien pronunciado para sustratos nanoestructurados con alguna superficie Ni accesibles para la proteína para unirse. Sin embargo, aún más importante para el presente estudio son las otras bandas, más estrechos alrededor de aproximadamente 2900 cm -1 que se pueden atribuir al enlace CH wibrations 32,33. El espectro de libre de glucosa GBP muestra una banda pronunciada a 2933 cm -1 con el sustrato nano-puntos, y una banda débil pero discernible en una longitud de onda similar con el sustrato nano-hexágonos (Figura 10A). A diferencia del caso de la proteína libre de glucosa, los espectros SERS de la glucosa unida a GBP muestra en la Figu<html> re 10B exhibición dos bandas correspondientes a CH regímenes bonos vibraciones, a 2.850 cm -1 y 2910 cm -1. Las bandas están bien pronunciadas en el espectro de GBP glucosa unida en sustrato nano-hexágonos, y también se pueden ver en el espectro de GBP sobre el sustrato nano-puntos. La banda a 2850 cm -1 es razonablemente cerca de los 2890 cm -1 uno en el espectro Raman de control de D-glucosa en solución, y por lo tanto se puede atribuir a la glucosa unido a la proteína, mientras que la otra banda (en 2910 cm -1) es atribuible a las vibraciones CH bonos tanto de la proteína y glucosa. Se puede concluir que la diferencia de firmas SERS de destino a la glucosa libre de glucosa y el sustrato inmovilizado GBP es observable en esta región, y las vibraciones CH bonos de glucosa unida a proteínas son detectables empleando el diseño descrito. 10.jpg &quot;/&gt; Figura 10. espectros SERS de ligando libre (A) y (B) la proteína de unión de glucosa unido al ligando inmovilizado sobre tres sustratos diferentes en Diseño 2. Los espectros se obtuvieron con 780 nm de excitación de longitud de onda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> En Diseño 3, el aptámero de unión a la dopamina personalizado (DBA) con terminación tiol 23 se inmoviliza en el sustrato en solución tampón tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), y la dopamina se une entonces a la aptámero inmovilizado 19. Los sustratos para este diseño contienen matrices de Au nano-hexágonos en FS (Figura 6C). No estructurados Au almohadillas (Figura 6E) también se utilizan para fines de control. Dado que el ADN es intrínsecamente fluorescente 38, 780 nm de excitación waveleng<html> ésimo se utiliza en Design 3 para reducir este factor. En este diseño, el elemento de reconocimiento (aptámero) no está activo Raman en la región de los cambios de Raman considerados en la Figura 11, mientras que la dopamina muestra una actividad Raman significativa en esta región. Dado que la señal de las muestras expuestas a sólo dopamina sin aptámero inmovilizado no muestra bandas de dopamina resultantes 19, se espera que las bandas de SERS observados para originar de dopamina aptámero de ruedas. Figura 11 compara los espectros SERS de aptámero inmovilizado en nanoestructuras de oro antes y después de la adición de dopamina. Como era de esperar, inmovilizado aptámero-dopamina libre no presenta bandas Raman. En contraste, un número de bandas Raman pronunciadas se observan para aptámero inmovilizado dopamina de ruedas. Las posiciones de la mayoría de las bandas de la Figura 11 son cercanos a los de la dopamina cristalina, aunque con diferencias en las amplitudes. igura 11 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg &quot;/&gt; Figura 11. espectros SERS de ligando libre (línea morada) y ligando determinada (línea azul) aptámero inmovilizado sobre sustratos de Au nano-hexágono en Diseño vinculante dopamina-3 19. La línea roja muestra un espectro SERS control del polvo de la dopamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos la fabricación y caracterización de sistemas nanobiológicos que interactúan sustratos nanoestructurados con proteínas inmovilizadas y aptámeros. Se describen los pasos experimentales relevantes que involucran la fabricación litográfica de sustratos nanoestructurados, la biofuncionalización y la caracterización de espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS). Se demuestra la detección de SERS de proteínas inmovilizadas en superficie y el sondaje de la unión proteína-ligando y aptámero-ligando.

Surface Enhanced Raman Spectroscopy detección de biomoléculas mediante EBL Fabricados Nanoestructurados Sustratos

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

El objetivo general del siguiente experimento es fabricar y caracterizar sistemas nanobiológicos conjugados que interactúan sustratos sólidos nanoestructurados con biomoléculas inmovilizadas. Esto se logra mediante la utilización de litografía por haz de electrones de ultra alta resolución o EBL para obtener matrices de diminutas nanoestructuras metálicas sobre soportes de sílice fundida. Como segundo paso, los sustratos se colocan en solución y las biomoléculas se inmovilizan en sus superficies, produciendo las interfaces nanobiológicas.Se emplea la espectroscopia de ramen mejorada de superficie siguiente o SIRS para sondear las moléculas biológicas en las interfaces. Los espectros sir resultantes exhiben las características del modo ramen de las moléculas particulares con intensidades fuertemente dependientes del diseño del sustrato. La principal ventaja de nuestro enfoque sobre las técnicas existentes, como la espectroscopia infrarroja, es que la sensibilidad puede mejorarse en gran medida gracias al plasma de superficie y la resonancia dentro de las nanoestructuras metálicas.Nuestro enfoque crea superficies altamente selectivas que se pueden controlar fácilmente mediante la combinación de funcionalización molecular y litografía por haz de electrones. Este método puede responder a preguntas clave en múltiples campos, desde la exploración, la investigación en biología estructural o el servicio movilizado por polímeros, hasta el desarrollo de diversos dispositivos que involucran interfaces nanobiológicas. Estos métodos pueden proporcionar en la ciencia las propiedades estructurales de las biomoléculas con implicaciones que se extienden hacia el diagnóstico médico o la detección ambiental.En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, ya que involucra aspectos de nanofabricación, funcionalización de superficies, bioquímica y espectroscopia, que tradicionalmente no han estado relacionados. Para lograr esto, use un girador de obleas con un mandril de vacío y coloque las muestras individualmente en el centro del mandril. Coloque una gota de resistencia de PMMA en el centro de las muestras con una pipeta de vidrio.Luego gire a 3.500 RPM durante 60 segundos con un tiempo de aceleración de dos segundos. A continuación, hornee los sustratos a 180 grados centígrados durante tres a cinco minutos después de hornear los sustratos, enfríe las muestras a temperatura ambiente con los sustratos enfriados y regrese al mandril giratorio. Extienda una gota de polímero conductor sobre el sustrato.Gire el sustrato durante 40 segundos a 3000 RPM con una rampa de dos segundos después del centrifugado. Hornee las muestras a 80 grados centígrados durante un minuto después de realizar la litografía por haz de electrones o la exposición EBL como se describe en el protocolo de texto, prepare un vaso de precipitados con el agua ionizada para eliminar el polímero conductor. A continuación, prepare un segundo vaso de precipitados con una mezcla de revelador y remueva durante cinco minutos, a temperatura ambiente.Por último, prepare el isopropanol en un tercer vaso de precipitados como agente de enjuague con unas pinzas. Coloque las muestras en el agua durante tres segundos para eliminar la película de polímero conductor. Luego coloque la muestra en el revelador y mueva las pinzas lentamente hacia arriba y hacia abajo durante 20 segundos, transfiera inmediatamente los sustratos al isopropanol y enjuague durante 10 segundos más antes de secar la muestra con nitrógeno, cargue las muestras boca abajo en el sistema de evaporador de haz de electrones para permitir que el metal evaporado se deposite en la cara frontal de las muestras.Deposite una capa de oro de 10 nanómetros de espesor sobre las muestras para los diseños uno y tres y una capa de plata de 10 nanómetros de espesor para el diseño. Dos a una velocidad aproximada de 0,1 nanómetros por segundo. A continuación, llene un sistema de sonicación con agua hasta la altura recomendada y llene un vaso de precipitados por separado con acetona.Coloque una muestra boca arriba en el fondo del vaso de precipitados y deje que la muestra se remoje durante 10 minutos sosteniendo el vaso de precipitados. Colócalo en el baño de agua y deja que la altura de la acetona coincida con la altura del agua. A continuación, encienda el sistema de sonicación.Permite que la sonicación se produzca durante un máximo de 60 segundos. Para preparar primero las muestras del diseño, prepare una solución milimolar de MUA y etanol a temperatura ambiente y sonique durante 10 minutos. Sumerja el sustrato nanoestructurado adecuado en la solución de MUA durante 48 horas.A continuación, enjuague la muestra con etanol tres veces y séquela durante cinco minutos. Ajuste la temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución de 75 milimolares de EDC y agua destilada.Prepare también una solución de 15 milimolares de NHS en agua destilada utilizando un depósito de micropipeta, 100 microlitros de NHS sobre el oro sobre el sustrato e inmediatamente agregue 100 microlitros de EDC en la misma área. Incubar durante un minuto para activar la monocapa autoensamblada de MUA. A continuación, coloque una gota de 100 microlitros de proteína, una solución en la misma zona del sustrato.Coloque la muestra en un compartimento de una placa de Petri con un mililitro de agua destilada en otro compartimento. Selle la placa de Petri con una tapa y almacene la muestra durante 24 horas a cinco grados centígrados. A continuación, enjuague la muestra en agua destilada tres veces de forma continua las muestras en vasos de precipitados separados durante 20 segundos en cada vaso de precipitados, no deje que las muestras se sequen después del enjuague o durante el enjuague para el diseño de dos muestras.Prepare una solución de 0,9 milimolares de proteína de unión a glucosa o GBP en tampón de fosfato de potasio. Prepare también una solución de 100 milimolares de glucosa DG en el tampón. A continuación, mezcle 30 microlitros de la solución de glucosa D y 30 microlitros de la solución GBP.Utilizando un recipiente de microtubos de plástico de un mililitro y una micropipeta, incube durante 30 minutos, luego deposite 20 microlitros de la solución de GBP sin ligando y 20 microlitros de la solución de GBP unida al ligando sobre los sustratos preparados. Con una micropipeta, almacene las muestras a cinco grados centígrados durante 24 horas en una placa de Petri con una tapa sellada. Enjuague las muestras tres veces en la solución tampón de fosfato de potasio a temperatura ambiente para prepararlas.Diseñe tres muestras para diluir el ápice de unión a la dopamina o la solución DBA a una concentración de un micromolar. Utilizando el tampón tris EDTA con un pH final de 7,4, prepare una solución de dopamina a una concentración de cinco micromolares midiendo el polvo de dopamina en una balanza analítica y mezclándolo con la solución salina tamponada con fosfato o PBS con una perla de agitación durante cinco minutos. A continuación, deposite una gota de 20 microlitros de la solución de DBA en la superficie de cada sustrato y deje reposar la muestra durante una hora a temperatura ambiente con una tapa sobre la placa de Petri.Después de enjuagar las muestras tres veces en un tampón de fosfato de potasio, coloque las muestras en posición vertical sobre una toallita apta para sala limpia para secar la parte posterior mientras mantiene una película en la parte frontal del sustrato. Deje una muestra a un lado como control. A continuación, coloque una gota de cinco microlitros de la solución de dopamina sobre la superficie del PBS existente.Deje caer las muestras restantes. Incubar las muestras durante 10 minutos antes de enjuagarlas tres veces en la solución tampón de fosfato de potasio. Para realizar espectroscopía de ramen.Coloque cada muestra en una cámara impermeable para evitar la evaporación por exposición al láser. Llene una jeringa de plástico con grasa de alto vacío químicamente inerte. A continuación, coloque las muestras en portaobjetos de vidrio y dispense unos milímetros de grasa alrededor de las muestras sin tocar las muestras.Coloque un cubreobjetos de microscopio encima de los sustratos. Presione suavemente hacia abajo para formar un sello, creando una interfaz líquida delgada entre los sustratos y los deslizamientos de la cubierta sin permitir que el tampón entre en contacto con la grasa de vacío. Utilizando un sistema de microscopio óptico Raman, obtenga un enfoque en la superficie de la región del patrón nanométrico metálico que se va a muestrear sin encender el láser.Realice el muestreo Raman como se describe en el protocolo de texto que se muestra. Aquí están las matrices de puntos de patrón nano de níquel de oro y plata sobre sílice fundida. El uso de litografía por haz de electrones o EBL permite una posición y dimensión excelentes.El control del tamaño del punto y el ancho del espacio se controla mediante la exposición EBL. Aquí se muestran las matrices de hexágonos de oro y plata níquel. El comportamiento de nucleación de capas metálicas tan delgadas da como resultado estructuras discontinuas.Aquí está el espectro en serie de la proteína A inmovilizada por sustrato en diseño: una intensidad de señal de la matriz uno es mucho más fuerte que la de la matriz dos. La señal de la matriz tres era muy débil. El espaciado de los espacios es claramente un parámetro crítico para el desacoplamiento del plasma y la mejora de la superficie de la dispersión de ramen mostrada.Aquí están los espectros de la proteína de unión a la glucosa que muestran los efectos de diferentes diseños de sustrato en el estado libre y unido al ligando. Finalmente, se muestran los espectros s del aptámero de unión a dopamina para moléculas libres y unidas a ligando. Se muestra un espectro de polvo de dopamina como referencia.Al intentar este procedimiento, es importante evitar la contaminación de los sustratos. Al ser una técnica de espectroscopía muy sensible y se pueden tener lecturas falsas empleando este procedimiento. Se pueden identificar diseños de sustrato fuente óptimos para un analitos específicos.Luego, se pueden realizar otros métodos nphy como phy no impreso para mejorar la escalabilidad de la fabricación del sustrato después de su desarrollo. Esta técnica ayudó a los investigadores en el campo de la bioquímica y la biodetección a detectar moléculas biológicas sin ciertas superficies en cantidades muy pequeñas mientras permanecían en solución. Después de ver este vídeo, debería tener una buena idea de cómo controlar el tamaño de la nanoestructura metálica y las propiedades de la película utilizando técnicas de fabricación y cómo explotar diferentes estrategias de reconocimiento biomolecular para dirigirse a diferentes analitos.

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Investigación

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Ingeniería

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