Explorando la aplicación de la biodetección basada en dispersión Raman mejorada en superficies de sEVs individuales en el diagnóstico y terapias de enfermedades

Utilizamos dispersión Raman mejorada por superficies combinada con aprendizaje automático para abordar el diagnóstico temprano del cáncer y también ofrecer aplicaciones biomédicas. Un desafío experimental clave es la heterogeneidad inherente en las muestras de exosomas, los datos espectroscópicos altamente complejos y de alta dimensión, que se ven aún más agravados por una baja relación señal-ruido. Para empezar, pipetea aproximadamente cinco microlitros de la pequeña muestra de vesícula extracelular sobre el sustrato plasmónico designado.

Coloca el sustrato en un desecador para que la gota se seque completamente durante aproximadamente 15 minutos. Luego transfiere el sustrato seco a un microscopio Raman confocal. Utilizando el software WiRE versión 4.4, inicia la recogida de datos.

Ajusta el láser de excitación a 785 nanómetros a cinco milivatios y calibra el sistema. Para adquirir espectros del sustrato dorado, realizar un escaneo de exploración en un área de 300 por 300 micrómetros para localizar vesículas individuales usando modo estático con un paso de 10 micrómetros, exposición de 0,1 segundos y potencia láser del 50%. Una vez localizadas las vesículas, realiza un mapeo de alta resolución en modo estático dentro de una cuadrícula de cinco por cinco usando un paso de un micrómetro, 0,2 segundos de exposición por punto y un 50% de potencia láser.

A continuación, adquiere espectros del sustrato de grafeno realizando los siguientes escaneos. Examina los espectros iniciales en bruto y excluye aquellos que muestren ruido excesivo o formas espectrales anormales. Aplica un filtro Savitsk-Golay a cada espectro para reducir el fondo de fluorescencia y suavizar los datos espectrales.

Calcula la relación señal-ruido para cada espectro utilizando el método pico-línea base o el método de desviación estándar. Para cada espectro, calcular la relación señal-ruido como la relación entre la intensidad máxima tras la resta de la línea base en una banda Raman representativa y la desviación estándar del ruido. Estima el ruido restando una versión suavizada de Savitsky-Golay del espectro, usando un tamaño de ventana de 11 y un orden polinómico de tres del espectro original.

Ordenar todos los espectros en orden ascendente de la relación señal-ruido y evaluar la persistencia de los picos diagnósticos a lo largo de los espectros clasificados para determinar el umbral. Luego se establece el umbral en el punto donde cualquiera de estos picos desaparece en ruido de referencia correspondiente a una relación señal-ruido de 28. Excluir espectros que estén por debajo del umbral de relación señal-ruido de 28 para asegurar que solo se conserven espectros de alta calidad para el análisis posterior.

Y normalizar cada espectro restante hasta su máxima intensidad máxima o el área total bajo la curva. Asigna una etiqueta a cada medición espectral según su origen, como un paciente con cáncer gástrico o un control sano. Introduce los datos espectrales etiquetados en un clasificador de vector de soporte con núcleo lineal y aplica una división estratificada de barajado para una validación cruzada de cinco veces y así asegurar una representación equilibrada en cada pliegue.

Ahora, promedia las métricas de precisión en todos los pliegues para evaluar el rendimiento general del modelo. Finalmente, utiliza análisis discriminante lineal, o LDA, para reducir la dimensionalidad del conjunto de datos de dispersión Raman mejorado en la superficie para la visualización. Emplea el modelo entrenado de análisis discriminante lineal para realizar la clasificación directa entre los grupos muestrales.

Los espectros Raman con los espectros promedio correspondientes revelaron firmas moleculares distintas en cada tipo de muestra adquiridas a partir de pequeñas vesículas extracelulares individuales aisladas de muestras de tejido, sangre y saliva. El análisis discriminante lineal reveló un claro agrupamiento de los datos de las vesículas extracelulares según su tejido de origen, sangre o saliva. La clasificación binaria mediante un clasificador de vector de soporte alcanzó la mayor precisión para muestras de tejido con un 90,1%, seguidas por sangre con un 70,9% y saliva con un 60,7%, las divisiones de clasificación basadas en LDA separaron claramente muestras sanas y de cáncer gástrico en datos extracelulares de vesículas extracelulares derivadas del tejido.

Divisiones similares de clasificación basadas en LDA para datos de vesículas extracelulares derivadas de sangre y saliva mostraron una separación menos óptima entre muestras sanas y de cáncer. Los espectros Raman de vesículas incubadas con doxorrubicina sin grafeno mostraron picos consistentes en aproximadamente 1.081, 1.206 y 1.440 centímetros inversos. Con grafeno, se observó un pico adicional de D de aproximadamente 1.350 centímetros inversos y un pico de G de aproximadamente 1.580 centímetros inversos que sirvieron como estándares internos.

La proporción entre el pico de doxorrubicina de 442 centímetros inversos y el pico de grafeno G aumentó con mayores concentraciones de fármacos y tiempos de incubación más largos. Hemos establecido una única huella bioquímica de la vesícula para distinguir las fuentes de la enfermedad que muestran potencial para un diagnóstico precoz. Tres ventajas clave de nuestra técnica.

Primero, es muy sensible. Segundo, no es invasivo. y tercero, no requiere lisar ni descomponer físicamente las partículas.

En el futuro, correlacionaremos el perfil espectral con el perfil proteómico, lo que, a su vez, ayudaría a correlacionar el contenido del exoma con funciones específicas, como la comunicación celular y el transporte.