Name: El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende a expandir células madre del cáncer de páncreas mediante cultivo independiente de anclaje. Este método permite estudiar la biología de CSC y desarrollar terapias dirigidas contra el cáncer pancreático.

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La presente investigación fue apoyada por una ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención nº 256974 (EPC-TM-NET) y nº 602783 (CAM-PAC ), la Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 y PI12 / 02643), y el Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, España). E. Lonardo fue apoyado por Roche Fellowship. M. Cioffi fue apoyada por el Programa de Becas Predoctorales La Caixa.

PDAC tumores humanos se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito (Comunidad de Madrid, España (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) La implantación de los tumores pancreáticos humanos en ratones inmunodeficientes requiere la aprobación de la Junta de Revisión Institucional, así como institucional . Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) Los procedimientos de modelos de ratón de tumores pancreáticos xenoinjertos deben llevarse a cabo de conformidad con las normas institucionales y nacionales (aquí Comité de Ética del Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España; Protocolo PA 34_2012). 1. Medios de Cultivo <ol><li> Preparar medio completo. <ol><li> Suplemento medio RPMI con 10% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. Para 500 ml de RPMI añaden 55 ml de FBS inactivado por calor y 6 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml, 100X). </li><li> Guarde el medio completo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar CSC Medio. <ol><li> Complementar la DMEM / F12 mediu libre de suerom con 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina y glutamina 2 mM. </li><li> Guarde el medio CSC a 4 ° C. B27 (1:50) y 20 ng / ml bFGF están recién añadidos al medio antes de cada experimento. NOTA: La adición de B27 se ha demostrado que aumentar la formación de esfera tumor y para sostener varios pasajes de las culturas esfera 32. La composición del medio es un paso crucial y tiene que hacerse la prueba de cada tipo de células en cultivo. Se recomienda la prueba de auto-renovación y la capacidad de diferenciación de esferas y analizamos la expresión de marcadores de CSC por citometría de flujo (es decir, CD133 + y CD44 +). </li></ol></li><li> Preparar extracelular Flux medio de ensayo. <ol><li> Este medio específico es DMEM basal 5030 que contiene vitaminas, aminoácidos y otros suplementos, pero que carece de glutamina, glucosa, piruvato y bicarbonato. </li><li> Para el ensayo actual, suplementar el medio con glutamina 2 mM, glucosa 8 mM y piruvato de sodio 2 mM a una actividad metabólica mitocondrial completo. NOTA: La ausencia de bicarbonato de sodio es esencial con el fin de medir con precisión la acidificación extracelular de las células que crecen en cultivo, desde medio que contiene regular de bicarbonato se amortiguar las variaciones del pH durante el ensayo. Además, el uso de un medio basal permite un estrecho control de la concentración de L-glutamina (como L-alanil-glutamina) glucosa, piruvato de sodio o necesario para diferentes condiciones de ensayo y / o aplicaciones. </li></ol></li></ol> 2. Esfera ensayo de formación y análisis NOTA: Todos los protocolos de cultivo de tejidos y manipulaciones deben realizarse mediante técnicas estériles con gran atención el uso limpio, libre de detergente, cristalería estéril. Antes de usar, pre-cálido todo el medio y la solución en un baño de agua a 37 ° C (como alternativa, puede utilizar las soluciones pre-calentado a temperatura ambiente media y). Obtener tumores PDAC humano como se detalla anteriormente 21. <ol><li> El aislamiento de células madre cancerosas de PDAC humano (Figura1) <ol><li> En una cabina de bioseguridad estéril transferir el tejido PDAC humano a una placa de cultivo de 60 mm x 15 que contiene 1 ml de 1X fosfato solución salina estéril tamponada (PBS). Picar el tumor en trozos pequeños (1-5 mm) utilizando un bisturí y pinzas estériles. </li><li> Añadir 1 ml de 1X PBS estéril a la placa de cultivo y repita el paso de trituración hasta que el tejido está completamente disociado, regularmente esto requiere 3-4 rondas. Transferir la suspensión de tejido (parte superior hasta un volumen final de 5 ml con PBS 1X) en un tubo estéril y homogeneizar mecánicamente con un disociador tales como gentleMACS. </li><li> Incubar el tejido homogeneizado con colagenasa (usar 2,5 mg / ml de colagenasa en 1X PBS) durante 60 min a 37 ° C y centrifugar durante 5 min a 900 x g. Decantar el sobrenadante y resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de medio completo. Se filtra la suspensión celular a través de un colador de 40 micras y centrifugar durante 5 min a 900 x g. </li><li> Decantar el sobrenadante y resuspender elsedimentar con 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (amonio-cloruro de potasio, ACK), e incubar la </li><li> Resuspender el precipitado en medio CSC, placa en un plato recubierto con gelatina, y se incuba a 37 ° C durante 1 h. Este paso eliminar la mayor parte de las células de fibroblastos que se adhieren rápidamente a la placa. </li><li> Retirar la placa de la incubadora y recuperar cuidadosamente suspensión de células y cuantificar el número de células viables (azul de tripano negativas) utilizando un hemocitómetro. Para este propósito, mezclar suavemente la suspensión y la pipeta 20 l de la suspensión en un tubo Eppendorf. Añadir 20 l (1: 1 ratio) de azul de tripano a las células en el tubo de microcentrífuga y mezclar bien. Pipetear aproximadamente 10 l de la mezcla sobre el hemocitómetro. </li><li> Contar todas las células claras dentro de los cuatro cuadrantes de esquina de la cámara de recuento para recuento de células viables. Nota: La viabilidad y el rendimiento de las células pueden variar considerablemente entre las muestras tumorales. Para PDAC muestras viabilidad varía regularmente between 45-70%, y las piezas de tejido de una muestra de tumor macroscópico con un diámetro de de 3 - 5 mm deben ceder a aproximadamente 5x10 6 células viables. </li></ol></li><li> Esfera Formación Ensayo y metformina Tratamiento <ol><li> Tome el número requerido de células y añadir el volumen apropiado de medio de CSC para preparar una concentración celular de 2.000 células / ml. No mantenga la suspensión de células en hielo durante no más de 1 hora y se mezcló bien antes de chapado. </li><li> Añadir 500 l de 1X PBS para la primera y última fila de una placa de 24 pocillos para la humidificación con el fin de ayudar a minimizar el medio de la evaporación. Seed las células en placas de células ultra-bajas de fijación a una densidad de 2000 células por pocillo en 1 ml de medio de esfera tumor (2.000 células / ml). NOTA: El número de células utilizadas para los ensayos de formación de tumor esfera puede variar entre los tipos de tumores. </li><li> Tratar al menos 4 pocillos con vehículo (control negativo) y 4 pozos con cada tratamiento asignado, por ejemplo., 3 ​​mM de metformina. Plas las células en una incubadora a 37 ° C y el suministro de las células con 5% de CO 2 durante una semana. NOTA: El medio no debe ser cambiado con el fin de permitir la formación de esferas sin perturbaciones tumorales, pero se puede recargar con factores de crecimiento sobre una base diaria, ya que no son estables en medio de cultivo. </li><li> Cada dos días añadir tratamiento, por ejemplo., 3 ​​mM de metformina o vehículo a cada uno de los pocillos. Evaluar el número de esferas tumorales formados después de 5 y / o 7 días por el uso de un contador de células automatizado que permite para el recuento de las estructuras más grandes (Figura 2). NOTA: Sólo esferas tumorales con al menos 40 micras se debe considerar y puede ser categorizado como pequeña (40 - 80 m) o grande (80 a 120 micras), respectivamente. Los resultados se pueden ilustrar como el porcentaje de esferas de tumor dividido por el número inicial de células sembradas (por ejemplo, 2000 células). </li></ol></li><li> Pases seriados de Esferas tumorales Generación <ol&gt; <li> Después de 7 días de incubación cosechar las esferas tumorales utilizando un filtro de células de 40 micras y centrifugar durante 5 min a 900 xg a TA. </li><li> Disociar el pellet de esferas tumorales a células individuales utilizando tripsina, a continuación, expanda la suspensión célula células individuales obtenida de nuevo por otros 7 días, como se describe anteriormente (véase 2.2). </li></ol></li></ol> Análisis Metabolismo 3. (ROS Producción y Consumo de Oxígeno) <ol><li> ROS Producción <ol><li> En este protocolo, hemos utilizado carboxi DCFDA como ejemplo para medir la producción de ROS, ya que es una sonda asequible, rápida y ampliamente utilizado para la detección de ROS. Sin embargo, hay varias otras sondas y metodologías que se pueden utilizar para este ensayo. </li><li> Tratar esferas tumorales con metformina como se describe en 2.2 para el monto asignado de tiempo. Al final del tratamiento, esferas tumorales cosecha utilizando un filtro de células de 40 micras, centrifugar las células a 900 xg durante 5 min y resuspender el sedimento en 1 ml de trypsen. Se incuba durante 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Una vez que las células se singularizado, centrifugar a 900 xg y resuspender las células en HBSS que contienen 2,5 M carboxi-DCFDA. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C en la oscuridad. </li><li> Antes de la citometría de flujo análisis de proteger las células teñidas de luz como carboxi-DCFDA puede ser foto-oxida dando resultados positivos falsos. Coloque los tubos en hielo hasta su análisis. NOTA: carboxi-DCFDA es fluorescente después de su detección reacción con una variedad de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, en FL1 (ex 488 nm, em 520 nm..). </li></ol></li><li> Consumo de oxígeno Medición <ol><li> Para este protocolo, vamos a utilizar el sistema extracelular Flux Analizador de Seahorse Biosciences, como un ejemplo. Escudo de la placa de cultivo celular deseada con una solución de 22,4 g / ml de células y adhesivo tisular durante 20 min a RT. Lavar los pocillos con agua 2 - 3 veces antes de la siembra de las células. </li><li> Al final del tratamiento, esferas tumorales cosecha usando un 4Filtro de células 0 micras, centrifugar las células a 900 xg durante 5 min y resuspender el precipitado en 1 ml de tripsina. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Placa de células en la placa de cultivo celular singulariza a una densidad de 30.000 células / pocillo para una placa de 96 pocillos (volumen final: 150 l). Resuspender las células en medio de ensayo El consumo de oxígeno que contiene glucosa y 8 mM piruvato de sodio 2 mM. </li><li> Centrifugar las células a la parte inferior del pozo por giro de la centrifugación de los pocillos hasta que se ha alcanzado 100 xg y luego dejar que la parada de centrífuga con freno de apagado. Invertir la orientación de la placa y repetir el proceso. La transferencia de la placa a una incubadora a 37 ° sin adición de CO 2 durante 30 min. </li><li> Mientras tanto, preparar el cartucho para el ensayo. Cada pozo tiene 4 inyectores diferentes para cargar (25 l / puerto): <ol><li> Puerto A: metformina. Para obtener una concentración final de 3 mM en el pozo, preparar una solución de 8x (24 mM) como el volumen final será 175l después de la inyección de puerto A. </li><li> Puerto B: metformina. Para añadir 3 mM y obtener una concentración final de 6 mM en el pozo, preparar una solución de 9x (27 mM) como el volumen final será de 200 l después de la inyección de puerto B. </li><li> Puerto C: metformina. Para añadir 3 mM y obtener una concentración final de 9 mM en el pozo, preparar una solución de 10x (30 mM) como el volumen final será 225 l después de la inyección de puerto C. </li><li> Port D: rotenona 11 mM, para obtener 1μM como concentración final en el pozo (11x). Nota: rotenona inhibe completamente cualquier actividad mitocondrial residual. </li></ol></li><li> Calibrar el cartucho y cargar la placa de cultivo celular. Realizar el ensayo con el protocolo estándar de mezcla y medición. </li><li> Calcular el porcentaje de inhibición de la respiración mitocondrial total alcanzada por la metformina como el porcentaje de inhibición obtenido con rotenona (establecido como 100%). </li></ol></li></ol> 4.Modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano en ratones inmunodeprimidos NOTA: Solicitar un número suficiente de modelos femeninos atímicos desnudos u otras, más inmunocomprometidos ratón como NOD-SCID, SCID-beige o NSG para los experimentos 33. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes del experimento, y deje que se enfríen a temperatura ambiente antes de su uso. Para los tumores subcutáneos se utilizó un mínimo de 4 ratones por condición con un solo tumor por flanco para un total de 8 tumores. <ol><li> Xenoinjerto Trasplante <ol><li> Preparar piezas tumorales de muestras humanas de tejido de cáncer de páncreas. Transferir el tumor en una placa de Petri y diseccionar el tejido en trozos pequeños (2 mm de diámetro, ~ 8 mm 3) usando un bisturí y pinzas para mantener el tejido. Sumerja las piezas obtenidas en la solución mezcla de proteína gelatinosa mantuvieron en hielo. </li><li> Anestesiar ratones utilizando 1-3% isofluorano oa otros anestésicos por inhalación o inyectables. NOTA: Antes de iniciar cualquier proc quirúrgicaedure, asegúrese de que los ratones han perdido completamente la conciencia mediante la estimulación de la piel del abdomen o remolques con un par de pinzas en astilla. Aplicar pomada para los ojos para evitar la sequedad. </li><li> Una vez que la anestesia ha surtido efecto, limpie la parte posterior de los ratones con la piel que contiene etanol antiséptico. Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg BW) antes de la cirugía para garantizar la analgesia postoperatoria. </li><li> Levantar la piel de la espalda con fórceps, hacer una 0,7-1,0 cm de largo incisión con tijeras estériles micro y luego preparar sin rodeos un pequeño bolsillo subcutáneo, en el que se inserta un trozo de tejido de cáncer pancreático derivado del paciente (~ 8 mm 3). </li><li> Cierre la herida con 1-2 grapas de piel. Eliminarlos después de 7 días. Regreso a los ratones a sus jaulas y mantenerlos en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calentamiento hasta que estén totalmente activa de nuevo. </li><li> A raíz de la implantación del tumor, monitorear los ratones por lo menos dos veces por semana para el crecimiento del tumor y los signos generales de que surja la morbilidad como la piel de volantes, hunched postura, y la inmovilidad. </li><li> Una vez que los tumores han alcanzado un tamaño promedio de 200 mm 3, los ratones se asignaron al azar a los tratamientos respectivos. Administrar vehículo o metformina al día a través de inyecciones ip (150 mg / kg BW) oa través del agua potable (150 mg / kg de peso corporal) con los efectos del tratamiento comparables. </li><li> Monitorear la carga tumoral usando un calibrador y calcular el volumen del tumor una vez a la semana (medición del volumen del tumor = 1/2 × longitud x anchura aliento). </li><li> Sacrificar los ratones una vez que los tumores han alcanzado 1 cm de diámetro o ratones empiezan a mostrar signos de dolor o enfermedad grave como se especifica anteriormente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún interés en competencia a revelar.

Con el surgimiento y posterior validación del concepto de CSC para muchos tumores, el campo del desarrollo de fármacos ha adquirido un nuevo impulso, con el potencial para el desarrollo de tratamientos contra el cáncer más eficientes y, posteriormente, la reducción del riesgo de recaída de la enfermedad. Sin embargo, el campo de CSC se encuentra todavía en un estado temprano y aún queda mucho por lograr en términos de comprensión origen CSC y propagación, y su papel en la conformación de la arquitectura del tumor y la promoción de la metástasis. En este contexto, el uso de ensayos CSC reproducibles y significativos, así como la interpretación de los datos informados obtenido representa un componente crucial para avanzar en nuestra comprensión de la biología de CSC. Desde muchos puntos de vista biológico, la formación de la esfera se ha convertido en un ensayo de gran valor; no obstante, los usuarios deben ser conscientes de sus limitaciones para poder interpretar adecuadamente sus resultados experimentales. Un aspecto importante a tener en cuenta, incluso antes de la evaluación de la esfera-formadatos de la es el origen de la muestra investigada, ya que los resultados obtenidos de las muestras derivadas del paciente frescas podrían ser significativamente diferentes de los obtenidos a partir de líneas celulares de cáncer establecidas. Ensayos de formación de esfera clásicos implican la siembra de células a una densidad clonal en placas ultra bajo de fijación y la evaluación de la formación de esfera en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y / o factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF) enriquecido, pero medio libre de suero 21, 34. La composición del medio de cultivo es también un tema importante a considerar. En nuestra experiencia, se encontró que el DMEM / F12 suplementado con B27, bFGF y glutamina en ausencia de suero fue un medio óptimo para crecer, expandir y mantener la CSC en condiciones indiferenciadas. Se encontró que en estas condiciones de cultivo (medio y suspensión) de las células expresan altos niveles de marcadores de células madre del cáncer (incluyendo CD133 +, CD44 + y CD24 +) y no expresan proteínas de diferenciación asociada (CK-20 Y CK-19). Una de las suposiciones fundamentales para estos ensayos es que cada esfera es clonal, es decir, una esfera resulte de la expansión de una sola célula madre. Sin embargo, las esferas son intrínsecamente estructuras dinámicas que son propensos a fundirse incluso a baja densidad de siembra 35. Plating células es un paso crítico en el protocolo y la densidad de una célula / pocillo sin duda puede eludir el problema de agregación. Pero incluso para progenitores de forma prospectiva según, esto da como resultado regularmente en la formación de muy baja esfera debido a la baja actividad intrínseca formación esfera y también se puede atribuir a la estimulación autocrina limitado debido a los efectos de dilución. En nuestra experiencia hemos observado que sólo el 30% de las células sembradas son capaces de formar esferas. Recomendamos el uso de al menos 100 células / pocillo para obtener resultados consistentes y reproducibles. Otros métodos de cultivo a CSC crecimiento se basan en las culturas 3D sólidos o semi-sólidos (por ejemplo, sobre la base de matrigel, colágeno o metilcelulosa). Estos métodos se han utilizado para limitar la movilidad celular y agregación celular posterior 36. Sin embargo, cada una de estas matrices lleva sus propias limitaciones. Por ejemplo, matrigel es una membrana basal soluble aislada de la Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumor y aunque el extracto se asemeja el complejo entorno extracelular tumor se encuentra en muchos tejidos, contiene múltiples factores de crecimiento más o menos definidos, que a menudo vuelve mecanicista estudios para elementos reguladores específicos muy difíciles. Otro punto de consideración es que las funciones celulares esfera de formación de capacidad y la madre no son términos intercambiables 34. Aunque se han mostrado ciertas células madre y progenitoras para exhibir fracaso esfera de formación de capacidad 37, para generar esferas in vitro no excluye in vivo la función madre / progenitoras. Por ejemplo, las células madre quiescentes no pueden simplemente responder a las señales extracelulares proporcionados por elseleccionada en condiciones de cultivo in vitro. Por lo tanto, a largo plazo in vitro e in vivo la capacidad de auto-renovación de las poblaciones celulares purificadas, preferentemente durante los pases en serie, debe ser evaluado con el fin de probar o refutar la función de células madre. En este contexto, la capacidad de propagarse de forma prospectiva y simultáneamente diversas poblaciones de células madre y progenitoras es un aspecto crucial del ensayo de formación de esferas y hace que este ensayo de gran valor para el campo de CSC; siempre y cuando sus limitaciones se tienen en cuenta para la interpretación de los datos obtenidos. Ensayos de formación de esferas han sido ampliamente utilizados para identificar células madre retrospectivamente basándose en su capacidad de auto-renovación y diferenciación en el nivel de células individuales in vitro. El descubrimiento de los marcadores que permiten el aislamiento prospectivo de células madre y su progenie de su nicho in vivo permite que las propiedades funcionales de las poblaciones purificadas a ser definidos. El combination de ensayo de formación de la esfera y la FACS es una estrategia exitosa para aislar células de tejido sólido o enriquecer subpoblaciones específicas de PDAC en la cultura. Por ejemplo, la expresión simultánea de EpCAM, CD24 y CD44 define una subpoblación de células madre cancerosas capaces de: auto-renovación, diferenciar e iniciar un tumor, lo que refleja la heterogeneidad del tumor original. Hermann et al. mostraron que las células CD133 + poseían capacidad de proliferación aumentada y CSC cuenta con 15. Otros marcadores también se han utilizado para la caracterización de células madre cancerosas: expresión (1-deshidrogenasa aldehído) ALDH- 1 se asocia con células altamente tumorigénicas en el cáncer de páncreas 38; células capaces de excluir el colorante Hoechst 33342 de ADN, la población lado llamado células (SP), tienen la capacidad probada para iniciar tumores 39. Recientemente hemos demostrado que un compartimiento subcelular autofluorescencia caracteriza a una población distinta de células humanas con rasgos CSC exclusivos a través de diferentes tipos de tumores40. Aunque ninguno de estos marcadores parece caracterizar selectivamente una población pura de células madre cancerosas, más y más complejas combinaciones de marcadores necesitan ser utilizado para purificar poblaciones FACS más refinadas de células. Muchas preguntas siguen siendo sobre el papel preciso de CSC en el origen, la progresión y la resistencia a los medicamentos de los tumores. Por ejemplo, una manera de abordar la cuestión de la evolución clonal para definir si y cómo un único CSC inicia un tumor, podría ser para analizar muestras de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad, y específicamente seguir los números de células madre cancerosas durante y después del tratamiento. Al responder a estas preguntas, podemos hacer un progreso significativo de nuestro conocimiento de los CAC en tumores sólidos y desarrollar terapias farmacológicas para prevenir la progresión tumoral y en última instancia, recaída.

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es uno de los tumores sólidos más agresivos. Es actualmente el 4º muerte más común relacionada con el cáncer en la sociedad occidental y está previsto que aumente a la causa 2ª más frecuente en la próxima década (~ 400 000 muertes al año en todo el mundo) 3 .Al momento del diagnóstico el 90% de los pacientes presentan con enfermedad avanzada, que tiene una supervivencia a los 5 años de menos de 5%. Esta tasa de supervivencia se ha mantenido sin cambios decepcionantemente en los últimos 50 años a pesar de las actividades de investigación cada vez más intensivos 4. Del 10% restante de los pacientes que tienen potencialmente la enfermedad &quot;curable&quot; a través de la resección quirúrgica, el 80% morirá de recurrencia dentro de los 5 años. Durante muchos años el estándar de cuidado para la enfermedad avanzada ha sido monoterapia gemcitabina, pero esto sólo confiere una ventaja de supervivencia marginal 5. Las pequeñas mejoras en la supervivencia a corto plazo han sido alcanzados por la adiciónde erlotinib 6 o 7 capecitabina, sin embargo, el beneficio de supervivencia es del orden de semanas con la mediana de supervivencia global todavía de ~ 6 meses. Recientemente, los resultados más alentadores han surgido de gemcitabina / nab -paclitaxel 8 y la combinación FOLFIRINOX régimen 9,10. Estas terapias mejoran la supervivencia media de un modesto 2 y 4 meses, respectivamente, pero son altamente tóxicos y sobrevivientes a largo plazo siguen siendo una rara excepción. Aunque el tratamiento ofrece el potencial de mejora, se trata de regímenes tóxicos a los que muchos pacientes no responden o sólo se muestran mejora incremental en la supervivencia global. Como consecuencia, hay una urgente necesidad de complementar las terapias actuales y para desarrollar nuevos enfoques terapéuticos multimodales más probables. La heterogeneidad del tumor Cada vez es más evidente que la heterogeneidad cáncer no sólo se limita a distinta evolutivo subclones within cada tumor 11, pero también impulsado por la heterogeneidad fenotípica y funcional y la plasticidad dentro de cada subclon 12. Las llamadas células madre del cáncer (CSC) o células tumorales de promoción son responsables de la heterogeneidad intraclonal 13-16. Específicamente, CSC representan un subconjunto de células cancerosas, para el que nosotros y otros han aportado pruebas concluyentes, abajo a la celda individual, que representan la raíz de la enfermedad, dando lugar a todas progenie diferenciada dentro de cada subclon cáncer 17. Más importante, estas células son esenciales para el comportamiento metastásico y también representan una fuente importante para la recaída de la enfermedad después del tratamiento, incluso con fármacos relativamente eficaces capaces de inducir la regresión del tumor inicial (por ejemplo, -paclitaxel NAB) 15,18-20. Es importante señalar que CSC no representan necesariamente de buena fe las células madre, ni tampoco surgen de las células madre de tejido, en muchos casos, sino más bien tienen acqpedirá otra ciertas características de las células madre. La mayoría de estos son funcionalmente definido, por ejemplo CSC están equipadas con indefinida capacidad de auto-renovación haciéndolos resistentes a la quimioterapia convencional, y muestran una mayor invasividad que promueve la actividad metastásica. Funcionales madre del cáncer fenotipos celulares El fenotipo funcional de CSC se basa en su capacidad de auto-renovación, que puede ser probado in vitro utilizando la formación de la esfera de serie y ensayos de formación de colonias, respectivamente. Aún más importante, CSC capaces de oso auto-renovación en la tumorigenicidad in vivo que pueden ser probados por dilución limitante en ensayos in vivo como la lectura funcional final, de preferencia durante el trasplante de serie indicativo de exclusiva tumorigenicidad a largo plazo. Por otra parte, existe heterogeneidad dentro del compartimiento de CSC, con una subpoblación diferente de células madre cancerosas que llevan la capacidad exclusiva de dar lugar a metástasis que no es sólo unaconsecuencia directa de su exclusivo en la tumorigenicidad in vivo. De hecho, CSC metastastitic adquieren la capacidad de evadir el tumor primario, sobrevivir anoikis y eventualmente trasladar y sembrar sitios secundarios. Estas capacidades funcionales avanzadas pueden ser probados in vitro utilizando ensayos de invasión y modificados in vivo usando ensayos de metástasis. Orientación células madre del cáncer Nosotros y otros han aportado pruebas convincentes de que los tratamientos se centra en el tumor mayor de células diferenciadas PDAC, incluso en combinación con agentes estroma de metas, no tienen un impacto importante en la progresión del tumor y el resultado posterior a menos que se combina con una estrategia de metas de CSC 21, 22. Por lo tanto, basado en las funciones cruciales de células madre cancerosas en progresión de la enfermedad y resistencia a la terapia, estas células deben significar un componente esencial para cualquier enfoque de tratamiento novela 18,20, pero se requiere un conocimiento mucho más exhaustivo of la maquinaria reguladora del CSC. Aunque los CAC y sus progenies más diferenciadas tienen idénticos estados fundamentales genéticos con respecto a alteraciones genéticas, CSC exhiben la expresión de genes distintos y por lo tanto epigenéticamente determinado perfiles módulos compartir con células madre pluripotentes. La mayoría de los genes implicados en la generación de células madre pluripotentes inducidas (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) solamente no se han relacionado con el cáncer, pero su expresión se restringe al compartimento de células madre cancerosas. Por otra parte, la relevancia funcional de CSC por la pérdida de la función de experimentos utilizando herramientas genéticas para la orientación CSC ahora han establecido firmemente el concepto de CSC para varios tipos de cáncer 23-25. Si bien la mayoría de estos enfoques se basan en modelos de ratón y por lo tanto no son fácilmente transferibles a la clínica, ellos proporcionan una prueba de concepto para el potencial relevancia clínica de orientación CSC en combinación con células tumorales a granel. El estudio de las células madre del cáncer En Vitro identificar talón Su Aquiles Con el fin de identificar formas nuevas y clínicamente aplicables para la orientación CSC, sus características se estudian regularmente in vitro y la formación de la esfera es ampliamente utilizado en este contexto. Originalmente desarrollado para el estudio de la biología de células madre normales, incluyendo la auto-renovación y capacidad de diferenciación, este ensayo fue posteriormente adaptado para estudiar células madre cancerosas in vitro y se ha utilizado para la investigación de células madre cancerosas aisladas a partir de 20 PDAC. Hemos encontrado que las esferas de tumores formados a partir de células humanas primarias PDAC tienen todas las características distintivas de los CAC, por lo tanto, lo que indica que contienen células madre cancerosas pancreáticas de buena fe 21. Por lo tanto, el ensayo esfera tumor representa una poderosa herramienta para la detección de las terapias más eficaces in vitro, pero los resultados deben evaluarse aún más en más estrictos ensayos in vivo. De hecho, los datos generados con este ensayo in vitro deben ser tratados con gran cautela, ya ªensayo e puede estar sujeto a error significativo. Protocolos altamente estandarizados, incluyendo el conteo automatizado de esferas formadas, deben ser establecidos para asegurar que los datos reproducibles y predictivos. En este contexto, recientemente utilizó este ensayo para detectar células madre cancerosas pancreáticas derivadas de un conjunto diverso de PDAC humanos primarios y demostró que estas células son altamente vulnerables a la reprogramación metabólica por la metformina compuesto antidiabético. Anteriormente, la metformina se había demostrado para inhibir la expansión de células de cáncer por la activación indirecta de AMP-activated proteína quinasa (AMPK) de señalización y la posterior inhibición de mTOR 26, lo que resulta en una reducción de la síntesis de proteínas y la proliferación celular 27. Además de estos efectos sobre la población tumor a granel, nosotros y otros han encontrado que la metformina es capaz de dirigirse y eliminar la subpoblación de células madre cancerosas en un número de tumores sólidos como los de mama, cáncer de esófago, glioblastoma y el cáncer de páncreas 28-31 &lt;realidad/ Sup&gt;. Por lo tanto, la metformina representa una nueva estrategia terapéutica prometedora y segura para varios tipos de cáncer con necesidad médica no satisfecha actualmente. Además, utilizando la formación de esfera como una manera de enriquecer en células madre cancerosas, hemos demostrado que los efectos primarios de la metformina sobre células madre cancerosas pancreáticas era independiente de la activación de AMPK y en su mayoría se basó en su toxicidad mitocondrial modesto (a través de la inhibición del complejo I), que aparentemente era letal para el subconjunto de CSC solamente. Para este último, pudimos evaluar su consumo de oxígeno y la producción de ROS mitocondrial celular como indicadores de la toxicidad de la droga a nivel celular. Posteriormente, estos datos in vitro podrían ser validados en modelos preclínicos de ratón y de hecho dio lugar a prolongó significativamente la supervivencia 31. La metodología presentada en este documento permite la rápida generación de perfiles de sensibilidad de medicamentos para los CSC, incluyendo estudios sobre sus efectos sobre el metabolismo de CSC. Nos ofrecen ahora ampliamos detalles experimentales acerca de la com utilizadocomplementario in vitro y en los procedimientos in vivo.

<table><tbody><tr><td>Cámara de recuento/Hemocitómetro&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>CASY Contador y analizador de células para la medición de proliferación y viabilidad</td><td>Roche Innovatis</td><td>AG CASY Modelo TTC 45,60,150 &mu; m</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Disociator&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubos&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fijación ultrabajas de 24 pocillos&nbsp;</td><td>Placas de cultivo de tejidos Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>de 100 mm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de polipropileno de 15 ml&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de polipropileno de 50 ml&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>tubos estériles de 1,5 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri estériles, placas de 10 cm&nbsp;</td><td>Agujas Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>26 G&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>100 ul Jeringa Hamilton&nbsp;</td><td>Jeringa Hamilton Co</td><td>81075</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV&nbsp;</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medio 1640&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina/estreptomicina, 100X&nbsp;</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Metformina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D150959-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM, 100X&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>100mM Solución de piruvato de sodio &nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Caballito de mar Medio de ensayo&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Cell-TAK Adhesivo para células y tejidos&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina, 0,05%&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento 50x&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Factor básico de crecimiento de fibroblastos&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada Mediana/F12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1x Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Carboxi-DCFDA(5-(y-6)-Carboxi-2',7'-DiclorofluoresceínaDiaceto)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>C-369</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70% (vol/vol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano</td><td>IsoVet, Braun</td><td>571105.8</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35620</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador estéril con punta de algodón</td><td>&nbsp; Puritan medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF96e FluxPak con placas de celdas, calibrador y cartuchos</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>XF96e Analizador de flujo extracelular</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora con entrada de CO2&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras Pinzas</td> curvas Pinzas <td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>astilla Pinza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el estudio de cáncer de páncreas tallo características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) contiene un subconjunto de células madre de cáncer exclusivamente tumorigénicas (CSC) que han sido mostrados para conducir la iniciación del tumor, metástasis y resistencia a la radio y quimioterapia. Aquí se describe una metodología específica para el cultivo de células madre cancerosas pancreáticas humanas primarias como esferas tumorales en condiciones de anclaje independiente. Las células se cultivan en condiciones libres de suero, no adherentes con el fin de enriquecer en células madre cancerosas mientras que sus progenie más diferenciadas no sobreviven y proliferan durante la fase inicial después de la siembra de células individuales. Este ensayo se puede utilizar para estimar el porcentaje de células madre cancerosas presentes en una población de células tumorales. Tanto el tamaño (que puede oscilar desde 35 hasta 250 micrómetros) y el número de esferas tumorales formadas representa la actividad del CSC albergado en cualquiera de las poblaciones a granel de células de cáncer cultivadas o tumores recién cosechadas y digeridos 1,2. Utilizando este ensayo, recientemente hemos descubierto que la metformina ablación selectiva pancreatCSC ic; un hallazgo que fue corroborado posteriormente aún más, demostrando la expresión disminuida de los genes marcadores de pluripotencia asociada / superficie y reduce en tumorigenicidad in vivo de células tratados con metformina. Como paso final para el desarrollo preclínico tratamos a ratones portadores de tumores establecidos con metformina y encontramos prolongó significativamente la supervivencia. Estudios clínicos que evalúan el uso de metformina en pacientes con PDAC están actualmente en curso (por ejemplo, NCT01210911, NCT01167738, y NCT01488552). Mecánicamente, encontramos que la metformina induce una crisis de la energía fatal en los CSC mediante la mejora de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la reducción de la producción potencial transmembrana mitocondrial. En contraste, los no CSC no fueron eliminados por tratamiento con metformina, sino más bien se sometieron a la detención del ciclo celular reversible. Por lo tanto, nuestro estudio sirve como un ejemplo exitoso para el potencial de la formación in vitro esfera como una herramienta de detección para identificar compuestos que potencialmente se dirigen CSCs, pero esta técnica se requieren más in vitro e in vivo de validación para eliminar las falsas descubrimientos.

La metformina se dirige selectivamente a células madre cancerosas pancreáticas Primero examinamos los efectos funcionales de tratamiento con metformina en la capacidad de auto-renovación in vitro de células madre cancerosas. Para este propósito, hemos llevado a cabo ensayos de formación de esfera utilizando células pancreáticas cancerosas humanas primarias aisladas de tejidos resecados PDAC durante la cirugía. Hemos observado que la metformina disminuyó fuertemente el tamaño de las esferas formadas (figura 1A). Esto era más probable mediante la inhibición de la expansión de la progenie de CSC, que aún representan la mayor parte de las células que se encuentran en las esferas, ya que sólo se enriquecen de CSC. De hecho, las esferas más largos se cultivan sin pases el más extenso de la expansión de progenie más diferenciados será. Así encontramos metformina para disminuir significativamente el número de esferas en realidad formados independientemente de su tamaño, que se producen de una manera dependiente de la dosis lo que sugiere una fuerte inhibición de la capacidad de auto-renovación de CSCs (datos no mostrados). Encontramos que la metformina en 3 mM disminuyó significativamente el número de esferas formado (Figura 1B). Con el fin de estudiar más rigurosamente los efectos a largo plazo de la metformina sobre la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas, que posteriormente pasaron las esferas primarias formadas en esferas secundarias y terciarias. Aunque sólo esferas primarias fueron tratados con metformina, la formación de esferas en las segunda y tercera pasajes fue drásticamente y cada vez más reducido, lo que implica el tratamiento con metformina había eliminado de hecho irreversiblemente la mayoría de las células madre cancerosas (Figura 1C). Por lo tanto, nuestros datos mostraron efectos significativos del tratamiento para la metformina en la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas pancreáticas primarios y por lo tanto nos animó a realizar más mecanicista, así como los estudios in vivo. La metformina inhibe el consumo de oxígeno mitocondrial y induce la producción de ROS Desde metformin se muestra para actuar como un veneno mitocondrial mediante la inhibición de la actividad del complejo I parcialmente, el próximo examinó los efectos agudos de la metformina sobre el consumo de oxígeno celular en las células de esfera derivada. Para este propósito, se seleccionaron las células derivadas de dos tumores primarios PDAC representativos y se midió el consumo de oxígeno con el tiempo después de la inyección secuencial de metformina 3 mM (tres inyecciones) y 1 rotenona mu M (una inyección). Como se muestra en la Figura 2A, la inyección de metformina indujo una disminución rápida y dependiente de la dosis en el consumo de oxígeno, que variaba considerable entre los diferentes tumores. Se calculó la actividad mitocondrial residual tras el tratamiento con metformina mediante la inyección de rotenona, un complejo potente inhibidor I, que es capaz de inhibir completamente el consumo de oxígeno mitocondrial. Sensibilidad a la metformina en términos de consumo de oxígeno mitocondrial correlacionada con su capacidad para inducir la producción de ROS se define como un desplazamiento de la media de la popumento después de tratamiento con metformina (Figura 2B, panel izquierdo), que se puede cuantificar fácilmente (Figura 2B, panel derecho). Como era de esperar, las células primarias que fueron más sensibles a la inhibición del consumo de oxígeno también mostraron el mayor aumento en la producción de ROS en tratamiento con metformina. Por lo tanto, estos experimentos metabólicos in vitro demuestran que los objetivos de metformina células madre cancerosas mediante la inhibición de su dependencia de la función mitocondrial, lo que resulta en un aumento posterior en la producción de ROS mitocondrial y, finalmente, la inducción de la apoptosis. Metformina Puestos PDAC Progresión En Vivo Finalmente Estudiamos los efectos de la metformina in vivo utilizando xenoinjertos de tejido derivados de diferentes pacientes con PDAC. Se observó una reducción significativa en la progresión del tumor para los ratones tratados con metformina en comparación con el grupo de control, pero los tumores no completamente DISAppeared (Figura 3). Posteriormente, durante el seguimiento de todos los tumores a largo plazo con el tiempo en recaída que sugiere resistencia metformina de células supervivientes de la fase inicial del tratamiento. Sin embargo, el tratamiento con metformina, incluso cuando se aplica como agente único, amplió significativamente la supervivencia en todos los ratones. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Figura 1. La metformina se dirige selectivamente a la CSC. (A) La metformina disminuye el tamaño de las esferas. Imágenes representativas de esferas obtenidas después del tratamiento con las dosis indicadas de la metformina para 7 días (panel derecho). La cuantificación del tamaño de esfera (n≥6) (panel izquierdo), los números indicados en el eje de abscisas representa tumor individual. (B) la capacidad de formación de Esfera en la presencia o ausencia de la metformina durante 7 días (n≥6), los números indicados en abscisaseje representan tumor individual. (C) gráfico Representante de CSC capacidad de auto-renovación en esferas secundarias y terciarias de las células de cáncer de páncreas primarios. Las esferas solamente fueron tratados durante la formación de la esfera de primera generación para un total de 7 días (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Figura 2. La metformina inhibe Tratamiento Consumo de Oxígeno e induce ROS Producción. (A) la adición de metformina inhibe el consumo de oxígeno (OCR) de las células derivadas de esfera. Dos esferas secundarias PDAC diferentes fueron tratados con metformina y cambios de OCR se midieron por análisis de flujo extracelular. Inyección rotenona se utilizó como control para el consumo total mitocondrial OCR.Eje X representa la tasa de consumo de oxígeno en pmol de oxígeno / hr normalizado por el contenido de proteína en cada pocillo. esferas (B) PDAC utilizados en A fueron tratados durante 8 horas con metformina y la producción de ROS se evaluó mediante citometría de flujo utilizando carboxi DCFDA. A la izquierda, un resultado representativo citometría de parcelas. Derecha, resumen de los datos de tres experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Figura 3. La metformina Puestos PDAC Progresión En Vivo. Dos tejidos diferentes xenoinjertos PDAC se implantaron en ratones inmunodeprimidos y el tratamiento se asignó después se verificó toma tumor inicial. Los ratones fueron tratados con metformina (Met) añaden al agua potable (150 mg / kg cuerpo weilucha; basado en 5 ml de consumo de agua por día). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las células madre de cáncer de páncreas (CSC) pueden expandirse in vitro utilizando la técnica de cultivo de esfera independiente del anclaje, que representa una poderosa herramienta para estudiar la biología de las CSC y puede servir como primer paso para desarrollar nuevas terapias dirigidas a las CSC. Aquí se proporciona la metodología para expandir, analizar y dirigirse a las CSC pancreáticas.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

El objetivo general del siguiente procedimiento consiste en expandir células madre cancerosas in vitro mediante una técnica de cultivo independiente de anclaje, y luego evaluar los efectos metabólicos de nuevas terapias dirigidas a las células madre cancerosas. Esto se logra primero disociando una muestra de tejido de adenocarcinoma pancreático humano en una suspensión de células individuales. En una segunda etapa, el tejido tumoral se digiere adicionalmente con enzimas y luego se siembra en una placa de gelatina. Para eliminar la población de células fibroblásticas, las células cancerosas aisladas se siembran entonces en una placa multi-pocillo de adherencia ultrabaja, y se tratan con el fármaco de interés para evaluar la actividad metabólica y la formación de esferas tumorales.Finalmente, el fármaco de interés puede utilizarse en ratones inmunodeprimidos portadores de xenoinjertos derivados de pacientes para validar los efectos del fármaco in vivo. Este método es una herramienta poderosa para estudiar la biología de las células madre cancerosas y sirve como primer paso para desarrollar nuevas terapias dirigidas a las células madre del cáncer. La demostración del procedimiento estará a cargo de mí misma, una investigadora junior del Centro de Células Madre en Cáncer y Envejecimiento del Instituto de Cáncer de Mama, y de Tini Cruz, estudiante de doctorado de mi laboratorio, para aislar células madre cancerosas de un adenocarcinoma ductal pancreático en una cabina de seguridad biológica estéril.Utilice un escalpelo y pinzas estériles para trocear el tumor humano en una placa de cultivo de 60 por 15 milímetros que contenga un mililitro de PBS estéril, agregando otros tres a cuatro mililitros de PBS según sea necesario hasta que el tejido se disocie completamente. Transfiera la suspensión de tejido a un tubo cónico estéril y agregue PBS hasta alcanzar un volumen final de cinco mililitros. Luego, homogenice mecánicamente la muestra con una centrífuga de disociación y digiera el tejido homogenizado con colagenasa a 37 grados Celsius.Tras una centrifugación de una hora, realice la resuspensión del botón celular en 10 mililitros de medio completo. Filtre la suspensión celular a través de un tamiz de 40 micrómetros y centrifugue nuevamente las células. Esta vez, realice la resuspensión del botón en cinco mililitros de un CK. Tras cinco minutos a temperatura ambiente, elimine el tampón de lisis de glóbulos rojos mediante centrifugación y resuspenda el botón en medio para células madre cancerosas.Luego, incubar las células en una placa recubierta con gelatina a 37 grados Celsius para eliminar la mayoría de las células fibroblásticas que se adhieren rápidamente. Después de una hora, recuperar el sobrenadante y cuantificar el número de células de cáncer pancreático viables para facilitar la formación de esferas tumorales en el cáncer. Para el enriquecimiento de células madre, diluir las células en el volumen adecuado de medio para células madre cancerosas hasta una concentración final de dos veces 10 a la tres células por mililitro, y enfriarlas en hielo durante unos minutos.Luego, después de agregar 500 microlitros de PBS a las filas primera y última de una placa de 24 pocillos con adherencia ultrabaja, resuspender las células mediante pipeta y sembrar un mililitro de células por pocillo en los pocillos vacíos de la placa. Tratar cuatro pocillos de células con el fármaco de interés y al menos cuatro pocillos de control negativo con el vehículo. A continuación, incubar las células a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono durante una semana.Cada dos días, agregue tratamiento fresco al vehículo en cada uno de los pocillos. En los días cinco o siete, evalúe el número de esferas tumorales formadas mediante un contador celular automatizado que permita la identificación de estructuras más grandes para el envasado en serie de las esferas tumorales. En el día siete, utilice un filtro celular de 40 micrómetros para recolectar las esferas.A continuación, centrifugar las esferas e incubarlas en un mililitro de tripsina durante 20 minutos a 37 grados Celsius para disociar el sedimento en una suspensión de células individuales. Luego, expandir las células durante otros siete días tal como se acaba de demostrar para preparar las esferas para la medición de su producción de especies reactivas de oxígeno o ROS. Tras la disociación tal como se acaba de demostrar, centrifugar las esferas y resuspender el sedimento en HBSS que contiene la sonda adecuada. Tras una incubación de 20 minutos a oscuras a 37 grados Celsius, colocar las células en hielo hasta su análisis mediante citometría de flujo para preparar las esferas para la medición de su consumo de oxígeno.Primero, recubra una placa de cultivo celular de 96 pocillos con un adhesivo para células y tejidos durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, disocie las esferas con tripsina según se ha demostrado. Luego, lave la placa dos o tres veces con agua para eliminar el exceso de adhesivo y siembre las células individuales a tres veces 10 a la quinta células por pocillo.En 150 microlitros de medio de ensayo de consumo de oxígeno que contiene glucosa y piruvato de sodio, adhiera las células al fondo de los pocillos mediante centrifugación hasta alcanzar 100 veces G. Permita que la centrifuga se detenga sin freno. Luego invierta la orientación de la placa y repita la centrifugación.Ahora incube las células durante 30 minutos a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono. Mientras tanto, cargue los cartuchos de ensayo: A, B y C. Inyecte 25 microlitros de una concentración de tres, seis y nueve milimolar del fármaco de interés, respectivamente, y el cartucho D con 25 microlitros de una concentración de un micromolar del inhibidor mitocondrial rotenona.Cuando las células estén listas, calibre el cartucho y cargue la placa de cultivo celular. Finalmente, realice el ensayo con el protocolo estándar de mezcla y medición. En estos experimentos representativos, el tratamiento de células madre de cáncer pancreático con metformina redujo considerablemente el tamaño y el número de las esferas tumorales. Además, estas reducciones se observaron en cultivos de esferas secundarias y terciarias.Aunque solo se trató la cultura de esferas primarias con metformina, se ha reportado que la metformina actúa como un inhibidor mitocondrial. De hecho, en este experimento, se observó que el fármaco induce una disminución rápida y dependiente de la dosis en el consumo de oxígeno en las células tumorales, lo que se correlaciona con su capacidad para inducir la producción de ERO. Es importante destacar que los ratones tratados con metformina muestran una reducción a corto plazo pero significativa en la progresión del adenocarcinoma pancreático en comparación con los animales control.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo disociar tumores humanos frescos, aislar células cancerosas primarias, establecer un cultivo de formación de esferas y evaluar la actividad metabólica de las células madre del cáncer de páncreas.

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