El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

El objetivo general del siguiente procedimiento es expandir las células madre cancerosas in vitro utilizando una técnica de cultivo independiente de Anchorage y, a continuación, probar los efectos metabólicos de las nuevas terapias dirigidas a las células madre cancerosas. Esto se logra disociando primero una muestra de tejido de adenocarcinoma de páncreas humano en una suspensión de una sola célula. En el segundo paso, el tejido tumoral se digiere aún más con enzimas y luego se siembra en una placa de gelatina. Para eliminar la población de células de fibroblastos, las células cancerosas aisladas se siembran en una placa de múltiples pocillos de fijación ultra baja y se tratan con el medicamento de interés para evaluar la actividad metabólica y la formación de las esferas tumorales.

En última instancia, el fármaco de interés puede utilizarse en ratones inmunocomprometidos portadores de xenoinjertos derivados de pacientes para validar los efectos del fármaco in vivo. Este método es una herramienta poderosa para estudiar la biología de las células madre cancerosas y sirve como primer paso para desarrollar nuevas terapias dirigidas a las células madre cancerosas. Para aislar células madre cancerosas de un adenocarcinoma ductal pancreático en un gabinete de bioseguridad estéril demuéstramos el procedimiento.

Use un bisturí estéril y fórceps para picar el tumor humano en una placa de cultivo de 60 por 15 milímetros que contenga un mililitro de PBS estéril, agregando otros tres a cuatro mililitros de PBS según sea necesario hasta que el tejido esté completamente disociado. Transfiera la suspensión de tejido a un tubo cónico estéril y agregue PBS hasta un volumen final de cinco mililitros. A continuación, homogeneizar mecánicamente la muestra con una centrífuga de disociación y digerir el tejido homogeneizado con colagenasa a 37 grados centígrados.

Después de una hora de centrifugado, las células resus, suspendiendo el pellet en 10 mililitros de medio completo. Filtre la suspensión celular a través de un colador de 40 micrómetros y vuelva a centrifugar las celdas. Esta vez, resus suspendiendo el pellet en cinco mililitros de un CK Después de cinco minutos a temperatura ambiente, retire el tampón de lisis de glóbulos rojos por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en el medio de células madre cancerosas.

A continuación, incubar las células en un plato recubierto de gelatina a 37 grados centígrados para eliminar la mayoría de las células fibroblásticas que se adhieren rápidamente. Después de una hora, recupere el sobrenadante y cuantifique el número de células de cáncer de páncreas viables para facilitar la formación de la esfera tumoral para el cáncer. El enriquecimiento de células madre diluye las células en el volumen apropiado de medio de células madre cancerosas hasta una concentración final de dos veces 10 a las tres células por mililitro, y las enfría en hielo durante unos minutos.

Luego, después de agregar 500 microlitros de PBS a la primera y última fila de una placa de celdas de 24 celdas de fijación ultra baja, vuelva a suspender las celdas con una pipeta y siembre un mililitro de celdas por pocillo en los pocillos vacíos de la placa. Trate cuatro pocillos de células con el fármaco de interés y al menos cuatro pocillos de control negativo con vehículo. A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante una semana.

Cada dos días, añadimos tratamiento fresco a nuestro vehículo en cada uno de los pozos. En el quinto o séptimo día, evalúe el número de esferas tumorales formadas con un contador de células automatizado que permite la identificación de estructuras más grandes para el empaquetamiento en serie de las esferas tumorales. En el séptimo día, use un colador de celdas de 40 micrómetros para cosechar las esferas.

A continuación, gire las esferas e incube en un mililitro de tripsina durante 20 minutos a 37 grados centígrados para disociar el pellet en una suspensión de una sola célula. A continuación, expanda las células durante otros siete días, como se acaba de demostrar, para preparar las esferas para la medición de sus especies reactivas de oxígeno o la producción de ROS después de la disociación, como se acaba de demostrar, gire las esferas y vuelva a suspender el pellet en HBSS que contiene la sonda adecuada. Después de una incubación de 20 minutos en la oscuridad a 37 grados centígrados, coloque las células en hielo hasta el análisis por citometría de flujo para preparar las esferas para la medición de su consumo de oxígeno.

Primero cubra una placa de cultivo celular de 96 pocillos con adhesivo para células y tejidos durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, disocie las esferas y la tripsina como se ha demostrado. A continuación, lavar la placa dos o tres veces con agua para eliminar el exceso de placa adhesiva, las celdas singulares a tres veces 10 a la quinta celdas por pocillo.

En 150 microlitros de medio de ensayo de consumo de oxígeno que contiene glucosa y piruvato de sodio, las células se adhieren al fondo de los pocillos por centrifugación hasta alcanzar 100 veces G. Dejar que la centrífuga se detenga con la ruptura. Luego invierta la orientación del plato y repita el giro.

Ahora incuba las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono. Mientras tanto, cargue las importaciones de cartuchos de ensayo. A, B y C. Inyectar 25 microlitros de una concentración de tres, seis y nueve milimolares del fármaco de interés, respectivamente, e importar D a 25 microlitros de una concentración de un micromolar del inhibidor mitocondrial rone.

Cuando las células estén listas, calibre el cartucho y cargue la placa de cultivo celular. Finalmente, ejecute el ensayo con el protocolo estándar de mezcla y medición En estos experimentos representativos, el tratamiento de las células madre del cáncer de páncreas con metformina disminuyó fuertemente el tamaño y el número de las esferas tumorales. Además, estas reducciones fueron exhibidas por las culturas de la esfera secundaria y terciaria.

Incluso cuando solo el cultivo de la esfera primaria había sido tratado con metformina, la metformina actúa como un inhibidor mitocondrial. De hecho, en este experimento, se observó que el fármaco induce una disminución rápida y dependiente de la dosis en el consumo de oxígeno en las células tumorales que se correlaciona con su capacidad para inducir la producción de ROS. Es importante destacar que los ratones tratados con metformina muestran una reducción a corto plazo pero significativa en la progresión del adenocarcinoma de páncreas en comparación con los animales de control.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo disociar tumores humanos frescos. Aísle las células cancerosas primarias, pregúntelas como cultivo de formación de esferas y evalúe la actividad metabólica de las células madre del cáncer de páncreas.