Name: La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a encapsular células termogénicas catabólicas con alginato y poli-L-lisina para estudios de obesidad. Este método permite evaluar la disipación de energía in vitro e in vivo en ratones.

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Nos gustaría dar las gracias a Jennifer Petrosino y David DiSilvestro ayuda editorial. Esta investigación fue apoyada por el premio número 20020728 de la American Egg Board y el Premio número 10040042 de Novo Nordisk Farmacia, así como por el Centro de Innovación de Alimentos, Oficina de Asuntos Internacionales, Centro de Investigación Avanzada Alimentos Funcionales y Emprendimiento en OSU, así como la National Science Foundation concede CEE-0914790 (LJL). El proyecto descrito fue apoyada por el premio número R21OD017244 (OZ) y UL1RR025755 (OSUCCC) desde el Centro Nacional de Recursos para la Investigación, financiado por la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud (OD) y apoyado por el NIH Roadmap para la Investigación Médica y NCI P30CA16058. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial del Centro Nacional de Recursos para investigación o de los Institutos Nacionales de Salud.

El protocolo de estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad del Estado de Ohio. Los experimentos con animales fueron aprobados por protocolo de IACUC. Todos los procedimientos se realizaron bajo el gabinete de bioseguridad de nivel 2 con flujo laminar. Hemos seguido todos los requisitos y procedimientos de seguridad estándar. La técnica de microencapsulación para la preparación de microcápsulas se ha realizado como se ha descrito 17, 18. 1. Preparación de Materiales <ol><li> Preparar 10 ml de solución de alginato de sodio al 2% en solución salina fisiológica en autoclave (0,9% de NaCl en agua). Preparar la solución de PLL 0,05% en solución salina fisiológica. Prepare estas soluciones el día anterior y agitar durante la noche. Filtrar las soluciones con 0,22 micras filtro antes de su uso. </li><li> Preparar citrato de sodio 50 mM y 100 mM CaCl 2 0,9% en soluciones de NaCl y autoclave ellos. </li><li> Autoclave todas las soluciones, agujas, electrodos, y vasos. A fondo agujas limpias con alambres para evitar la obstrucción. </li><li> Determinar la cantidad apropiada de las células a utilizar para las cápsulas (se necesitan 102 microcápsulas por cada cm 2 de bien y hay aproximadamente 500 células por cápsula 18). Usar 1 ml de alginato de sodio por dos millones de células. </li><li> Preparar un &#39;Medio de Crecimiento de Fibroblastos&#39; que contenía suero de ternero al 10%, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en una alta concentración de glucosa (4500 mg / l de glucosa) medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). <ol><li> Preparar un &#39;Diferenciación Medium I&#39; que contiene 10% de suero bovino fetal, 10 mg / ml de insulina, dexametasona 1 mM, 0,5 mM xantina 3-isobutil-1-metilo, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en DMEM. </li><li> Preparar un suero &#39;Diferenciación Medium II&#39; que contiene 10% de bovino fetal, 10 mg / ml de insulina, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en DMEM. </li></ol></li><li> Preparar tampón de lisis que contiene una proteasa tableta inhibidor por Radio-inmunoprecipitación tampón 10 ml Ensayo (RITampón PA). </li></ol> 2. Preparación microperlas de alginato (Figura 1A) <ol><li> Retire medio edad, de frasco de cultivo celular. Enjuagar las células con 10 ml de PBS. Llevar las células en suspensión con 0,25% de tripsina-EDTA (2 ml por matraz T175 confluente). </li><li> Contar las células en suspensión de células utilizando un hemocitómetro. Usar 10 ml de alícuota de la suspensión celular y contar las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Centrifugar las células restantes en medio de centrifugación a 480 xg a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Suspender el sedimento de células en alginato de sodio como se describe en el paso 1.4. Transferir la solución de sodio-célula alginato a una jeringa de 5 ml. </li><li> Eliminar las burbujas de aire en la solución, agregue una aguja de calibre 23 e invierta la jeringa para crear un bolsillo 1 ml de aire. </li><li> Coloque un pequeño vaso (180 ml) que contiene 144 ml de 100 mM de solución de CaCl2 debajo de la salida de la aguja del encapsulador. Conecte el electrodo al encapsulador con el aproxim puntaadam ente 2,5 cm por encima de la superficie de la solución 100 mM CaCl 2. </li><li> Coloque firmemente la jeringa que contiene la solución de células de alginato de sodio en la bomba de jeringa. Conecte el tubo de goma a la apertura de la jeringa. Empuje el émbolo hasta que la solución de células alginato de sodio entra a mitad de camino a través del tubo. Ajuste la tensión de 5,4 kV. Ajuste el diámetro de 12,06 mm en la bomba de jeringa. Ajustar la velocidad a 3 ml / hr. Encienda la bomba. Encienda el encapsulador y mantener la tensión en 5,4 kV. </li><li> Cierre la ventana de la campana y evitar cualquier vibración innecesaria hasta el final de la formación de las microesferas de alginato. Después de toda la solución pasa a través de la aguja, solidificar las microperlas en forma de bola de alginato en la solución 100 mM CaCl 2 para 20 min adicionales antes de recubrir con PLL. </li></ol> 3. microperlas recubrimiento con PLL (Figura 1B) <ol><li> Retire el vaso que contiene las microperlas en forma de bola de células de alginato de sodio y transferir estos microbEADS en un tubo de centrifugación de 50 ml. Retire solución de CaCl2 a partir del sedimento de microperlas. </li><li> Lavar las microperlas en forma de bola de células de alginato mediante la adición de 30 ml de NaCl al 0,9%. Agitar el tubo con la mano suavemente. Retirar 0,9% NaCl con 25 ml pipeta después de las microperlas han precipitado por gravitación. Repetir dos veces más para un total de 3 lavados. </li><li> Usar 10 ml de solución de PLL 0,05% por cada 1 ml de solución de alginato de sodio. Añadir el PLL 0,05% y el vórtice en 1000 revoluciones por min durante 10 min. Nota: Por lo general, 10 minutos es suficiente para el recubrimiento de PLL. </li><li> Después se forma la capa PLL, retire la solución de PLL y lavar las cápsulas 3 veces como se describe en 3.2. </li></ol> 4. La eliminación de alginato Core (Figura 1C) <ol><li> Añadir 30 ml de solución de citrato de sodio 50 mM. Espere 5 minutos o hasta que se disuelva todo el alginato de sodio. Lavar cápsulas tres veces como se describe en el paso 3.1.1. </li><li> Retire el NaCl 0,9%, añadir 20 ml de medio de cultivo al tubo de 50 mly transferir todas las cápsulas que contienen las células a un matraz de cultivo celular. Maneje células encapsuladas en condiciones estándar de cultivo celular 18. </li></ol> 5. En Aplicaciones Vitro para Estudiar xenoinjerto y Host Cell Interacciones o Cinética de metabolitos Afluencia / Eflujo entre células (Figura 2) <ol><li> Células huésped Cultura el 24 de placa de hasta confluencia de co-cultivos. Utilice el &#39;medio de crecimiento de fibroblastos&#39; para preadipocitos de cultivo. </li><li> Microcápsulas de transferencia en 24 placa que contiene células huésped confluente así. Añadir microcápsulas para lograr una monocapa (102 microcápsulas / cm 2 de bien). </li><li> Inducir la diferenciación de pre-adipocitos con Diferenciación Medio I. Cada 48 horas, los medios de comunicación de cambio de Diferenciación Medio II durante seis días. Lisar las células en tampón RIPA. Utilice 50 g de proteína por condición para analizar la expresión de proteína mediante Western blot. </li></ol> 6. En la solicitud de Vivo para Tratamento de la Obesidad (Figura 3) <ol><li> Mezclar 4% de isoflurano con el oxígeno para la inducción de la anestesia y 2% de isoflurano con el oxígeno para el mantenimiento de la anestesia. Confirme la profundidad anestésica adecuada por pizca dedo del pie. <ol><li> Aplique un ungüento contra la picazón en los ojos para proteger las córneas se sequen. </li></ol></li><li> Utilice células encapsuladas que están etiquetados de forma permanente con la proteína de fluorescencia artificial, tales como la proteína de fluorescencia verde (GFP). </li><li> Utilice una jeringa de 3 ml y una aguja de calibre 20 para inyectar células encapsuladas. <ol><li> Inyectan 0,5 x 10 6 células suspendidas en 0,2 ml de PBS en cada depósito de grasa IAB que se encuentra en la zona intraperitoneal entre una gónada y el riñón como se muestra en la Figura 3. Utilice este volumen de PBS y el número de células para los ratones con un peso medio de 40 g. Ajustar el número de células y el volumen en ratones que tienen diferente peso o para la determinación de los efectos dependientes de la dosis. </li></ol></li></ol>

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No se declaran conflictos de intereses.

Varios métodos han sido utilizados para encapsular células, incluyendo secado, extrusión, y la emulsión 19. En este método, las perlas de alginato se extruyen a través de una aguja, a continuación, recubierto con PLL y el núcleo de alginato se disuelve para completar la encapsulación. Aunque este método se ha utilizado durante años, la formación de las perlas con el tamaño deseado y la forma esférica es todavía difícil. El tamaño de las cápsulas es altamente dependiente de la viscosidad de la solución de algi...

El aumento de incidencia de enfermedades crónicas 1 ha estimulado estudios sobre el trasplante de las poblaciones de células terapéuticas 2. Células madre singénicos o alogénicos son los tipos de células más comúnmente usados ​​para estas aplicaciones 2. Sin embargo, estos tratamientos no permiten el control de la diferenciación y la migración de las células madre después de la implantación y no son rentables. El trasplante de células modificadas genéticamente con funciones beneficiosas prevé mejorar el tratamiento de muchas enfermedades. Sin embargo, las modificaciones genéticas de células son reconocidos por el sistema inmune del huésped, por lo tanto, estos tratamientos requieren inmunosupresión 3. La encapsulación de células productoras de insulina ha sido desarrollado por el Dr. Chang 4. La técnica se basa en la encapsulación de células en gotas de alginato que se sumergen en una solución de cloruro de calcio. Moléculas de alginato consisten en ácido manurónico (M) y gulurónico (G) y se pueden conectar por Ca 2+. Después de la gelificación, las perlas se suspendieron una solución de poli-L-lisina (PLL). Durante este paso, PLL se une a G y M en las moléculas de alginato que establece la membrana de la cápsula. La porosidad de la membrana de la cápsula puede ser modulada mediante la variación de las concentraciones M y PLL, el tiempo de incubación y la temperatura. La unión de PLL también depende del tipo y la concentración de alginato. Matrices de alginato reticulado con iones de Ca2 +, son inestables en el medio ambiente fisiológico o en soluciones tampón comunes con alta concentración de fosfato y iones citrato. Estos tampones pueden extraer Ca 2+ desde el alginato y licuar el núcleo. La licuefacción del núcleo de alginato proporciona espacio interior de las cápsulas para el movimiento celular y el crecimiento. Células encapsuladas en alginato polianiónico con policatiónico poli-L-lisina (APL) son impermeables para inmunoglobulinas, pero tienen afluencia de nutrientes y de flujo de salida de toxinas. ¡Estas propiedades permiten APL largo plazo Dorvival de células encapsuladas después del trasplante en genéticamente diferentes hosts. Elliott et al. Informó la supervivencia de funcionamiento de las células pancreáticas porcinas encapsuladas en un paciente humano nueve años después de la implantación 5. Las técnicas de encapsulación se pueden clasificar en microencapsulación (3-800 micras) y macroencapsulación (mayor que 1000 micras). Las microcápsulas son más duraderas que macrocápsulas 6. Desde su descubrimiento por el Dr. Chang y sus colegas en 1964, microencapsulación ha sido ampliamente utilizado para la encapsulación de las células productoras de insulina anabólicos, otras hormonas, y moléculas bioactivas 7. Estos tratamientos enfrentan varios desafíos en el tejido huésped incluyendo la fibrosis y la respuesta inmune 8. Inicialmente, se han resuelto los efectos secundarios relacionados con la calidad de los biopolímeros. Sin embargo, el trasplante de células anabólicos todavía inicia efectos secundarios, tales como la fibrosis, como resultado de la hormona overproducción fuera de una glándula especializada. En las últimas décadas, la obesidad y la diabetes tipo 2 ha alcanzado proporciones epidémicas 9. Más del 30% de las personas adultas en todo el mundo tienen sobrepeso y obesidad 10. Aumento (IAB) la formación de grasa intra-abdominal aumenta la incidencia de la inflamación crónica y promueve la diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, ciertos tipos de cáncer y otras morbilidades 11-13. Varias líneas de evidencia sugieren que la patogénesis asociada con la grasa IAB puede ser evitado por los adipocitos específicos. Estudios recientes han demostrado que el trasplante de adipocitos subcutáneos en la región IAB puede mejorar el metabolismo y disminuir la obesidad y la resistencia a la insulina en roedores in vivo 14. Reducción efectiva de la obesidad y la resistencia a la insulina se ha asociado con adipocitos termogénicos capaz de disipar energía en forma de calor 15,16. Modificación termogénico de los adipocitos se puede lograr mediante la transfección establede genes que participan en el desacoplamiento de protones mitocondrial, tales como proteína de desacoplamiento 1 (UCP1) o de genes que regulan la expresión de UCP1 y otros genes termogénicos 15,16. Nuestros estudios recientes mostraron que la deficiencia en aldehído deshidrogenasa 1 a1 (ALDH1A1) conduce a la remodelación termogénico de grasa IAB que reduce la obesidad y la resistencia a la insulina en estos ratones 17,18. Notablemente, la encapsulación de termogénico ALDH1A1 deficiente (ALDH1A1 - / -) preadipocitos media mismo efecto terapéutico en grasa IAB en ratones de tipo salvaje obesos, lo que sugiere nuevas oportunidades terapéuticas para el tratamiento de la grasa IAB 18. En los entornos experimentales, las células encapsuladas permiten a los investigadores estudiar los efectos de las poblaciones de células específicas en una manera rentable 19. Aquí hablamos del método de encapsulación de una línea celular catabólico termogénico y su laboratorio y su aplicación terapéutica en un modelo de ratón de la obesidad. El protocolo describe tres fases para la producción de microcápsulas (Figura 1): la formación de las microesferas de alginato (Figura 1A), la formación de la policatiónico poli-L-lisina (PLL) membranas sobre la superficie de microperlas (Figura 1B), y la eliminación de la núcleos de alginato (Figura 1C).

<table><tbody><tr><td>Dispositivo de encapsulación (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>Ninguno Bomba</td></tr><tr><td>de jeringa científica KD</td><td>KD scientific</td><td>780100Y</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus&nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Alginato de sodio</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Citrato de sodio tribásico dihidratado</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario ATGL (de conejo)</td><td>Señalización celular</td><td>2138S</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario (anti conejo)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solución salina (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Cortizone 10 ungüento anti-picor</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Suero para terneros recién nacidos (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>Ninguno Suero</td></tr><tr><td>fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Insulina (bovina)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Ninguna</td></tr></tbody></table>

la encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Encapsulación de células fue desarrollado para atrapar células viables dentro de las membranas semi-permeables. Las células encapsuladas injertadas pueden intercambiar metabolitos de bajo peso molecular en los tejidos del huésped tratado para lograr la supervivencia a largo plazo. La membrana semipermeable permite injertado células encapsuladas para evitar el rechazo por el sistema inmune. El procedimiento de encapsulación fue diseñado para permitir una liberación controlada de compuestos bioactivos, tales como la insulina, otras hormonas y citoquinas. Aquí se describe un método para la encapsulación de células catabólicas, que consumen lípidos para la producción de calor y disipación de energía (termogénesis) en el tejido adiposo intra-abdominal de los ratones obesos. La encapsulación de células catabólicos termogénicos puede ser potencialmente aplicable a la prevención y el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. Otra aplicación potencial de las células catabólicos puede incluir la desintoxicación de alcoholes u otros metabolitos tóxicos y contaminantes ambientales.

La Figura 1 muestra que cada paso de la producción de microperlas podría ser controlada bajo el microscopio. La Figura 2A muestra cómo co-cultivo adipocitos con una monocapa de células encapsuladas. La Figura 2B es un ejemplo representativo de un estudio cuantitativo usando adipocitos / microcápsulas co-cultivos que se describe en el capítulo 5. Los lisados ​​de adipocitos se analizaron mediante Western blot. Células encapsuladas no fueron analizados en este experimento...

Aquí, presentamos un protocolo para la encapsulación de células catabólicas, que consumen lípidos para la producción de calor en el tejido adiposo intraabdominal y aumentan la disipación de energía en ratones obesos.

La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la encapsulación de una línea celular catabólica termogénica y sus aplicaciones in vitro y potencialmente in vivo. Para comenzar este procedimiento, prepare una suspensión celular de alginato de sodio y transfiérala a una jeringa de cinco mililitros. El siguiente paso consiste en utilizar un dispositivo de encapsulación para producir microgránulos de alginato.Las microperlas se recubren entonces con una solución poliiónica de poli-L-lisina, y posteriormente se elimina el núcleo de alginato para formar una membrana semipermeable alrededor de una suspensión celular. El paso final consiste en realizar un cultivo conjunto de las células encapsuladas con otras líneas celulares o inyectarlas en los tejidos adiposos de ratones. En última instancia, el análisis inmunológico de la sangre muestra una mayor actividad lipolítica en adipocitos cultivados conjuntamente con microcápsulas que contienen adipocitos deficientes en aldehído deshidrogenasa.Aunque la inmunohistoquímica muestra el trasplante exitoso de células encapsuladas en los tejidos grasos de ratones, este método puede proporcionar información sobre la termogénesis y el tejido apus. También puede aplicarse a otros modelos animales existentes para ofrecer un sistema experimental de bajo costo para probar subconjuntos celulares in vivo. Para los descubrimientos biomédicos, todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica de nivel dos con flujo laminar.Para comenzar, retire el medio antiguo del frasco de cultivo celular y enjuague los preadipocitos con 10 mililitros de PBS. Elimine el PBS y resuspenda las células en dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 %. Tome una alícuota de 10 microlitros de la suspensión celular y cuente las células utilizando un hemocitómetro.De acuerdo con las instrucciones del fabricante, agregue DMEM a las células restantes para obtener la cantidad ideal de células y centrifugue a 480 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de determinar la cantidad de células necesarias siguiendo las indicaciones en el texto del protocolo, suspendemos el sedimento celular en un volumen adecuado de una solución al 2% de alginato de sodio. Transfiera la solución de células en alginato de sodio a una jeringa de cinco mililitros.Retire cualquier burbuja de aire en la solución e invierta la jeringa para crear un bolsillo de aire de un mililitro. Para prepararse para la encapsulación, coloque un vaso de precipitados pequeño que contenga 144 mililitros de una solución de cloruro de calcio de 100 milimolares. Bajo la boquilla de la aguja del dispositivo de encapsulación, sujete el electrodo al encapsulado con la punta aproximadamente a 2,5 centímetros por encima de la superficie de la solución de cloruro de calcio.Coloque la jeringa que contiene la solución de células en alginato de sodio firmemente en la bomba de jeringa. Conecte el tubo de goma a la abertura de la jeringa. Presione el émbolo hasta que la solución de células en alginato de sodio avance hasta la mitad del tubo.Ajuste el voltaje a 5,4 kilovoltios y establezca el diámetro en 12,06 milímetros en la bomba de jeringa. Ajuste la velocidad a tres mililitros por hora. Inicie la bomba, encienda el encapsulador y mantenga el voltaje en 5,4 kilovoltios.Cierre la ventana de la campana y evite cualquier vibración innecesaria hasta que se complete la formación de los microgránulos de alginato. Después de que toda la solución haya pasado a través de la aguja, solidifique los microgránulos esféricos de alginato en la solución de cloruro de calcio durante 20 minutos adicionales antes de recubrirlos con polilisina policatiónica o PLL. Una vez que los microgránulos esféricos de alginato sódico hayan solidificado, retire el vaso de precipitados que contiene los microgránulos del dispositivo de encapsulación.Transfiera las microperlas a un tubo de centrifugación de 50 mililitros. Retire la solución de cloruro de calcio del pellet de microperlas. Lave las microperlas añadiendo 30 mililitros de una solución de cloruro de sodio al 0,9 % y agitando suavemente el tubo a mano.Deje que las microperlas precipiten por gravedad. Luego, use una pipeta de 25 mililitros para eliminar la solución de cloruro de sodio de esta manera. Lave las microperlas un total de tres veces.A continuación, agregue la solución de PLL al 0,05 % a las microesferas. Utilice 10 mililitros de solución de PLL por cada mililitro de solución de alginato de sodio. Vortexee a 1000 rotaciones por minuto durante 10 minutos, lo cual generalmente es suficiente para el recubrimiento con PLL.Tras confirmar la formación del recubrimiento de PLL, retire la solución de PLL y lave las cápsulas tres veces con una solución de cloruro de sodio al 0,9%, como se mostró anteriormente, para eliminar primero el núcleo alternativo de las microesferas recubiertas con PLL. Añada 30 mililitros de una solución de citrato de sodio 50 milimolar al tubo de 50 mililitros. Espere cinco minutos o hasta que todo el alginato de sodio se haya disuelto. Lave las cápsulas tres veces con solución de cloruro de sodio al 0,9% como se indicó previamente.Después de la tercera lavada, transfiera a un frasco de cultivo celular todos los cápsulas que contienen las células, utilizando 20 mililitros de medio de cultivo por transferencia, y maneje las células encapsuladas bajo condiciones estándar de cultivo celular. Las células huésped para este procedimiento deben cultivarse en placas de 24 pocillos hasta alcanzar confluencia. Utilice medio de crecimiento para fibroblastos preparado según se describe en el protocolo adjunto.Texto para el cultivo de preadipocitos. Transfiera las microcápsulas a la placa de 24 pocillos que contiene células huésped confluentes; agregue microcápsulas para lograr una monocapa en cada pocillo e induzca la diferenciación de preadipocitos con el medio de diferenciación uno. Incube durante 48 horas.Después de 48 horas, cambie el medio a diferenciación.Medio.Dos, y reemplace el medio con diferenciación.Medio.Dos fresco cada 48 horas. Las proteínas de las células se analizarán mediante blot de Western.Cada paso de la producción de microesferas puede observarse bajo el microscopio. Se muestra una microesfera de alginato a un aumento de 20x. Antes del recubrimiento con PLL, tras la codificación con PLL y después de disolver el núcleo de gelatina, en un estudio cuantitativo se comparó la expresión de la lipasa de triglicéridos del tejido adiposo o A TGL entre tres adipocitos T tres L uno cultivados en cocultivo con microcápsulas acelulares de tipo silvestre o deficientes en aldehído deshidrogenasa uno A uno.La mayor expresión de una TGL en adipocitos cultivados en cocultivo con un L DH uno A uno deficiente en dipcitos que contienen microcápsulas indica una mayor actividad lipolítica. En un estudio in vivo, se inyectaron células encapsuladas marcadas con GFP en el depósito de grasa intraabdominal de ratones. 80 días después, el tejido adiposo inyectado mostró agrupaciones descoloridas de células encapsuladas.Una sección incluida en parafina del depósito de grasa intraabdominal teñida con hematoxilina, eosina y eosina muestra grupos de microcápsulas implantadas que contienen células encapsuladas y adipocitos del hospedador. La misma sección analizada bajo luz fluorescente muestra células trasplantadas marcadas con GFP en el interior de cápsulas redondas e intactas. La expresión de GFP también es un indicador de viabilidad celular tras su desarrollo.Esta técnica de encapsulación abrió camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades metabólicas exploraran posibles tratamientos para la obesidad, la resistencia a la insulina en la diabetes tipo dos, la inflamación, el cáncer y organismos modelo.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.

Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Este método de trasplante de islotes cubiertos de grasa es adecuado para la detección de islotes injertados en la cavidad intraperitoneal. En particular, no requiere el uso de agentes bioaglutinantes o suturas.

Trasplante de islotes cubiertos de grasa utilizando tejido adiposo blanco epididimario

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Aquí, describimos un protocolo para aislar, cultivar y fenotipar células endoteliales microvasculares a partir de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVECs). Además, describimos un modelo experimental de diafonía entre hSATMVEC y adipocitos.

Estudio de la diafonía entre células endoteliales adiposas y adipocitos en el tejido adiposo subcutáneo humano

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Aprende a encapsular células termogénicas catabólicas con alginato y poli-L-lisina para estudios de obesidad. Este método permite evaluar la disipación de energía in vitro e in vivo en ratones.

La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

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