La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la encapsulación de una línea celular catabólica termogénica y sus aplicaciones in vitro y potencialmente in vivo. Para comenzar este procedimiento, prepare una suspensión celular de alginato de sodio y transfiérala a una jeringa de cinco mililitros. El siguiente paso consiste en utilizar un dispositivo de encapsulación para producir microgránulos de alginato.

Las microperlas se recubren entonces con una solución poliiónica de poli-L-lisina, y posteriormente se elimina el núcleo de alginato para formar una membrana semipermeable alrededor de una suspensión celular. El paso final consiste en realizar un cultivo conjunto de las células encapsuladas con otras líneas celulares o inyectarlas en los tejidos adiposos de ratones. En última instancia, el análisis inmunológico de la sangre muestra una mayor actividad lipolítica en adipocitos cultivados conjuntamente con microcápsulas que contienen adipocitos deficientes en aldehído deshidrogenasa.

Aunque la inmunohistoquímica muestra el trasplante exitoso de células encapsuladas en los tejidos grasos de ratones, este método puede proporcionar información sobre la termogénesis y el tejido apus. También puede aplicarse a otros modelos animales existentes para ofrecer un sistema experimental de bajo costo para probar subconjuntos celulares in vivo. Para los descubrimientos biomédicos, todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica de nivel dos con flujo laminar.

Para comenzar, retire el medio antiguo del frasco de cultivo celular y enjuague los preadipocitos con 10 mililitros de PBS. Elimine el PBS y resuspenda las células en dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 %. Tome una alícuota de 10 microlitros de la suspensión celular y cuente las células utilizando un hemocitómetro.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, agregue DMEM a las células restantes para obtener la cantidad ideal de células y centrifugue a 480 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de determinar la cantidad de células necesarias siguiendo las indicaciones en el texto del protocolo, suspendemos el sedimento celular en un volumen adecuado de una solución al 2% de alginato de sodio. Transfiera la solución de células en alginato de sodio a una jeringa de cinco mililitros.

Retire cualquier burbuja de aire en la solución e invierta la jeringa para crear un bolsillo de aire de un mililitro. Para prepararse para la encapsulación, coloque un vaso de precipitados pequeño que contenga 144 mililitros de una solución de cloruro de calcio de 100 milimolares. Bajo la boquilla de la aguja del dispositivo de encapsulación, sujete el electrodo al encapsulado con la punta aproximadamente a 2,5 centímetros por encima de la superficie de la solución de cloruro de calcio.

Coloque la jeringa que contiene la solución de células en alginato de sodio firmemente en la bomba de jeringa. Conecte el tubo de goma a la abertura de la jeringa. Presione el émbolo hasta que la solución de células en alginato de sodio avance hasta la mitad del tubo.

Ajuste el voltaje a 5,4 kilovoltios y establezca el diámetro en 12,06 milímetros en la bomba de jeringa. Ajuste la velocidad a tres mililitros por hora. Inicie la bomba, encienda el encapsulador y mantenga el voltaje en 5,4 kilovoltios.

Cierre la ventana de la campana y evite cualquier vibración innecesaria hasta que se complete la formación de los microgránulos de alginato. Después de que toda la solución haya pasado a través de la aguja, solidifique los microgránulos esféricos de alginato en la solución de cloruro de calcio durante 20 minutos adicionales antes de recubrirlos con polilisina policatiónica o PLL. Una vez que los microgránulos esféricos de alginato sódico hayan solidificado, retire el vaso de precipitados que contiene los microgránulos del dispositivo de encapsulación.

Transfiera las microperlas a un tubo de centrifugación de 50 mililitros. Retire la solución de cloruro de calcio del pellet de microperlas. Lave las microperlas añadiendo 30 mililitros de una solución de cloruro de sodio al 0,9 % y agitando suavemente el tubo a mano.

Deje que las microperlas precipiten por gravedad. Luego, use una pipeta de 25 mililitros para eliminar la solución de cloruro de sodio de esta manera. Lave las microperlas un total de tres veces.

A continuación, agregue la solución de PLL al 0,05 % a las microesferas. Utilice 10 mililitros de solución de PLL por cada mililitro de solución de alginato de sodio. Vortexee a 1000 rotaciones por minuto durante 10 minutos, lo cual generalmente es suficiente para el recubrimiento con PLL.

Tras confirmar la formación del recubrimiento de PLL, retire la solución de PLL y lave las cápsulas tres veces con una solución de cloruro de sodio al 0,9%, como se mostró anteriormente, para eliminar primero el núcleo alternativo de las microesferas recubiertas con PLL. Añada 30 mililitros de una solución de citrato de sodio 50 milimolar al tubo de 50 mililitros. Espere cinco minutos o hasta que todo el alginato de sodio se haya disuelto. Lave las cápsulas tres veces con solución de cloruro de sodio al 0,9% como se indicó previamente.

Después de la tercera lavada, transfiera a un frasco de cultivo celular todos los cápsulas que contienen las células, utilizando 20 mililitros de medio de cultivo por transferencia, y maneje las células encapsuladas bajo condiciones estándar de cultivo celular. Las células huésped para este procedimiento deben cultivarse en placas de 24 pocillos hasta alcanzar confluencia. Utilice medio de crecimiento para fibroblastos preparado según se describe en el protocolo adjunto.

Texto para el cultivo de preadipocitos. Transfiera las microcápsulas a la placa de 24 pocillos que contiene células huésped confluentes; agregue microcápsulas para lograr una monocapa en cada pocillo e induzca la diferenciación de preadipocitos con el medio de diferenciación uno. Incube durante 48 horas.

Después de 48 horas, cambie el medio a diferenciación.Medio.Dos, y reemplace el medio con diferenciación.Medio.Dos fresco cada 48 horas. Las proteínas de las células se analizarán mediante blot de Western.

Cada paso de la producción de microesferas puede observarse bajo el microscopio. Se muestra una microesfera de alginato a un aumento de 20x. Antes del recubrimiento con PLL, tras la codificación con PLL y después de disolver el núcleo de gelatina, en un estudio cuantitativo se comparó la expresión de la lipasa de triglicéridos del tejido adiposo o A TGL entre tres adipocitos T tres L uno cultivados en cocultivo con microcápsulas acelulares de tipo silvestre o deficientes en aldehído deshidrogenasa uno A uno.

La mayor expresión de una TGL en adipocitos cultivados en cocultivo con un L DH uno A uno deficiente en dipcitos que contienen microcápsulas indica una mayor actividad lipolítica. En un estudio in vivo, se inyectaron células encapsuladas marcadas con GFP en el depósito de grasa intraabdominal de ratones. 80 días después, el tejido adiposo inyectado mostró agrupaciones descoloridas de células encapsuladas.

Una sección incluida en parafina del depósito de grasa intraabdominal teñida con hematoxilina, eosina y eosina muestra grupos de microcápsulas implantadas que contienen células encapsuladas y adipocitos del hospedador. La misma sección analizada bajo luz fluorescente muestra células trasplantadas marcadas con GFP en el interior de cápsulas redondas e intactas. La expresión de GFP también es un indicador de viabilidad celular tras su desarrollo.

Esta técnica de encapsulación abrió camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades metabólicas exploraran posibles tratamientos para la obesidad, la resistencia a la insulina en la diabetes tipo dos, la inflamación, el cáncer y organismos modelo.