Spécialement conçu à base de laser appareils de chauffage à libération déclenchée de cisplatine de thermosensible liposomes avec guidage par l'image par résonance magnétique

L'objectif général de cette procédure est de démontrer le fonctionnement d'un appareil de chauffage personnalisé, basé sur un laser, pouvant être utilisé pour chauffer localement des tumeurs sous-cutanées afin d'administrer une formulation de liposomes activés par la chaleur. Cela est réalisé en préparant d'abord la formulation HTLC par formation d'un film lipidique, hydratation par extrusion et dialyse. Dans une deuxième étape, une souris donneur est inoculée avec des cellules de carcinome du col de l'utérus.

Après quatre à cinq semaines, la tumeur est excisée, découpée en fragments et implantée individuellement dans une souris receveuse. Dans la dernière étape, la tumeur de la souris receveuse est chauffée localement à 42 degrés Celsius à l’aide du système de chauffage basé sur un laser. L’appareil de chauffage au laser est compatible IRM, ce qui permet de surveiller les variations de température tissulaire pendant l’administration de la lumière, et est compact et portable, permettant un chauffage simple et efficace de la tumeur à l’intérieur du tunnel de l’IRM pour petits animaux.

En fin de compte, la libération activée par la chaleur du liposome thermo-sensible HTLC peut être surveillée par imagerie par résonance magnétique en temps réel. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation d'un bain-marie ou d'un cathéter chauffant, sont qu'elle permet une méthode conforme d'appliquer la chaleur à la tumeur en un à deux minutes après le début du traitement thermique, et qu'elle autorise un ajustement en temps réel de la puissance du laser, minimisant ainsi les fluctuations de température pendant l'intervention. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons commencé à réaliser des études in vivo avec notre formulation de liposomes thermo-sensibles HTLC.

Nous avons constaté que les méthodes existantes ne permettaient pas de fournir efficacement un chauffage localisé d'une tumeur sous-cutanée. Les procédures de préparation des liposomes seront démontrées par Myung, un étudiant au doctorat de mon laboratoire. Pour préparer les liposomes, commencez par mélanger le mélange lipidique fraîchement préparé avec le mélange médicamenteux lipidique fraîchement préparé, puis hydratez pendant une heure en vortexant toutes les 15 à 20 minutes pendant l'hydratation du mélange lipidique. Assemblez l'extrudeuse de 10 millilitres avec deux empilements de filtres en polycarbonate de 200 nanomètres, reliez le corps thermique de l'extrudeuse à un bain d'eau circulant réglé à 70 degrés Celsius, et connectez l'appareil à une bouteille d'azote comprimé.

Immédiatement après l'hydratation, transférez les lipides dans la chambre de l'extrudeuse et ouvrez le flux d'azote. Ensuite, à une pression de 200 PSI, extrudez les liposomes à travers les membranes, en les récupérant dans un tube conique de 50 millilitres placé dans un bain d'eau à 70 degrés Celsius. Après avoir extrudé les liposomes cinq fois, démontez l'appareil et remontez-le avec deux empilements de filtres en polycarbonate de 100 nanomètres.

Régler la pression à 400 PSI et extruder les liposomes 10 fois comme vient de l'être démontré. Récolter les liposomes à partir de la dernière extrusion dans un tube conique de 15 millilitres permet aux liposomes de refroidir à température ambiante, suivis d'une précipitation du cisplatine insoluble par centrifugation, puis dialyser les liposomes toute la nuit contre une solution saline à 0,9 % dans un tube de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 15 000 dans des conditions stériles. Pour implanter le xénogreffe de tumeur du col de l'utérus, prélever 180 cellules à partir d'une culture ayant atteint 90 % de confluence et dénombrer le nombre de cellules viables de carcinome du col de l'utérus par hémocytomètre.

Le cytomètre permet ensuite de diluer les cellules à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par 100 microlitres. Tous les travaux impliquant des animaux ont été réalisés au centre d'innovation Star ; inoculer des souris skit femelles par injection intramusculaire dans le muscle gastrocnémien du membre postérieur à l’aide de pinces, mesurer la taille tumorale résultante jusqu’à ce que les tumeurs atteignent de neuf à douze millimètres dans leur plus grande dimension. Ensuite, exciser la tumeur de la souris donneuse et la diviser en fragments de deux à trois millimètres cubes.

Épilez maintenant la patte postérieure gauche de l'animal receveur et pratiquez une incision dans la peau nue. Insérez un fragment du tumeur donneur par voie sous-cutanée à travers l'incision et utilisez un à deux agrafes chirurgicales pour fermer la peau trois à cinq jours après l'implantation. Retirez les agrafes et laissez la tumeur croître pendant deux à trois semaines avant de procéder au traitement thermique.

Commencez par connecter une extrémité d'une fibre laser au dispositif laser et l'autre extrémité à l'illuminateur. Ensuite, insérez un cathéter d'injection de calibre 27 dans la veine caudale latérale d'une souris réceptrice anesthésiée, puis insérez un cathéter de calibre 22 au centre de la tumeur. Placez ensuite une sonde optique de température dans le cathéter creux afin de surveiller les variations de température, et recouvrez entièrement la tumeur avec l'illuminateur. Final.

Régler la puissance sur 0,8 à un watt, puis allumer le laser et attendre la montée en température, en ajustant manuellement la puissance du laser tout au long du traitement entre 0,1 et 0,8 watt afin de maintenir la température de la tumeur à 42 degrés Celsius, comme illustré dans cette image d'une coupe transversale d'une tumeur traitée thermiquement. En supposant une puissance totale d'un watt, l'irradiation maximale en tout point de la tumeur est de 70 milliwatts par centimètre carré, l'irradiation dans la tumeur à la profondeur de la peau mesurant 50 % de l'irradiation maximale, comme confirmé par le déplacement de fréquence de résonance protonique en thermométrie par résonance magnétique. L'utilisation du dispositif de chauffage au laser génère une carte de distribution de température relativement uniforme, affichée sur l'image, qui suit l'évolution relative de la température à partir d'une mesure de référence absolue acquise avant le chauffage par la source ponctuelle. La tumeur chauffée présente l'augmentation de signal relative la plus élevée par rapport au muscle tumoral non chauffé après l'administration de gad HTLC, comme déterminé par l'analyse du signal de résonance magnétique, en maintenant ce signal jusqu'à la fin de la période de chauffage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être mise en place en moins de 15 minutes si elle est correctement réalisée, offrant ainsi un outil précieux pour l'évaluation préclinique de formulations de liposomes thermodépendants.

N'oubliez pas que travailler avec un laser de classe quatre peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.