Production microfluidique de liposomes sensibles à la température contenant des lysolipides

Le protocole présente les paramètres optimisés pour la préparation des liposomes thermosensibles à l’aide du dispositif microfluidique micromélangeur d’os de hareng décalé. Cela permet également la co-encapsulation de la doxorubicine et de l’indocyanine vert dans les liposomes et la libération photothermique déclenchée de doxorubicine pour la libération contrôlée / déclenchée de médicaments.

La microfluidique est une technique émergente pour préparer les liposomes d’une taille de nanoparticule tunable et avec une grande reproductibilité et évolutivité. Ce protocole permet la production continue à haute par la production de liposomes sensibles à basse température pour le co-chargement avec un médicament chimiothérapeutique comme la doxorubicine et un colorant fluorescent comme l’indocyanine verte. La préparation cellulaire utilise principalement une approche descendante comme l’hydratation et l’extrusion des films lipidiques.

Il reste difficile de préparer des lots importants et reproductibles pour des applications cliniques. Un avantage majeur de la microfluidique est la capacité de gérer un petit volume liquide avec une contrôlabilité élevée dans l’espace et le temps tout en fonctionnant d’une manière continue et automatisée. Guanglong Ma et Amalia Ruiz, les chercheurs postdoctoraux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Calvin Cheung.

Pour assembler les pompes à seringues, utilisez le câble réseau pompe-pompe pour connecter le port informatique de la pompe à seringues secondaire au port réseau de la pompe à seringues principale. Utilisez le PC pour pomper le câble réseau pour connecter le port informatique de la pompe principale au port en série RS-232 de l’ordinateur. Pour assembler le dispositif microfluidique micromixeur à chevrons, utilisez un écrou et une ferrule pour connecter le tube à chacune des entrées et des sorties de l’appareil.

Ensuite, utilisez un deuxième écrou et ferrule et une assemblée syndicale pour convertir le terminal de la tuyauterie pour les deux entrées en une femelle luer. Pour configurer le logiciel de commande de la pompe, utilisez le bouton d’installation de la pompe à seringues pour attribuer l’adresse de la pompe de seringue principale et de la pompe à seringue secondaire à Ad:01 et Ad:02 respectivement, puis ouvrez le logiciel de commande de la pompe sur l’ordinateur. Les deux pompes à seringues doivent être détectées automatiquement suivies d’un bip sonore.

Sélectionnez HSW Norm-Ject 5cc diamètre équivaut à 12,45 pour assigner le diamètre à 12,45 millimètres. Réglez la vitesse à 0,25 millilitres par minute pour la pompe un et 0,75 millilitres par minute pour la pompe deux. Réglez le volume à n’importe quelle valeur au-dessus de cinq millilitres et sélectionnez le mode infusion pour les deux pompes.

Cliquez ensuite sur définir pour confirmer les paramètres. Pour préparer un mélange lipidique LTSL10 ou LTSL10 ICG, utilisez une seringue de verrouillage luer de cinq millilitres pour retirer un millilitre de mélange lipidique et une autre seringue de verrouillage luer de cinq millilitres pour retirer au moins trois millilitres de solution de sulfate d’ammonium. Faites glisser la bride de canon de la seringue jusqu’au soutènement de seringue de la pompe pour installer les seringues chargées sur les pompes à seringues en position verticale et fixez la bride de piston de la seringue au bloc pousseur de la pompe et enveloppez l’autre extrémité du ruban chauffant et la sonde de température avec le thermostat autour de la seringue contenant la solution lipidique.

Enveloppez l’extrémité du ruban chauffant à la seringue contenant la solution aqueuse, connectez la seringue contenant le mélange lipidique à l’entrée d’éthanol et connectez la seringue contenant la solution de sulfate d’ammonium à l’entrée aqueuse. Ajustez la position du piston pour enlever les bulles d’air des seringues au besoin et branchez et débranchez le ruban chauffant en intervalles de 10 secondes jusqu’à ce que la température des seringues atteigne environ 51 degrés. Lorsque le thermostat affiche une température appropriée, cliquez sur exécutez tout dans le logiciel de commande de la pompe pour faire fonctionner les pompes à seringues et vérifiez que le flux de liquide est exempt de bulles d’air et de toute fuite.

Recueillir les échantillons de liposome dans un flacon et faire une pause ou arrêter l’infusion lorsque l’une ou l’autre seringue est presque vide. Anneal les solutions liposome recueillies dans un bain d’eau de 60 degrés Celsius pendant 1-1/2 heures avant de transférer les solutions aux tubes de dialyse pour la dialyse contre un litre de sulfate d’ammonium millimolaire de 240 millimifères pendant au moins quatre heures à 37 degrés Celsius. Rangez ensuite les liposomes purifiés à quatre degrés Celsius.

Pour le chargement à distance des liposomes par gradient de pH transmembrane, chargez 25 millilitres de HBS sur le dessus d’une colonne de chromatographie d’exclusion de taille et permettez à tous les élitents de circuler à travers la colonne. Chargez un millilitre de liposomes dialysés jusqu’à la colonne. Lorsque toute la solution lipidique est passée à travers la colonne, ajouter 1,5 millilitres de HBS frais à la colonne.

Lorsque tout le tampon est passé à travers la colonne, ajouter trois millilitres de HBS frais à la colonne et de recueillir l’élitiste. Ensuite, ajoutez la solution DOX à un rapport molaire DOX:phospholipide de 1:20 à un millilitre de solution liposome d’échange tampon dans un flacon biju et placez le flacon dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 1-1/2 heures. Après chargement, purifier les liposomes par chromatographie d’exclusion de taille comme vient de le démontrer.

Pour le chauffage au laser induit déclencher la libération du contenu liposome, réglez le bain d’eau à 37 degrés Celsius. Lorsque la température s’est stabilisée, ajouter 200 microlitres de liposomes chargés dox à chaque puits d’une plaque claire de 96 puits et placer la plaque dans le bain d’eau avec le fond immergé dans l’eau. Réglez ensuite le courant du système laser à 2,27 ampères et placez le collimateur du système laser à cinq centimètres verticalement au-dessus de la surface de la plaque de 96 puits.

Allumez le laser et utilisez une sonde de température à fibre optique pour surveiller la température une fois par minute. À cinq et dix minutes, aspirer 10 microlitres de liposomes chargés dox de chaque puits de la plaque claire de 96 puits et ajouter 190 microlitres de HBS à trois puits individuels d’une plaque noire de 96 puits. Pour évaluer la libération complète de médicaments, mélangez 10 microlitres des liposomes avec 170 microlitres de HBS et 20 microlitres de solution de détergent Triton X-100 à 1%, dans trois puits individuels de la plaque noire de 96 puits.

Mesurez ensuite l’intensité de fluorescence dox sur un lecteur de plaque. La production microfluidique de LTSL4 se traduit par une solution visqueuse en forme de gel illustrée par le grand nombre de bulles d’air emprisonnées, tandis que la préparation de LTSL10 entraîne la formation d’un liquide clair non visqueux. La mesure dynamique de diffusion de la lumière de LTSL10 préparée à 51 degrés Celsius démontre le diamètre et la dispersion prévus de la moyenne Z indiquant le succès de l’expérience.

Cependant, lorsque le LTSL10 est préparé à 20 degrés Celsius, des liposomes plus grands et plus dispersés sont obtenus, ce qui donne un produit sous-optimal. Les LTSLs préparés par la méthode conventionnelle d’hydratation de film de lipide avec l’extrusion démontrent une efficacité d’encapsulation de DOX de 50-80%Avec l’annealing, LTSL10 préparé par des microfluidiques a comme conséquence une augmentation significative de l’efficacité d’encapsulation de DOX à une moyenne de 85%indiquant le succès de la charge à distance de DOX et la présence du gradient transmembrane de pH. Le profil de dégagement DOX de LTSL10 a été déterminé comme sensible à la température.

LTSL10 a une transition de phase relativement large avec un début à 41,6 degrés Celsius qui culmine à 42,6 degrés Celsius. L’efficacité de la charge ICG dépend de la concentration initiale de l’ICG et de la taille et de la dispersion des échantillons. En outre, l’irradiation de LTSL10 ICG avec un laser proche infrarouge induit le chauffage photothermal déclenchant la libération de DOX.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’assurer un flux de fluide stable de telle sorte que le mélange du fluide et donc la formation de liposomes restent reproductibles. L’annealing et la dialyse liposome sont deux étapes importantes pour assurer une formulation liposome stable avec la capacité de chargement élevée. Des tests in vivo peuvent également être effectués pour évaluer la biodissurtion LTSL10, la libération de médicaments et l’activité anticancéreuse.

Notre protocole peut être utilisé pour la production microfluidique réussie de liposomes thermosensibles contenant du lysolipide sans cholestérol pour des applications d’administration de médicaments.