Multi-omisión de exón utilizando oligonucleótidos antisentido de cóctel en la distrofia muscular ligada al cromosoma X canina

El objetivo general de este experimento es examinar la eficacia y la toxicidad de la omisión múltiple de exones utilizando oligonucleótidos antisentido o AON en un modelo de perro con distrofia muscular de Duchenne o DMD. Este método puede ayudar a responder a una pregunta clave en la investigación traslacional de la terapia de omisión de exones antisentido, como si los oligonucleótidos antisentido pueden inducir múltiples saltos de exones y destruir la expresión de distrofia en un modelo animal grande. La principal ventaja de utilizar el modelo de perro en un estudio es que los resultados terapéuticos en animales más grandes pueden extrapolarse de forma más fiable a los pacientes con DMD.

Aunque la omisión de exones es una terapia muy prometedora para la DMD, también se puede aplicar a otras enfermedades genéticas, como la distrofia muscular congénita y la distrofia muscular de cinturas. La demostración de los experimentos in vitro será realizada por el Dr. Yoshitsugu Aoki, nuestro jefe de laboratorio, y la demostración de los experimentos in vivo será realizada por el Dr. Mutsuki Kuraoka, becario postdoctoral de mi departamento. Después de diseñar las AON de acuerdo con el protocolo de texto, use placas de 6 pocillos para sembrar de uno a cinco veces 10 al tercio por centímetro cuadrado de mioblastos CXMD en tres mililitros de DMEM con 10% de FBS y 1% de pen-estreptococo.

Incubar las células a 37 grados centígrados hasta que estén entre un 60 y un 80% confluentes. Cuando las células alcancen la confluencia deseada, utilice un medio sérico reducido para diluir un reactivo de transfección de liposomas catiónicos hasta un volumen total de 100 microlitros, y deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos. A continuación, con medio sérico reducido, diluir las AON hasta un volumen final de 100 microlitros.

Combine el reactivo de transfección diluido con las AON diluidas e incube a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Mientras tanto, retire el medio de las células y use medio fresco para lavar las células tres veces. A continuación, agregue 0,8 mililitros de medio a la mezcla de transfección y luego agregue toda la solución a las celdas recién lavadas.

Incubar a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, se añade un medio de diferenciación, o DM, a las células, e incuba durante un máximo de 10 días para que se produzca la diferenciación. A partir del tercer día, comprueba la diferenciación.

Para realizar la transfección de morfolinos de mioblastos de perros, cultive mioblastos CXMD como se demostró anteriormente en este video. Caliente los morfolinos del cóctel a 65 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, añada un reactivo de administración de péptidos y ajuste el morfolino a una concentración final de tres a seis micromolares.

A continuación, use DM para reemplazar el medio en los mioblastos y agregue el morfolino a cada pocillo a una concentración final de un micromolar. Incubar durante 16 a 18 horas. Luego, para recolectar las células para la extracción de ARN, agregue un mililitro de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio a las células para separarlas de la placa.

Después de incubar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos, transfiera las células a tubos de 1,5 mililitros. Agregue 200 microlitros de cloroformo a cada tubo e incube a temperatura ambiente durante dos minutos hasta que se puedan ver tres capas separadas, la capa de ARN, la capa de proteína y la capa de ADN. Centrifugar a los tubos a 12.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Luego, retire la capa superior de sobrenadante y transfiéralo a un tubo que contenga 500 microlitros de isopropanol. Gire los tubos sobrenadantes antes de eliminar el sobrenadante y guardar la bolita de ARN. Utilice etanol para lavar el pellet y centrifugue a 8.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Invierta el tubo durante 15 minutos para evaporar el etanol residual antes de agregar de 15 a 30 microlitros de agua libre de ARNasa. A continuación, utilice la espectroscopia UV-Vis a 260 nanómetros para cuantificar el ARN. Para realizar la RT-PCR, mezcle los siguientes reactivos y añada agua hasta un volumen final de 25 microlitros.

Coloque las muestras en un termociclador y ejecute el siguiente programa. Cuando se complete la tirada, almacene el producto a cuatro grados centígrados o 20 grados centígrados. Para llevar a cabo una inyección intramuscular, después de preparar al animal para la cirugía y anestesiarlo de acuerdo con el protocolo de texto, use un bisturí para cortar la piel aproximadamente cinco centímetros longitudinalmente sobre el tibial craneal, o CT.To marcar los sitios de inyección, use una aguja quirúrgica e hilo quirúrgico para suturar la fascia profunda haciendo dos marcadores de puntos a intervalos de dos centímetros.

Es muy importante marcar el sitio de la inyección con rosca, ya que esto permite una biopsia más precisa. A continuación, con una aguja de calibre 27, inyecte la concentración deseada de AON en el músculo y deje la aguja durante un minuto. Luego, para realizar una biopsia muscular abierta, use un bisturí quirúrgico para extraer un trozo de tejido muscular de aproximadamente dos centímetros de largo del músculo de la TC.

Vuelva a colocar la fascia muscular sobre el músculo y use un hilo absorbible 000 para cerrar el tejido. A continuación, utiliza hilo de nylon 000 para cerrar la piel. Con una aguja, administrar una inyección intramuscular de 0,02 miligramos por kilogramo de clorhidrato de buprenorfina.

Para inyectar un cóctel que contenga cantidades iguales de cada AON en una vena de la extremidad, mientras sostiene al animal de acuerdo con el protocolo de texto, inserte una aguja venosa permanente en una vena de la extremidad. Con una bomba de infusión o un controlador de jeringa, inyecte 50 mililitros en total a 2,5 mililitros por minuto durante 20 minutos, siguiendo las instrucciones del fabricante. Repita las inyecciones semanal o quincenalmente, ya que la expresión de distrofina se acumulará con las inyecciones repetidas.

Para realizar análisis de sangre semanales para examinar la toxicidad, use una aguja para recolectar tres mililitros de sangre de una de las venas subcutáneas de la extremidad anterior o posterior. Siguiendo las instrucciones del fabricante, incluya las siguientes evaluaciones. Realice análisis adicionales de acuerdo con el protocolo de texto.

Los mioblastos se transfectaron con varias condiciones de tratamiento con 2'OMePS con el fin de comparar la efectividad de cada AON. El gel que se muestra aquí representa muestras de RT-PCR de ARN recogidas cuatro días después del tratamiento. Las bandas más altas en el gel representan productos DMD fuera del marco, y se observaron en los mioblastos tratados Ex8A y Ex8B no tratados.

Ex6A, Ex6B, Ex8A y los mioblastos tratados con cóctel mostraron productos dentro del marco. La secuenciación del ADNc verificó que se habían omitido los exones 6 a 9. Como se ve en esta figura, la inmunocitoquímica reveló que las células de perro tratadas con AON tenían un aumento de las fibras positivas para la distrofina en comparación con las muestras no tratadas.

Para comparar la eficacia de varias condiciones de tratamiento con AON, se inyectó a los perros CXMD Ex6A, o un cóctel de Ex6A, Ex6B y Ex8A en varias dosis. Las muestras de músculo teñidas para DYS1 muestran un aumento en la expresión de distrofina en las muestras tratadas con cóctel, y las fibras positivas para distrofina aumentaron con la dosis de distrofina. Después de las inyecciones sistémicas, los perros CXMD tratados con cóctel mostraron una mayor expresión de distrofina en comparación con los perros NT CXMD, tanto en muestras de TC como de músculo cardíaco.

Sin embargo, los músculos esqueléticos tratados con AON mostraron una expresión mucho mayor de distrofina en comparación con el músculo cardíaco tratado. Además, los perros tratados con CXMD mostraron una mejor histopatología con una disminución significativa de las fibras nucleadas centralmente en comparación con los perros NT CXMD. Una vez dominados, los experimentos tanto in vitro como in vivo se pueden realizar en un par de horas si se realizan correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante controlar cuidadosamente el estado de salud del perro. Después de su desarrollo, la omisión sistémica de exones allanó el camino para que los investigadores en este campo comenzaran ensayos clínicos en humanos en pacientes con DMD. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo tratar a los perros con oligonucleótidos antisentido.