Name: Multi-omisión de exón utilizando oligonucleótidos antisentido de cóctel en la distrofia muscular ligada al cromosoma X canina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a inducir omisión múltiple de exones con oligonucleótidos antisentido de cóctel en un modelo canino de distrofia muscular de Duchenne. Este método demuestra rescate sistémico de distrofina sin toxicidad significativa.

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Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Alberta, el Fondo de la Cátedra de Investigación de los Amigos de Garrett Cumming, el Fondo de la Cátedra de Investigación de Ciencias Neurológicas HM Toupin, la Distrofia Muscular de Canadá, la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI), la Educación y Tecnología Avanzada de Alberta (AET), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), Jesse's Journey - La Fundación para la Terapia Génica y Celular, y el Instituto de Investigación para la Salud de la Mujer y el Niño (WCHRI).

Las tarifas de acceso abierto para este artículo fueron proporcionadas por Gene Tools, LLC.

La omisión de exón es una técnica terapéutica prometedora para el tratamiento de la DMD. Tanto in vitro e in vivo han demostrado que la omisión de multi-exón es factible. A continuación, se discute el uso del modelo de perro CXMD. En primer lugar, AONs fueron diseñados utilizando los programas de rescate-ESE y ESEfinder para apuntar exones de la distrofina 6 - 8. Se utilizó la química 2&#39;OMePS AON para CXMD transfección de mioblastos y la química de la columna vertebral AON morfolino fue elegido para los experimentos in vivo. vPMOs son más eficientes que PMOs no modificados, pero debido a su toxicidad más alta que no son adecuadas para inyecciones sistémicas. La extracción de RNA, la RT-PCR, y la secuencia de ADNc se realizaron en los mioblastos CXMD. Los perros inyectados con el cóctel PMO fueron clínicamente graduada para evaluar cualquier mejora en los síntomas clínicos. Después de que los perros se sacrificaron humanamente, se tomaron muestras de músculo y se prepararon para la crio-seccionamiento. La vida media de la proteína distrofina inducida por unaONs se cree que es aproximadamente 1 - 2 meses. perros adultos jóvenes se utilizaron en este estudio, aunque estos experimentos se pueden realizar con los perros neonatales y perros de edad avanzada (&gt; 5 años de edad). Secciones de músculo preparados se utilizaron para evaluar la histopatología y evaluar rescate proteína distrofina a través de transferencia de Western e inmunohistoquímica 48. Es importante asegurarse de que el volumen de la solución de PMO es correcta antes de las inyecciones; Al no hacerlo tendrá efectos significativos en los resultados. Durante las inyecciones intramusculares, se requiere una presión suficiente para entrar en las fibras musculares. El seguimiento de la salud del perro y la inspección del sitio de la cirugía son importantes para la solución de problemas. Para monitorear la salud de los animales, los análisis de sangre semanales y pesada se realizará. Después de la eutanasia del animal y preparación de muestras de músculo, un paso fundamental para garantizar una sensibilidad para detectar la proteína distrofina es utilizar tanto el gel de Tris-acetato y método de transferencia semisecadurante el procedimiento de transferencia Western. Como se muestra en los resultados representativos, mioblastos tratados con Ex6A, Ex6B, Ex8A, y el cóctel (que contiene Ex6A, Ex6B, Ex8A, y Ex8B) producido en marco productos DMD. Desde Ex8B no produjo productos exón omitido, no se utilizó en posteriores experimentos in vivo. secuenciación de cDNA mostró que los exones 6 - 9 se produjo el salto e inmunocitoquímica con DYS-2 tinción mostró restauró la expresión de distrofina en las muestras tratadas. perros tratados con AON mostraron un aumento significativo de fibras positivas de distrofina. Esto indica que los exones 6 - 8 fueron saltadas y se produjo una proteína acortada. La cantidad de fibras positivas de distrofina aumentó cuando se utilizó un cóctel de AONs y fue proporcional a la dosis AON. Las inmunotransferencias mostraron un aumento de la expresión de distrofina en los perros tratados con morfolino sistémicos. El músculo esquelético tenían niveles variables de fibras distrofina; sin embargo, el tejido del corazón morfolino-tratado mostró pocomejora en la expresión de distrofina. Desde la distrofina tiene un alto peso molecular (427 kDa), la detección de bajas cantidades de distrofina puede ser difícil. Para los mejores resultados, se utilizaron gel de Tris-acetato y el método de transferencia semi-seco. Tinción HE mostraron histopatología mejorado en los perros tratados con morfolino. fibras nucleadas centralmente (CNFs) son una muestra de músculo poco saludable y representan ciclos de degeneración y regeneración muscular. perros CXMD tratados con morfolino mostraron una disminución en el porcentaje de CNFs en comparación con los perros CXMD no tratados. graduación clínica reveló una mejoría de los síntomas, tales como el aumento de la capacidad para caminar y correr, en los animales tratados con morfolino. La dureza de los músculos se cree que reflejan la atrofia muscular, por lo tanto, se incluye en el sistema de clasificación 59. Se evaluó la dureza de los músculos del muslo (de las extremidades posteriores); Sin embargo, se excluyeron músculo sartorio craneales, ya que tienden a exhibir una hipertrofia en lugar de la atrofia en CXMD. perros tratados muestraned puntajes más bajos de calificación y tenía veces más rápido en el test de carrera 15 m. Tiempos mejorados con respecto a la prueba de 15 m son indicativos de mejora de la función muscular 40. puntajes de calificación globales más altos indican una mala salud y una mayor atrofia muscular. Aunque estos resultados son prometedores, multi-omisión de exón todavía presenta muchos desafíos que hay que superar antes de que la técnica tiene aplicabilidad clínica. tejido cardíaco todavía muestra reducida absorción de AONs, probablemente debido a la diferencia en el tráfico celular entre el tejido cardíaco y esquelético. No se observaron efectos tóxicos se han observado en animales bajo los regímenes de dosificación actuales; Sin embargo, aún queda trabajo por hacer para evaluar la toxicidad a largo plazo antes de que el uso de cócteles AON puede pasar a los ensayos clínicos. Es difícil lograr la aprobación de drogas cóctel AON porque las agencias reguladoras definen cada secuencia AON como fármaco único. Esto significa que tendría que ser probado de forma individual para cada uno de segur secuencia en un cóctelY, lo que requiere más tiempo y más dinero. Otra barrera para el uso de multi-omisión de exón en un entorno clínico es una gran cantidad de productos de proteína de intermedios producidos con funciones desconocidas. Estas proteínas pueden potencialmente conducir a efectos secundarios impredecibles, dependiendo de la mutación individuo 22. Además, los patrones de mutación disponibles dentro de los modelos actuales de perros distróficos son limitadas. Hay pocas mutaciones naturales, y no todas las mutaciones son útiles para el estudio de multi-omisión de exón. El modelo de cerdo distrófica promete ser una buena alternativa para el futuro DMD omisión de exón 33, 34 estudios. Los modelos de perros con DMD tienen algunas ventajas sobre otros modelos de DMD. Al ser un modelo animal más grande, la clasificación clínica y la resonancia magnética son posibles, lo que permite un análisis más detallado. Dado que los perros son los animales grandes también son más adecuados para los estudios de toxicología y representan más de cerca la enfermedad humana en comparación con el modelo de ratón. perro modelos también tienen secuencias de genes de DMD que son más similares a los humanos 23, 34, 45. Aunque técnicamente difícil, el enfoque multi-omisión de exón podría beneficiarse en última instancia,&gt; 90% de los pacientes con DMD 24. Esto hace que sea una alternativa mucho mejor que la omisión de un solo exón, como la omisión de exón de un solo es aplicable únicamente a un pequeño subgrupo de pacientes. Además, multi-omisión de exón nos permitirá seleccionar los patrones de deleción que optimizan la funcionalidad de las proteínas distrofina acortada. Por ejemplo, la supresión de la DMD exones 45 - 55 se asocia con síntomas leves o excepcionalmente individuos asintomáticos 14,19,60-63. La omisión multi-exón de exones 45 - 55 ya se ha demostrado en un modelo murino de DMD con una deleción del exón 52 (mdx52) usando inyecciones sistémicas de vPMOs 22,26. El uso de vPMOs cóctel se ha demostrado también en otras formas de distrofia muscular, talesFukuyama como la distrofia muscular congénita (FCMD). FCMD es causada por atrapamiento de exones, en el que el empalme de mRNA aberrante es causada por la inserción retrotransposón. vPMOs se han demostrado para rescatar el patrón de empalme tanto en un modelo de ratón FCMD y en líneas celulares humanas 64. La próxima generación de AON químicas que presentan una mayor eficacia y baja toxicidad, podría facilitar la traducción eficaz del enfoque multi-omisión de exón en la aplicación clínica. Además, la omisión de multi-exón potencialmente se podría aplicar a otros trastornos genéticos, tales como la dysferlinopathies 24, 65.

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular recesiva ligada al cromosoma X se caracteriza por debilidad muscular progresiva, descrito por primera vez por el Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. La DMD es una enfermedad genética común que afecta a aproximadamente 1 de cada 3.500 niños en todo el mundo, con aproximadamente 20.000 niños afectados nacen cada año 2,3. El desarrollo motor se retrasa y alteraciones de la marcha se ve en la primera infancia 4, seguido de la dependencia sobre silla de ruedas en los primeros años de adolescencia. La muerte se produce normalmente entre las edades de 20 y 30 debido a la insuficiencia respiratoria o cardiaca 5-8. Actualmente no existe cura para la DMD. El tratamiento con glucocorticoides puede ralentizar la progresión de la degeneración muscular en cierto grado, pero se asocia con efectos secundarios significativos, incluyendo la obesidad y la diabetes mellitus 2,7,8. DMD resulta de mutaciones en el gen de la distrofina (DMD), lo que lleva a una pérdida de distrofina funcional protein. La DMD es un gen muy grande, con más de 2 millones de pares de bases y 79 exones 9,10. Deleción, sin sentido, y duplicación mutaciones que conducen a mutaciones fuera de la trama son la causa más común del fenotipo DMD. Las regiones de los exones 3 - 9 y los exones 45 - 55 se denominan &quot;puntos calientes de mutación&quot; como la mayoría de los pacientes tienen mutaciones de deleción dentro de estas porciones del gen, lo que lleva a la distrofina no funcional en pacientes con DMD 3,9,11-16. funciones de distrofina dentro del complejo distrofina-glicoproteína (DGC), que tiene un papel importante en la estabilización de la membrana muscular. La N- y C-terminales son los dominios más importantes para la función, mientras que el dominio de varilla central juega un papel menos importante 3,9,17. La observancia de un fenotipo leve asociado con distrofia muscular de Becker (BMD), lo que se traduce en su mayoría de las mutaciones en marco en el gen DMD, inspiró la aplicación de la omisión de exón para el tratamiento de la DMD. pacientes DMO han acortado una, pero functional, la proteína distrofina que mantiene ambos extremos 3,6,18. La omisión de exón, en teoría, puede restaurar el marco de lectura, lo que resulta en proteínas acortadas de distrofina funcional, pero-similares a los observados en la DMO 3,19. Múltiples tipos de oligonucleótidos antisentido (AONs) han sido probados en ensayos clínicos, incluyendo fosforotioatos metilados-2O (2&#39;OMePS) y oligómeros de morfolino fosforodiamidada (PMO). Saltarse los exones 51 y 53 que utilizan estos AONs ha sido examinado y si bien los resultados son prometedores, la omisión de exón de un solo tiene aplicabilidad limitada, ya que es-mutación específica 3, 19, 20,21, 22-26. Las preguntas también sobre la estabilidad de las proteínas distrofina acortada resultantes producidos a partir de un solo salto de exón 22,23. Además, algunos pacientes requieren más de un solo exón a ser omitido con el fin de restaurar el marco de lectura 3. Aunque técnicamente más difícil, multi-omisión de exón es un método quepodría hacer frente a estos problemas 3,19. Multi-omisión de exón previamente se ha demostrado en perro distrófica y líneas celulares humanas in vitro. Además, mdx52 ligadas al cromosoma X modelos de ratón para perros y caninos de la distrofia muscular (CXMD) se han utilizado para los estudios in vivo 22, 24-27. Distrofia muscular ligada al cromosoma X Canine Japón (CXMD J) se utilizaron beagles aquí, ya que el marco de lectura de CXMD J puede ser restaurada por la omisión de multi-exón de exones 6 y 8, o exones adicionales (por ejemplo, los exones 3-9) (Figura 1). CXMD a base de Beagle comparte el mismo patrón de mutación como el modelo Golden Retriever distrofia muscular (GRMD), pero beagles son más pequeños y más baratos de mantener debido a su tamaño corporal, proporcionando así un modelo útil para la DMD 28,29. CXMD perros se asemejan más a la fenotipo DMD humana que los modelos animales más pequeños, como roedores, y son más fiables para las evaluaciones toxicológicas 3,22,30,31 </sarriba&gt; (Figura 2). CXMD perros muestran la decadencia progresiva muscular, alteraciones de la marcha, y los problemas cardíacos y respiratorios similares a los observados en la DMD. En comparación con la omisión de un solo exón, multi-omisión de exón es aplicable a una proporción mucho mayor de pacientes. Entre los tres tipos de mutaciones más comunes (deleciones, duplicaciones, y sin sentido), el 80 - 98% de los pacientes podría ser tratada a través de múltiples salto de exón 14,32,33, mientras que el 45% de todos los pacientes con DMD podría beneficiarse de los exones 45 saltarse específicamente - 55 3,19,22,34. Con el desarrollo de morfolinos modificados, la eficiencia de cócteles AON a facilitar la omisión de exón ha mejorado. Ricos en arginina PMO conjugado de péptido-penetran en las células (PPMOs), y vivo-morfolinos (vPMOs) son las químicas AON que han mejorado significativamente la capacidad y la estabilidad 3,35-38 penetrante en las células. Persiste la preocupación acerca de la toxicidad de AON a largo plazo; Sin embargo, el progreso significativofue hecho. Las modificaciones químicas introducidas en morfolinos disminuyen en gran medida fuera de objetivo efectos y los estudios preclínicos no han reportado efectos tóxicos significativos 3,22,39,40. Un desafío pendiente para multi-omisión de exón es el requisito actual para cada sola AON a ensayar para la toxicidad por sí solo, como un solo fármaco, en vez de juntos como un cóctel 3,19,22,41,42. En los estudios que implican DMD, monofásicos y multi-omisión de exón dirigida al corazón, ha habido pocas mejoras en el tejido del corazón distrófica. La eficacia de morfolinos en el corazón se piensa que es bajo debido a la mala capacidad de penetración celular. PPMOs péptido conjugado han mejorado la capacidad de AONs para penetrar en las células cardíacas, el aumento de la cantidad de proteína distrofina funcional rescatado en el corazón 3,19,38. Aquí, nuestro enfoque cóctel de AON se analiza en profundidad, incluyendo el diseño de secuencias utilizando el software de AON ESEfinder 43. protocTambién se describen oles para experimentos con perros multi-omisión de exón. CXMD J beagles se utilizaron para los exones 6 y 8 experimentos saltarse. Multi-omisión de exón en el modelo de perro CXMD muestra resultados prometedores, pero sigue habiendo dificultades que deben superarse antes de que sean clínicamente aplicable.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Transfección de mioblastos de perros&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>3 ml placas de 6 pocillos</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectina&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Volumen total de 100 ml en medios opti-MEM en una proporción de 2:1 para lipofectina. 10 ml de lipofectina para 5 mg de ARN.&nbsp;</td></tr><tr><td>2' OMePS</td><td>Eurogentec&nbsp;</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) y Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero de caballo&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr><tr><td>estreptomicina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>de albúmina sérica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfección de morfolino de mioblastos de perros 
Todo el material de MePS Transfección de mioblastos de perros para el cultivo de</td></tr><tr><td>morfolinos antisentido&nbsp;</td><td>Herramientas</td><td></td> genéticas <td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Diluir hasta un volumen final de 100 L en medios opti-MEM. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg de morfolinos a 32 mg/ml en solución salina</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/plate</td></tr><tr><td colspan="4"><Extracción >ARN fuertey reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)</</td></tr><tr><td>tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio fuerte></td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/placa</td></tr><tr><td></td><td>Cloroformo Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &#956; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml&nbsp;</td>Centrífuga <td>22363204</td><td></td> <td>Eppendorf</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Etanol&nbsp;</td>Espectrómetro UV <td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cebador directo en el exón 5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 &#956; M</td></tr><tr><td>Imprimación inversa en el exón 10&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 &#956; M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Kit RT-PCR de un solo paso&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Secuenciación de ADN complementario (ADNc)&nbsp; Kit de extracción </td></tr><tr><td>gel&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de secuenciación de ciclo Terminator v3.1&nbsp;</td><td>Biosistemas Aplicados&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inyecciones intramusculares o biopsia de músculo abierto</herramientas</td></tr> <tr><td>quirúrgicas</td><td></td><td></td> fuertes><td>Tijeras, bisturí, aguja, hilo quirúrgico&nbsp;</td></tr><tr><td>Ungüento veterinario&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yodóforos&nbsp;</td><td>webtextiles</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>clorohexidina</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>paños quirúrgicos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascarilla Facial Exfoliante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de la cabeza&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiopental sódico&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Laboratorios Abbott&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Morfolinos antisentido&nbsp;</td><td>Herramientas</td><td></td> genéticas <td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Diluir hasta un volumen final de 100 L en medios opti-MEM. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg de morfolinos a 32 mg/ml en solución salina</td></tr><tr><td>27&nbsp; Agujas G</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de buprenorfina</td> Depresor de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lengua&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cefalexina</td><td></td><td>15 a 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cefazolina</td><td></td><td>15 a 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina&nbsp;</td><td></td><td>0,01 mg/kg</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de buprenorfina&nbsp;</td><td>0.02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Inyecciones sistémicas</fuerte></td></tr><tr><td>Bomba de infusión de jeringa&nbsp;</td><td>Muromachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp; G Agujas permanentes</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp; Agujas G&nbsp;</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>solución salina</td><td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Clasificación clínica de perros</td></tr><tr><td>Cámara de vídeo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronómetro&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Resonancia magnética (RMN)&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>3 Tesla MRI l&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Bobina <td></td><td></td><td></td><td>de extremidad humana de 18 cm de diámetro/18 cm de longitud</td></tr><td colspan="4">Toma de muestras y preparación de músculo (necropsia)Thiopental sódico&nbsp;<tr></td></tr><tr><td></td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Laboratorios Abbott&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr>Goma <td></td><td></td><td>de tragacanto</td><td>10-20 ml</td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Discos de corcho</td><td>Iwai-kagaku&nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>hielo</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>Poly-L-lisina&ndash; portaobjetos recubiertos</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Microsystem&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>cm1900&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Diluciones 1:150 &nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS2&nbsp;</td><td>Diluciones 1:150</td></tr><tr><td>Alexa 594 cabra antiratón IgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:2.500 diluciones</td></tr><tr><td>Alexa 594 cabra antiratón IgG2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>diluciones 1:2.500</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Contiene agente de montaje</td></tr><tr><td>Suero de cabra&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15%</td></tr><tr><td>PBS Cámara de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>humedad&nbsp;</td><td>Laboratorio de Ingeniería Científica&nbsp;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de cámara&nbsp;</td><td>Lab-tek&nbsp;</td><td></td><td></td>154453</tr><tr><td>Cubreobjetos&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Pluma de barrera hidrofóbica&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente&nbsp;</td><td></td><td></td><td>594 nm con un aumento de 20X.</td></tr><tr><td colspan="4">Western Blotting&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>Agua destilada&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de mano&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&veces; Laemmli SDS-búfer de carga&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris&ndash; HCl (pH 6,6), 2% (p/v) SDS, 2% (0,28&nbsp; M) beta-mercaptoetanol, 20% glicerol, 0,01% azul de bromofenol&nbsp;</td></tr><tr><td>Geles SDS&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-1210</td><td>5% geles</td></tr> de <tr><td>resolución SDS</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Invitrogen, membrana WG1601BOX</td><td>3-8%</td></tr> <tr><td>PVDF&nbsp;</td><td>Tampón de funcionamiento de</td><td></td> metanol <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> GE <tr><td>10600021 (10&times;)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM de Tris-Base, 1.920 mM de tampón de funcionamiento de glicina</td></tr><tr><td>(1&times;)</td><td></td><td></td><td>10% 10 veces; tampón, 20% metanol</td></tr><tr><td>0.05% PBS/Preadolescente 20 (PBST)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2.000 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3&veces; 200 ml para lavar</td></tr><tr><td>PBST/5% de leche en polvo&nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td></td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Beta Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de carga/muestra para Western blot</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor del cóctel de proteasa&nbsp;</td><td></td><td></td> Tampón catódico Roche 11836153001 <td></td></tr><tr><td></td> 0,025 M Tris base + 40&nbsp;<td></td><td></td><td> mM Ácido 6-aminocaproico + 20%</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de ánodo de metanol <td>0,03 M Tris Base + 20%</td></tr><tr>Tampón <td></td><td></td><td>de ánodo concéntrico</td> de metanol <td>0,3 M Base Tris + 20%</td></tr><tr><td>Anticuerpo de metanol desmina&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Diluciones 1:150 &nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td> ImageJ</tr></tbody></table>

multi-omisión de exón utilizando oligonucleótidos antisentido de cóctel en la distrofia muscular ligada al cromosoma x canina

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las enfermedades genéticas letales más comunes en todo el mundo, causadas por mutaciones en el gen de la distrofina (DMD). La omisión de exón emplea moléculas cortas de ADN / ARN, llamadas oligonucleótidos antisentido (AONs) que restauran el marco de lectura y producen proteínas más cortas, pero funcionales. Sin embargo, la terapia de omisión de exón se enfrenta a dos obstáculos principales: la aplicabilidad limitada (hasta sólo el 13% de los pacientes pueden ser tratados con un solo fármaco AON), y la función de las proteínas truncadas incierta. Estas cuestiones fueron tratadas con un método cocktail AON. Mientras que aproximadamente 70% de los pacientes con DMD puede ser tratada por solo la omisión de exón (todos los exones combinados), se podría potencialmente tratar a más de 90% de los pacientes con DMD si exón múltiple omitiendo el uso de drogas antisentido de cóctel puede ser realizado. Se utilizó el canino ligada al X distrofia muscular (CXMD) modelo de perro, cuyo fenotipo es más similar a los pacientes con DMD humanos, para probar la effic sistémicoACY y la seguridad de multi-omisión de exón de exones 6 y 8. El modelo de perro CXMD alberga una mutación del sitio de empalme en el intrón 6, que conduce a la falta del exón 7 en el ARNm de la distrofina. Para restaurar el marco de lectura en CXMD requiere multi-omisión de exón de exones 6 y 8; Por lo tanto, CXMD es un buen modelo animal de tamaño medio para probar la eficacia y seguridad de multi-omisión de exón. En el estudio actual, un cóctel de morfolinos antisentido dirigidos exón 6 y el exón 8 se diseñó y se restauró la expresión de distrofina en los músculos esqueléticos en todo el cuerpo. se presentan métodos para la transfección / inyección de oligos de cóctel y evaluación de la eficacia y seguridad de multi-omisión de exón en el modelo de perro CXMD.

Los experimentos in vitro Los mioblastos se transfectaron con diferentes condiciones de tratamiento 2&#39;OMePS el fin de comparar la eficacia de cada AON. tratamientos individuales AON con 600 nM de cada uno de Ex6A, Ex6B, Ex8A, o Ex8B se realizaron, así como un tratamiento de cóctel con 600 nM de cada uno de los 4 secuencias de AON. Las muestras de ARN se recogieron cuatro días después de la transfección. Después de RT-PCR, las muestras para cada tratamiento se ejecutan en un gel junto con las muestras no tratadas (NT). Bandas más altas en el gel representan fuera del marco de productos DMD; estas bandas se observaron en NT, Ex8A, y Ex8B mioblastos tratados. Ex6A, Ex6B, Ex8A, y los mioblastos cóctel tratados mostraron productos montados en el bastidor. El cóctel y Ex6A / B mostraron 100% de productos en marco, mientras que Ex8A mostró sólo un 30% de productos en marco (Figura 7). Para confirmar la omisión de exón y la restauración deel marco de lectura, se realizó la secuenciación de ADNc; los resultados indicaron que los exones 6-9 de hecho se han saltado (Figura 7). La inmunohistoquímica mostró que los perros tratados con AON habían aumentado fibras positivas de distrofina en comparación con muestras de NT (Figura 8). Experimentos in vivo Para comparar la eficacia de diferentes condiciones de tratamiento AON, perros CXMD (0,5 - 5 años de edad) se inyectaron una vez con 1,2 mg Ex6A o un cóctel de Ex6A, Ex6B, y Ex8A en varias dosificaciones. Dos semanas después de la inyección, se recogieron muestras de músculo y se tiñeron con DYS-1 para comparar el número de fibras positivas de distrofina. Todas las muestras de cóctel tratados mostraron un aumento de la expresión de distrofina en comparación con muestras de NT. Fibras positivas de distrofina aumentaron con la dosis de AON (Figura 9). siguiente sistemaLa inyección IC, de tipo salvaje (WT), NT, y muestras de músculo CXMD cóctel tratados se tiñeron con DYS-1 (Figura 10). perros CXMD cóctel tratados mostraron un incremento en la expresión de distrofina en comparación con los perros NT CXMD, tanto en la TC y muestras del músculo del corazón. Sin embargo, el músculo esquelético AON-tratado (CT) mostró mucho más alta expresión de distrofina en comparación con el músculo cardiaco tratado. Una comparación de inmunoblot WT, NT, y varios músculos tratados con cócteles morfolino llevó a la misma conclusión. También había una amplia gama de la expresión de distrofina en las muestras de músculo esquelético tratados (Figura 10). Hematoxilina y eosina (HE) tinción reveló que trató CXMD perros mostraron una mejor histopatología, con una disminución significativa en las fibras centralmente nucleadas (CNF) en comparación con los perros NT CXMD (Figura 11). Esto indica que hay más degeneración / regeneración que ocurre en el perro NT, un signo de patología muscular distrófica. Además, los perros tratados tenían más rápidotiempos y puntuaciones mejoradas que se ejecuta en la escala de calificación clínica. CXMD perros tratados mostraron mejores puntajes que los perros NT CXMD en todas las categorías (Figura 12). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figura 1. patrón de mutación del Perro CXMD y exones 6 -. 8 Skipping Estrategias El uso de un cóctel antisentido perros CXMD tienen una mutación puntual en el exón 6 conduce a una pérdida del exón 7 en el ARNm perro distrófico. Esto se traduce en el ARNm ser fuera de marco y la producción de proteína distrofina se pierde. secuencias AON cortas están diseñadas para unirse al exón 6 y 8, lo que resulta en mRNA splicing saltar efectivamente exones 6 - 8. La barra gris en los perros tratados con cóctel AON representa secuencias cortas AON. Exón 9 codifica un dominio bisagra y es a veces espontáneamente empalmado con AONs contra el exón 6 y 8. Los códigos resultantes de ARNm de la distrofina proteínas que son más cortas pero funcionanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Se muestra en la Figura 2. Principales síntomas clínicos de un animal de 1 año de edad, ligada al cromosoma X canina de la Distrofia Muscular (CXMD). A 1 años de edad, beagle de tipo salvaje y un perro CXMD. La participación de los proximal, la integridad física, y los músculos temporales se observan típicamente de 2 meses de edad. Contractura de la articulación y un desplazamiento de la pelvis son abiertas a partir de 4 meses de edad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figura 3. La anestesia general para un perro. A) Intramusculinyecciones de Ar y biopsias musculares se llevan a cabo bajo anestesia general con isoflurano. B) La celebración del animal para inyecciones sistémicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figura 4. Imagen de Resonancia Magnética (MRI) de tipo salvaje, para no tratada CXMD, y se trata CXMD. Una resonancia magnética del miembro posterior a los 3 meses y 5 meses en WT y NT CXMD perros. Se muestran dos imágenes de la muestra de imágenes de resonancia magnética de las extremidades traseras CXMD tratados pre- (1 semana antes de la primera inyección) y post-inyección de AON. 2703MA se trató semanal 7x con 200 kg de cóctel morfolinos mg /. 2001MA se trató con inyección IV semanal 5x de 120 mg / kg de cóctel morfolinos. Control y perros tratados fueron emparejados por edad. Los perros tratados muestran una disminución de señales T2. Las imágenes son ADAP<html> Ted con el permiso de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figura 5. muscular procedimiento de biopsia para un perro. A) Un miembro inferior se fija para la biopsia muscular. B) Con la ayuda de unas pinzas, se lleva a cabo la extremidad inferior. C) El músculo CT está expuesto. técnica de biopsia abierta se utiliza para obtener muestras de músculo de sitios inyectados. Los hilos se utilizan para mantener las muestras de biopsia. Muestras D) del músculo en la goma de tragacanto después de la disección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Se presenta la figura 6. Método semiseco de transferencia. Una representación del método de transferencia semi-seco por transferencia Western. Tres documentos empapados en tampón de ánodo concentrado se establecen en el terminal negativo; 3 papeles empapados en tampón de ánodo se apilan en la parte superior de esta. El documento Mb PVDF se empapa en tampón de ánodo metanol y, a continuación, antes de ser establecido en la parte superior de los 6 papeles. El gel, que se ha empapado en tampón de cátodo, se coloca suavemente sobre el papel PVDF. Finalmente, 3 papeles empapados en tampón de cátodo se colocan en la parte superior del gel. El terminal positivo se fija en la parte superior. Durante 1 hora, 400 mA se ejecuta a través del sistema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figura 7. La omisión de exón en CXMD mioblastos. </strong&gt; mioblastos CXMD fueron transfectadas con Ex6A, Ex6B, Ex8A, o Ex8B solo, o un cóctel de los cuatro. Se utilizó un total de 600 nM para las secuencias individuales y para el cóctel se utilizó 600 nM de cada secuencia. A) 2&#39;OMePS tratamiento en mioblastos perro CXMD. Ex6A, Ex6B, y las muestras de cóctel tratados muestran fuertes bandas a la posición esperada de las transcripciones exón-omitido en el marco. Ex8A muestra una banda intermedia, Ex8B muestra una banda débil, y NT no muestra una banda en la posición en el marco. B) la secuencia de ADNc de Ex6A solo, 4 días después de la transfección. Las imágenes se adaptan con permiso de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Figura 8. El aumento de Dystrophin Expresión en metilados-2O (fosforotioato 2&#39;OMePS) transfectadas CXMD mioblastos. mioblastos CXMD fueron transfectadas con Ex6A solo o con 2&#39;OMePS cóctel. DYS-2 (rojo) y DAPI (azul) se muestran. Los mioblastos tratados se comparan con los de tipo salvaje (WT) y mioblastos no tratadas (NT). Las imágenes se adaptan con permiso de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figura 9. Rescate de la expresión de distrofina con inyecciones intramusculares de Morpholinos en CXMD perros. De cualquier Ex6A solo o un cóctel de Ex6A, Ex6B, y Ex8A se inyecta en los músculos de TC de perros CXMD. La distrofina (DSY-1) tinción de tipo silvestre(WT), no tratados (NT), y se muestran los perros tratados CXMD. Los perros fueron tratados con 1,2 mg Ex6A solo o 1,2 mg de cóctel. Las imágenes se adaptan con permiso de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Barra = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figura 10. El aumento de la expresión de distrofina Después de Cocktail Tratamiento sistémico morfolino en CXMD perros. La distrofina (DYS-1) tinción se utilizó para comparar la expresión de distrofina en el tipo salvaje (WT) (control positivo), no tratados (NT) (control negativo), y perros CXMD tratados con 120 mg / kg morfolino cóctel (40 mg / kg de cada AON). El cóctel de morfolino contenía Ex6A, Ex6B, y Ex8A. Los perros fueron inyectados por vía intravenosa 5 vecesekly con este cóctel. A) Una comparación de la expresión de distrofina en los músculos tibial craneal (TC) de WT, NT, y los perros tratados. B) Una comparación de la expresión de distrofina en el tejido del corazón entre NT y los perros tratados con cóctel de morfolino. C) por inmunotransferencia de la distrofina con desmina como control de carga se muestra para WT, NT, y los perros tratados con cóctel de morfolino. Los siguientes músculos se muestran para los perros tratados: tríceps braquial (TB), bíceps braquial (BB), el diafragma (DIA), el esófago (ESO), CT, aductor (ADD), el extensor largo de los dedos (EDL), masetero (MAS), y el corazón. Las imágenes se adaptan con permiso de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Barra = 200 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figura11. Mejora de la histopatología en CXMD perros tratados durante 7 semanas con 240 mg / kg de cóctel morfolino. CXMD perros que van de medio año a cinco años de edad fueron inyectados por vía intravenosa con 240 mg / kg morfolino cóctel (Ex6A, Ex6B, y Ex8A) una vez al semana durante 7 semanas. Catorce días después de la última inyección, se tomaron los músculos del esófago y se hizo hematoxilina y eosina (HE) tinción. Tinción HE de los músculos del esófago de la no tratada (NT) y morfolino cóctel tratados (tratados) CXMD perros (40X lente objetivo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figura 12. puntuaciones mejoraron en clasificación clínica y 15 m Duración Después de los perros tratados con morfolino morfolino tratamiento. Se compararon con los no tratados de la misma camada (NT)s. Las barras de error en el gráfico indican SEM. A) La puntuación total en el examen de graduación clínica se calculó antes y después del tratamiento y los animales tratados se compararon con los compañeros de camada NT. B) Una comparación de 15 m tiempos de funcionamiento de los perros tratados y NT. C) Similar al modelo B; sin embargo, se utilizaron perros más jóvenes. Las imágenes se adaptan con permiso de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> El oligonucleótido antisentido </td><td> secuencia de nucleótidos </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Diseño oligonucleótido antisentido.

La omisión de exón es actualmente una opción terapéutica más prometedora para la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Para ampliar la aplicabilidad de los pacientes con DMD y para optimizar la estabilidad / función de las proteínas de distrofina truncados resultantes, un multi-exón enfoque saltar utilizando oligonucleótidos antisentido de cóctel fue desarrollado y hemos demostrado rescate distrofina sistémica en un modelo de perro.

Multi-omisión de exón utilizando oligonucleótidos antisentido de cóctel en la distrofia muscular ligada al cromosoma X canina

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

El objetivo general de este experimento es examinar la eficacia y toxicidad del salto múltiple de exones mediante oligonucleótidos antisentido o AONs en un modelo canino de la distrofia muscular de Duchenne o DMD. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación traslacional de la terapia de salto de exones por antisentido, como si los oligonucleótidos antisentido pueden inducir el salto múltiple de exones y suprimir la expresión de distrofina en un modelo animal de gran tamaño. La principal ventaja de utilizar el modelo canino en un estudio es que los resultados terapéuticos en animales de mayor tamaño pueden extrapolarse de manera más confiable a los pacientes con DMD.Aunque la omisión de exones es una terapia muy prometedora para la DMD, también puede aplicarse a otras enfermedades genéticas, como la distrofia muscular congénita y la distrofia muscular de cintura. Las experimentaciones in vitro serán demostradas por el Dr. Yoshitsugu Aoki, jefe de nuestro laboratorio, y las experimentaciones in vivo serán demostradas por el Dr. Mutsuki Kuraoka, investigador posdoctoral de mi departamento. Después de diseñar los AON según el protocolo descrito, utilice placas de 6 pocillos para sembrar de uno a cinco veces 10 a la tercera por centímetro cuadrado de mioblastos CXMD en tres mililitros de DMEM con 10% de FBS y 1% de pen-estrepto.Incube las células a 37 grados Celsius hasta que alcancen una confluencia del 60 al 80 %. Cuando las células alcancen la confluencia deseada, utilice medio con suero reducido para diluir un reactivo de transfección con liposomas catiónicos hasta un volumen total de 100 microlitros, y deje la mezcla reposar a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos. Luego, con medio con suero reducido, diluya los AON hasta un volumen final de 100 microlitros.Combine el reactivo de transfección diluido con los AON diluidos e incube a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Mientras tanto, retire el medio de las células y lávelas tres veces con medio fresco. A continuación, agregue 0,8 mililitros de medio a la mezcla de transfección y luego añada toda la solución a las células recién lavadas.Incubar a 37 grados Celsius durante tres horas. Luego, añadir medio de diferenciación, o DM, a las células e incubar hasta 10 días para que ocurra la diferenciación. A partir del día tres aproximadamente, verificar la diferenciación.Para realizar la transfección con morpholino en mioblastos caninos, cultive mioblastos CXMD como se demostró anteriormente en este video. Caliente la mezcla de morpholinos a 65 grados Celsius durante 10 minutos. Luego agregue un reactivo de entrega peptídico y ajuste el morpholino a una concentración final de tres a seis micromoles.A continuación, use DM para reemplazar el medio en los mioblastos y agregue el morfolino a cada pocillo a una concentración final de un micromolar. Incube durante 16 a 18 horas. Luego, para recolectar las células para la extracción de ARN, agregue un mililitro de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo a las células para desprenderlas de la placa.Después de incubar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos, transfiera las células a tubos de 1,5 mililitros. Añada 200 microlitros de cloroformo a cada tubo e incube a temperatura ambiente durante dos minutos hasta que se observen tres capas separadas: la capa de ARN, la capa de proteínas y la capa de ADN. Centrifugue los tubos a 12.000 × g y 4 grados Celsius durante 15 minutos.Luego, retire la capa superior del sobrenadante y transfiérala a un tubo que contenga 500 microlitros de isopropanol. Centrifugue los tubos de sobrenadante antes de eliminar el sobrenadante y conservar el pellet de ARN. Lave el pellet con etanol y centrifugue a 8.000 × g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Invierta el tubo durante 15 minutos para evaporar el etanol residual antes de agregar de 15 a 30 microlitros de agua libre de RNasas. Luego, utilice espectroscopía UV-Vis a 260 nanómetros para cuantificar el ARN. Para llevar a cabo la RT-PCR, mezcle los siguientes reactivos y agregue agua hasta un volumen final de 25 microlitros.Coloque las muestras en un termociclador y ejecute el siguiente programa. Cuando finalice la corrida, almacene el producto a cuatro grados Celsius o a 20 grados Celsius. Para realizar una inyección intramuscular, después de preparar al animal para la cirugía y anestesiarlo según el protocolo descrito en el texto, use un escalpelo para cortar la piel longitudinalmente aproximadamente cinco centímetros sobre la tibia craneal, o CT. Para marcar los sitios de inyección, use una aguja quirúrgica e hilo quirúrgico para suturar la fascia profunda realizando dos puntos marcadores a intervalos de dos centímetros.Es muy importante marcar el sitio de inyección con hilo, ya que esto permite una biopsia más precisa. A continuación, utilizando una aguja de 27 gauge, inyecte la concentración deseada de AONs en el músculo y deje la aguja dentro durante un minuto. Luego, para realizar una biopsia muscular abierta, use un bisturí quirúrgico para extraer un fragmento de tejido muscular de aproximadamente dos centímetros de longitud del músculo CT.Coloque la fascia muscular nuevamente sobre el músculo y utilice un hilo absorbible 000 para cerrar el tejido. Luego, use hilo de nylon 000 para cerrar la piel. Mediante una aguja, administre una inyección intramuscular de 0,02 miligramos por kilogramo de clorhidrato de buprenorfina.Para inyectar una mezcla que contenga cantidades iguales de cada AON en una vena del miembro, mientras se sostiene al animal según el protocolo descrito en el texto, inserte una aguja intravenosa en una vena del miembro. Mediante una bomba de infusión o un accionador de jeringa, inyecte un volumen total de 50 mililitros a razón de 2,5 mililitros por minuto durante 20 minutos, siguiendo las instrucciones del fabricante. Repita las inyecciones semanal o quincenalmente, ya que la expresión de distrofina se acumulará con inyecciones repetidas.Para realizar pruebas sanguíneas semanales para examinar la toxicidad, use una aguja para recolectar tres mililitros de sangre de una de las venas subcutáneas de la extremidad anterior o posterior. Siguiendo las instrucciones del fabricante, incluya las siguientes evaluaciones. Realice análisis adicionales según el protocolo descrito en el texto.Los mioblastos fueron transfectados con diversas condiciones de tratamiento con 2'OMePS para comparar la eficacia de cada AON. La imagen del gel representa muestras de RT-PCR a partir de ARN recolectado cuatro días después del tratamiento. Las bandas ubicadas más arriba en el gel representan productos DMD fuera del marco de lectura, y se observaron en los mioblastos no tratados Ex8A y Ex8B tratados.Los mioblastos tratados con Ex6A, Ex6B, Ex8A y con la mezcla mostraron productos en el marco de lectura. La secuenciación de ADNc verificó que se habían eliminado los exones 6 al 9. Como se observa en esta figura, la inmunocitoquímica reveló que las células caninas tratadas con AON presentaban un mayor número de fibras positivas para distrofina en comparación con las muestras no tratadas.Para comparar la eficacia de diversas condiciones de tratamiento con AON, perros con CXMD fueron inyectados con Ex6A, o con un cóctel de Ex6A, Ex6B y Ex8A en varias dosis. Las muestras musculares teñidas para DYS1 muestran un aumento en la expresión de distrofina en las muestras tratadas con el cóctel, y las fibras positivas para distrofina aumentaron con la dosis de distrofina. Tras inyecciones sistémicas, los perros con CXMD tratados con el cóctel mostraron una expresión aumentada de distrofina en comparación con los perros con CXMD no tratados, tanto en muestras de músculo CT como cardíaco.Sin embargo, los músculos esqueléticos tratados con AON mostraron una expresión mucho mayor de distrofina en comparación con el músculo cardíaco tratado. Además, los perros CXMD tratados mostraron una histopatología mejorada con una disminución significativa de las fibras con núcleos centrales en comparación con los perros CXMD no tratados. Una vez dominados, ambos experimentos, in vitro e in vivo, pueden realizarse en un par de horas si se realizan adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante monitorear cuidadosamente el estado de salud del perro. Tras su desarrollo, la omisión exónica sistémica allanó el camino para que los investigadores en este campo iniciaran ensayos clínicos en humanos con pacientes con DMD. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo tratar a los perros con oligonucleótidos antisentido.

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