El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

El objetivo general de este procedimiento es aislar rápidamente células tumorales humanas xenotrasplantadas de ratones para mejorar el análisis posterior de las células objetivo deseadas. La eliminación de las células de ratón contuminantes por este método permite la evaluación específica de la expresión génica de las células tumorales humanas o las respuestas directas in vitro. La principal ventaja de esta técnica es que las células tumorales humanas se pueden aislar rápida y fácilmente sin tener que identificar ningún marcador de superficie en las células diana.

Comience usando fórceps y un bisturí para extraer la grasa y las áreas necróticas de la muestra tumoral. Luego, pica el tumor en pedazos de dos a cuatro milímetros. A continuación, transfiera los fragmentos de tejido a un tubo de disociación de suspensión de una sola célula que contenga la mezcla de digestión y cierre herméticamente el tubo.

Coloque el tubo boca abajo en un soporte de disociador de tejido de sobremesa y confirme que las piezas de tejido estén en el área del estator del rotor. Conecte el calentador al disociador, luego haga clic en el símbolo de la carpeta en la pantalla táctil y use las flechas hacia arriba y hacia abajo para seleccionar el modo de disociación tumoral apropiado. A continuación, seleccione la posición de montaje donde se encuentra la muestra e inicie la disociación.

Cuando se haya obtenido una suspensión de una sola célula, centrifugar rápidamente el tubo para recoger las células en la parte inferior del tubo. Filtre las células a través de un colador de malla de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros y enjuague el colador con 20 mililitros de medio, recogiendo el lavado en el tubo de muestra. Luego centrifugar las células y volver a suspender el pellet de células estromales de ratón tumoral humano en cinco mililitros de tampón PB.

Después de contar, recoja las células con otra centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 80 microlitros de tampón PB por uno x 10 hasta la séptima célula total. Para este paso, es importante usar un microscopio y probar a partir de la exclusión azul en lugar de un contador de células para obtener un recuento preciso de las células viables. Los contadores de células presentan con frecuencia problemas en el manejo de muestras heterogéneas después de la disociación de tejidos.

A continuación, mezcle 20 microlitros de reactivo de marcado magnético para células de ratón en la suspensión celular e incube las células durante 15 minutos en un refrigerador. Mientras se etiquetan las celdas, coloque una columna LS en un imán adecuado y enjuague la columna con tres mililitros de tampón PB. Al final de la incubación, agregue 420 microlitros de tampón para elevar el volumen total de la muestra a 500 microlitros, ahorrando una alícuota de 50 microlitros a dos a ocho grados Celsius para el análisis molecular o citométrico de flujo posterior.

A continuación, añada las células a la columna con un colador de malla equilibrado de 70 micras. Recoja el flujo de celda objetivo sin etiquetar. Luego, tan pronto como el depósito esté vacío, lave la columna dos veces con un mililitro de tampón recogiendo el eluyente en el mismo tubo que la fracción de celda negativa.

Para recoger las células de ratón unidas a perlas magnéticas, transfiera la columna a un nuevo tubo cónico y sumerja tres mililitros de tampón a través de la columna. El uso de la novedosa combinación de anticuerpos anti-ratón es significativamente más eficiente para una detección más completa de células de ratón en tejidos diana para xenotrasplantes que el marcaje combinado de CD45 y MHC de clase uno. De hecho, la utilización de esta novedosa combinación de anticuerpos para la clasificación magnética de células facilita el aislamiento de las células tumorales humanas independientemente del tipo de tumor.

Además del agotamiento de las células de ratón, los residuos también se eliminan durante la separación de las células magnéticas. A continuación, se pueden cultivar las células tumorales humanas libres de ratones, lo que da lugar a la generación de cultivos de células tumorales humanas puras. La extirpación de células de ratón antes de realizar la secuenciación del exoma completo en muestras tumorales xenografías no solo aumenta significativamente la cantidad total de lecturas, sino que también reduce considerablemente el número de lecturas derivadas del huésped asignadas al genoma de referencia humano y el número de polimorfismos de un solo nucleótido falsamente predichos.

Sin embargo, la eliminación in silico de lecturas derivadas de ratones por métodos bioinformáticos no puede reemplazar completamente el procedimiento experimental, ya que no es posible una asignación inequívoca basada en secuencias a la especie de origen para todas las lecturas. Como se muestra aquí para el número de SNPs predichos, el procedimiento in silico no puede corregir la calidad mejorada y la concomitante mayor cobertura de lectura de las muestras agotadas in vitro. Una vez dominado, todo el procedimiento, incluida la preparación del tumor, la disociación, el recuento y la separación magnética, se puede completar en dos horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante preparar la muestra de tejido adecuadamente para la disociación, no utilizar enzimas agresivas y asegurarse de obtener un recuento celular preciso. Siguiendo este procedimiento, las células tumorales humanas purificadas se pueden utilizar para cualquier tipo de análisis posterior, cultivo o incluso clasificación posterior de células magnéticas o basadas en flujo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran células madre tumorales y cancerosas humanas a partir de xenoinjertos pacientes y semidirectos sin ningún sesgo de las células de ratón.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de lo rápido y fácil que es mejorar sus ensayos posteriores trabajando con poblaciones puras de células objetivo.