Name: La Asamblea y la Aplicación de Shear Anillos: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a construir anillos de cizallamiento para estudiar células endoteliales bajo flujo periódico unidireccional. Este método económico y sencillo permite evaluar respuestas celulares en grandes áreas de cultivo.

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Los autores desean agradecer la asistencia del Sr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter y el enlace personalizado Shreveport, SMART, y programas de formación biostart, así como el departamento de Centenary College of Louisiana de Biofísica, Shreveport, LA.

1. Construcción de 150 mm de diámetro de los anillos de corte (Figura 1) NOTA: anillos de cizallamiento se pueden construir para crear muchas dimensiones diferentes, variando los tamaños de plato exterior e interior de Petri, resultando en dispositivos con diferentes áreas superficiales totales, los rendimientos celulares y desarrollado gamas de fuerzas de cizallamiento. Este informe describe un plato de 150 mm combinado con una placa de 100 mm interno para una superficie total de 98 cm2 (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> Figura 1. conjunto de anillo de cizallamiento. La parte superior de la figura muestra un anillo de corte parcialmente montado. Inyectar 0,5 ml de cloruro de metileno a través del agujero 3 mm con una pipeta de transferencia si un sello hermético no ha completamente formado entre los platos de interior y exterior. El anillo de corte es sellada mediante la aplicación de un cordón grueso de 1 mm de adhesivo de caucho de silicona en el interior edge de la parte superior del anillo de corte. La parte inferior de la figura muestra el anillo de corte montado. El azul representa el área de las células endoteliales plateados. Las flechas rojas indican exterior e interior del movimiento orbital del anillo de corte y los medios de comunicación en el interior del anillo de corte cuando se coloca en un agitador orbital. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> Figura 2. Las mediciones de superficies para un anillo de corte 150 mm (no está dibujado a escala). El panel superior muestra el desplazamiento centrífuga del fluido hacia el anillo exterior en respuesta a la rotación orbital. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Crear una plantilla de construcción de anillo de corte mediante la generación de unaperfil de borde exterior 150 mm en el software de presentación con un diámetro interno de 100 mm colocada en el centro del círculo 150 mm. Imprimir la plantilla sobre una hoja de papel blanco A4. </li><li> Pipetear 10 ml de cloruro de metileno (diclorometano) en un plato de vidrio de 150 mm de Petri. Es crítico que el plato es de cristal y no de poliestireno (u otro plástico de vinilo), como cloruro de metileno solubiliza mayoría de los plásticos y se utiliza aquí para unirse a los componentes de plástico. PRECAUCIÓN: Use guantes para todas las construcciones con campana de ventilación adecuada. El cloruro de metileno es un irritante de contacto y es hepatotóxico. </li><li> Alinear un plato de 150 mm de Petri de plástico en la plantilla de cizalla anular exterior. </li><li> Perforar un agujero de 3 mm en el centro de un plato de 100 mm utilizando una herramienta rotativa. Quitar cualesquiera virutas de plástico producidos a partir de la perforación. </li><li> Mientras sostiene con una mano enguantada, invertir y sumergir el borde superior de la placa de Petri de 100 mm de la etapa anterior en la piscina de cloruro de metileno durante aproximadamente 3 seg. </li><li> Transfer la &quot;humedecida&quot; 100 mm plato de borde hacia abajo en el centro de un plato de 150 mm, alineando cuidadosamente el plato 100 mm en la plantilla marcada. El cloruro de metileno se fundir el plástico, uniéndose a los platos de 100 mm y 150 mm. girar suavemente el 100 mm placa de las agujas del reloj y en sentido contrario varias veces para asegurar una buena adhesión a la placa de 150 mm. NOTA: Tenga mucho cuidado para asegurar una alineación correcta de la antena interior al centro de la placa exterior. alineación excéntrica puede dar lugar a variaciones de la tensión de corte en diferentes ubicaciones en el anillo de corte. Tener cuidado de no permitir que el cloruro de metileno a gotear accidentalmente sobre la parte de pista exterior de la placa de Petri de 150 mm durante la colocación de la placa de 100 mm. Esto fundir el plástico en la superficie inferior donde las células se crecen, creando una superficie irregular que puede causar perturbaciones del flujo. </li><li> Una vez que el cloruro de metileno se haya secado, voltear los platos de Petri recién unidas sobre e inspeccione cuidadosamente los puntos de contacto para asegurar queun sello hermético que se ha formado entre las dos placas de Petri. </li><li> Si un sello hermético no se ha formado completamente, inyectar 0,5 ml de cloruro de metileno a través del agujero 3 mm con una pipeta de transferencia. Recoger el plato y gire suavemente para permitir que el cloruro de metileno, para llegar a la orilla. NOTA: Si gira demasiado rápido, el cloruro de metileno puede derramarse en la parte exterior del plato 150 mm, la deformación de la superficie en la que crecen las células y arruinar el anillo de corte. Las fugas en los anillos de corte deben ser desechados. </li><li> Sellar el agujero en la placa de 100 mm mediante la aplicación de un 3 mm capa de sellador de caucho de silicona. </li><li> El uso de una herramienta rotativa equipada con un cabezal de corte plana, cortar la parte superior de 3 cm de un tubo de cultivo de tejidos de poliestireno cónico de 15 ml, dejando al menos 1 cm del tubo por debajo de la tapa. Pulir el borde del tubo de corte hasta que quede suave y plana con el lado plano de la cabeza de corte. Quitar cualesquiera virutas de plástico producidos por molienda. </li><li> Rastrear el punto de corte de 15 ml tubo cónico en eltapa de la placa 150 mm con un marcador, de aproximadamente 0,5 cm de distancia del borde del plato. Perforar un agujero en el interior del círculo dibujado, dejando un margen de aproximadamente 1-2 mm del borde del círculo. </li><li> Coloque la parte superior del tubo cónico de corte sobre el agujero perforado. Usando una pipeta de transferencia, se aplican aproximadamente 250 l de cloruro de metileno a los bordes cortados del tubo cónico para unir el tubo cónico a la tapa de 150 mm. </li><li> Sellar el 150 mm tapa sobre el plato de 150 mm mediante la aplicación de un cordón grueso 1 mm de sellador de caucho de silicona alrededor del borde interior de la parte superior plato Petri. </li></ol> 2. Esterilización de los anillos de cizallamiento <ol><li> Pipet aproximadamente 10 ml de solución salina tamponada con fosfato en el anillo de corte recién formada a través del puerto de tubo cónico de 15 ml. Girando en torno a eliminar cualquier residuo en el interior del anillo de corte. Retire el PBS con un aspirador de pipeta / vacío Pasteur. </li><li> Repita el paso anterior hasta que se retire escombros. </li><li> para Sterilize el anillo de corte, utilice una combinación de un enjuague de etanol 70% con irradiación UV. <ol><li> Desenroscar la tapa ventilada, pipeta de aproximadamente 10 ml de etanol al 70% a través del puerto de acceso, y el tornillo de la tapa. Rotar y voltear sobre el anillo de cizallamiento varias veces, lo que garantiza que el interior del anillo de corte se lava a fondo. </li><li> Bajo una campana extractora, aspirar el exceso de etanol al 70%. Con una botella de spray, rocíe completamente el orificio de la tapa y el acceso con un 70% de etanol. </li><li> Coloque el anillo de corte y la tapa bajo radiación UV dentro de la campana de cultivo de tejidos hasta que esté completamente seco. </li></ol></li><li> Una vez seco, el tornillo de la tapa en las tiendas y esterilizada anillos de cizallamiento a temperatura ambiente hasta su utilización en el enchapado de cultivo celular. </li></ol> 3. Shear Estudios sobre el Estrés <ol><li> Placa de las células endoteliales en los anillos de cizallamiento esterilizados siguiendo el protocolo estándar de cultivo celular usando típicamente una relación 1: 4 de división para las líneas de células endoteliales transformadas. NOTA: microV retinal RatSe obtuvieron células endoteliales ascular comercialmente. Se proporcionaron las células endoteliales de cerebro humano (hCMEC / D3) las células como un generoso regalo del Dr. Pierre-Oliver Couraud (INSERM, Francia) y se cultivaron en medio basal endotelial completa (MBE). </li><li> Permitir a las culturas alcanzan la confluencia antes del inicio de los estudios de flujo. Usar 30 ml de medios de cultivo de tejido (suero de ternero fetal al 10%, medio de Eagle modificado de Dulbecco con 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina). Cambiar medio de cultivo celular cada 3 días y mantener las células a 37 ° C con 7,5% de CO2 y aire de la habitación 92,5%. </li><li> Coloque el agitador orbital en la incubadora. Nota: Agitadores orbitales son típicamente pesada (&gt; 10 kg). Coloque el agitador orbital en el estante inferior de la incubadora para minimizar el estrés estante y vibraciones. </li><li> Coloque los anillos de corte experimental en el agitador orbital. Coloque los anillos de grupo de control de cizalladura tanto estáticos dentro de la misma incubadora. </li><li> Estimar el esfuerzo cortante máximo en el shanillo de oído con la ecuación <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" /> dónde <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> es el radio de rotación para el agitador orbital (en cm), <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> es la viscosidad del medio (en poise), <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> es la densidad del medio (en g / ml), y <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> es la frecuencia de rotación (en rotación / sec) 24. </li><li> Iniciar la configuración de rotación en el agitador orbital a la rpm deseado (por ejemplo, 90 rpm), dejando a los anillos de cizallamiento en el agitador durante la duración deseada de la aplicación de tensión de cizallamiento (por ejemplo, 72 h). NOTA: Agitadores orbitales pueden producir calor, por lo que la temperatura de la incubadora se debe supervisar para asegurar inicialmente 37 ° C se mantiene durante toda la duración del experimento. Alternativamente, sanillos HEAR pueden ser transferidas en cámaras ambientales (por ejemplo, cámara de la incubadora modular) y luego se colocan dentro de un incubador giratorio. </li><li> Después de capas de células han sido expuestas a la cizalla para el período de tiempo deseado, quitar los anillos de corte de la incubadora. Retirar la tapa anillo de corte y recuperar las células y / o medios para el examen de los análisis de punto final deseado (por ejemplo, transferencia Western, activado por fluorescencia la clasificación de células, etc.) 25. </li></ol>

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J. Winny Yun tiene una beca de investigación de la fundación Annette Funicello. J. Steven Alexander cuenta con el apoyo de investigadores del Departamento de Neurología, LSUHSC-S.

La construcción del sistema de anillo de corte para la exposición de células endoteliales a la cizalla es un método simple para la realización de estudios de estrés de cizallamiento. Sin embargo, hay algunos pasos que son críticos para la obtención de los anillos de corte superiores y mejores resultados. Un sello completo debe hacerse entre el anillo interior y exterior para evitar que el material de filtración que podría crear tensión de corte varía entre las distintas muestras. Si un sello completo no se hace, una can...

Tensión de cizallamiento de fluido se ha demostrado que modulan programas de genes endoteliales 1-5 través de la activación de los elementos reguladores cis-6, la actividad histona acetiltransferasa 7 y elementos de respuesta a la tensión de cizallamiento (SSRE) 8. Cizallamiento influencias de estrés contribuciones endoteliales hacia la coagulación mediante la modulación del factor tisular 9 y activador del plasminógeno tisular (tPA) 10 expresión. Esfuerzo de corte también influye en el control de la angiogénesis 11 y el remodelado vascular mediante la regulación de la síntesis de PDGF-B y la capacidad de respuesta 8. El derivado del endotelio mediadores vasoactivos adrenomedulina, la endotelina-1, urotensina II y relaxina también están regulados por cizallamiento 12. La transcripción de la producción de óxido nítrico sintasa endotelial y la producción de óxido nítrico son ambos dependientes de cizallamiento 10. Shear también controla endoteliales ICAM-1 de expresión 13. Flujo inducido por esfuerzo de corte, por tanto, puede powerfuinfluir LLY una gran variedad de respuestas endoteliales. Es importante destacar que, pulsaciones vasculares ahora también parecen jugar un papel importante en la fisiopatología de tanto el envejecimiento vascular normal y formas de demencia vascular 14 y pueden incluso contribuir a otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la esclerosis múltiple 15. Venosa y las células endoteliales arteriales son inherentemente expuestos a diversos patrones de flujo hemodinámicos in vivo, y muchos diferentes fenotipos de células endoteliales pueden ser exhibidos 16. Dependiendo de la magnitud y la periodicidad de flujo, los efectos sobre las células endoteliales pueden incluir la activación de células inflamatorias y la apoptosis, lo que puede reflejar los cambios en el gen o proteína de expresión 17,18. Los estudios sobre las respuestas de células endoteliales a cizalla fenómenos por lo tanto permanecen complicados por las dificultades en la producción de modelos in vitro que producen adecuadamente tales patrones de corte. Muchos EXPERIME diferenteprotocolos NTAL se han desarrollado para aplicar la tensión de cizallamiento de fluido a monocapas de células endoteliales. Uno de los sistemas más utilizados es la cámara de flujo de placas paralelas, lo que crea un flujo laminar uniforme dentro de la cámara 19 - 21. Una bomba peristáltica suele estar conectado para crear un flujo periódico, que pueden recapitular las características de flujo que se encuentran típicamente en muchos lugares en vivo 22. Otra forma común de configuración utiliza el modelo de &#39;cono y placa&#39;, donde el estrés de cizalla de fluidos está determinada por la velocidad de rotación del cono 23. Ambos sistemas, y otros arreglos similares a ellos, puede ser tedioso de instalar y requieren componentes que pueden ser relativamente caro e inaccesible para muchos laboratorios. Otra limitación importante de estos modelos actuales es el número relativamente bajo de los estudios de replicación que se pueden realizar de forma simultánea, cada uno con un área de superficie relativamente baja. Esto aumenta el tiempo y co<html> mplexity de tales enfoques. Por lo tanto, un modelo ideal que induce la cizalladura unidireccional y periódica podría ser uno donde un alto número de repeticiones de estudio se puede configurar fácilmente, cada uno con una superficie relativamente grande. Además, los modelos anteriormente mencionados requieren una configuración bastante sofisticado, que puede ser un costo prohibitivo para muchos usuarios. Un modelo que puede producir alteraciones de cizalla de fluidos utilizando materiales básicos de laboratorio puede tener varias ventajas. Un método simple y muy económica de la aplicación de la tensión de cizallamiento unidireccional, periódica consiste en la colocación de platos circulares en un agitador orbital 24. Este protocolo es muy simple y se puede escalar hasta alcanzar altos números de estudio réplicas, cada uno con un área superficial relativamente grande, según sea necesario. Sin embargo, las células situadas en el centro del plato están expuestos a diferentes patrones de flujo de las células a lo largo de la periferia, dando respuestas fenotípicas celulares mixtos en el mismo plato. _content &quot;&gt; En este informe, se describe la construcción y el uso de &#39;anillos de corte&#39;, nuestro modelo para la creación de tensión de corte unidireccional y periódica. El diseño para el anillo de corte efectiva fenotipos de cizalla inducida por celulares &#39;mixtos&#39; Limita al restringir el flujo vía dentro de una placa de cultivo circular a la periferia a través de la colocación de un anillo interior. la construcción y el funcionamiento del anillo de corte es simple y económico y se puede escalar fácilmente para acomodar una amplia gama de agitadores orbitales usando suministros de cultivo de tejidos ampliamente disponibles. Esta modelo puede ser aplicado en los experimentos de células endoteliales para proporcionar patrones de flujo unidireccional y periódicos dentro de los niveles fisiológicos y fisiopatológicos.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de plástico de 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Las placas deben ser de poliestireno</td></tr><tr><td>150 x 25 mm placa de cultivo de tejidos de plástico</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Las placas deben ser de poliestireno</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio de 150 mm Fisher</td><td></td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico para cultivo de tejidos de poliestireno de 15 ml Falcon</td><td></td><td>352099 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>sellador de caucho de silicona</td><td>DAP 7079808641</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de transferencia de 3 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>impresora</td><td></td><td></td><td></td></tr> papel <tr><td>tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>guantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>herramienta rotativa y juego</td><td>Dremel</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>cabezal de corte de herramienta rotativa</td><td>Dremel</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>cabezal</td><td></td><td></td><td></td>de perforación de herramienta rotativa</tr><tr><td>agitador orbital</td><td></td> de agua <td></td> destilada VWR 57018-754 <td></td></tr><tr><td>incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Retina de rata células endoteliales microvasculares <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biológicos celulares</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

la asamblea y la aplicación de &#39;shear anillos&#39;: a novel endotelial modelo de orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Las desviaciones de los niveles normales y los patrones de juego de cizallamiento importantes funciones de fluido vascular en la fisiología vascular y la fisiopatología de la inducción de adaptación, así como los cambios patológicos en el fenotipo endotelial y la expresión génica. En particular, los efectos de mala adaptación de, la tensión de cizallamiento inducido por el flujo unidireccional periódica puede accionar una variedad de efectos sobre varios tipos de células vasculares, en particular células endoteliales. Mientras que por ahora las células endoteliales de diversos orígenes anatómicos han sido cultivadas, los análisis en profundidad de sus respuestas a la fricción fluida se han visto obstaculizados por la relativa complejidad de los modelos de corte (por ejemplo, la cámara de flujo de placas paralelas, cono y placa de modelo de flujo). Si bien todos estos representan excelentes enfoques, tales modelos son técnicamente complicado y adolecen de inconvenientes, incluyendo el tiempo de preparación relativamente largo y complejo, las zonas superficiales bajas, los requisitos para las bombas de presurización y con frecuencia requieren sellantes y juntas, creando retos para both mantenimiento de la esterilidad y una incapacidad para ejecutar múltiples experimentos. Sin embargo, si estaban disponibles, mayor progreso en las respuestas cortantes endoteliales vasculares mayores modelos de rendimiento de flujo y corte, la investigación de cizallamiento sobre todo periódica a nivel molecular, podría ser más avanzado rápidamente. A continuación, se describe la construcción y el uso de anillos de corte: una novela, sencilla de montar, y el modelo de cultivo de tejidos de bajo costo con una superficie relativamente grande que permite fácilmente de un alto número de réplicas experimentales en, cizalla periódica estudios de estrés unidireccionales en células endoteliales.

A continuación se presentan los resultados representativos tanto de las células endoteliales del cerebro hCMEC / D3 y de rata monocapas de células endoteliales microvasculares de la retina, se cultivaron en anillos cortantes. Después de permitir que hCMEC / D3 monocapas de células endoteliales del cerebro para crecer hasta la confluencia en EBM completo, los anillos de cizallamiento se colocaron en un agitador orbital durante ...

Se conocen diferentes niveles y patrones de cizallamiento del fluido para modular la expresión génica endotelial, el fenotipo y la susceptibilidad a la enfermedad. Discutimos el ensamblaje y el uso de 'anillos de cizallamiento': un modelo que produce patrones de esfuerzo cortante unidireccionales y periódicos. Los anillos de cizallamiento son fáciles de ensamblar, económicos y pueden producir altos rendimientos de celda.

La Asamblea y la Aplicación de &#39;Shear Anillos&#39;: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

El objetivo general de este modelo es crear un método sencillo y económico para estudios de flujo periódico de fluidos y tensiones cortantes in vitro sobre células endoteliales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Fisiología de Células Endoteliales. Por ejemplo, cómo afecta el esfuerzo cortante periódico a la forma, estructura y funcionamiento de las células endoteliales.La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un dispositivo de cultivo celular ensamblado fácilmente, que proporciona áreas de superficie relativamente grandes para la evaluación de las respuestas celulares. Este procedimiento será demostrado por el Sr. Luke White, un estudiante de medicina en mi laboratorio. Comience este procedimiento utilizando un software de presentación para crear una plantilla de construcción de anillo de cizallamiento con un perfil de borde externo de 150 milímetros y un diámetro interno de 100 milímetros colocado en el centro del círculo de 150 milímetros.Imprima la plantilla en una hoja de papel blanco tamaño A4. Trabajando bajo una campana extractora con ventilación adecuada y usando guantes, pipete 10 milímetros de cloruro de metileno en un recipiente de Petri de vidrio de 150 milímetros. Es fundamental que el recipiente sea de vidrio, ya que el cloruro de metileno solubiliza la mayoría de los plásticos.Coloque un plato de Petri de plástico de 150 milímetros sobre la plantilla externa de corte. Utilice una herramienta rotativa para perforar un orificio de 3 milímetros en el centro de un plato de 100 milímetros. Retire todas las virutas de plástico producidas durante la perforación.Manteniendo el plato de Petri de 100 milímetros con una mano enguantada, inviértalo y sumerja el borde superior del plato en la solución de cloruro de metileno durante aproximadamente tres segundos. Permita que el exceso de cloruro de metileno gotee desde el plato de 100 milímetros y luego transfiera rápidamente el borde húmedo hacia abajo sobre el centro del plato de 150 milímetros. Alinee cuidadosamente el plato de 100 milímetros con la plantilla marcada.Gire suavemente la placa de 100 milímetros en sentido horario y antihorario varias veces para asegurar una buena adhesión a la placa de 150 milímetros. Una vez que el cloruro de metileno se haya secado, dé la vuelta a las placas de Petri recién unidas y examine cuidadosamente los puntos de contacto. Si no se ha formado completamente un sello hermético, inyecte 0,5 mililitros de cloruro de metileno a través del orificio de 3 milímetros con una pipeta de transferencia.Tomar el recipiente y girarlo suavemente para permitir que el cloruro de metileno alcance el borde. Después de asegurarse de que se ha formado un sello hermético entre los dos recipientes de Petri, sellar el orificio en el recipiente de 100 milímetros aplicando una gota de 3 milímetros de sellador de caucho de silicona. Utilizando una herramienta rotatoria equipada con una cabeza de corte plana, cortar la porción superior de 3 centímetros de un tubo de cultivo celular de poliestireno conocónico de 15 milímetros, dejando al menos un centímetro del tubo debajo de la tapa.Utilice el lado plano de la cabeza de corte para pulir el borde del tubo cortado hasta que quede liso y plano. Retire todas las virutas de plástico producidas por el lijado. Con un marcador, trace el contorno del tubo cónico de 15 mililitros sobre la tapa de la placa de 150 milímetros, aproximadamente a 0,5 centímetros del borde de la placa.Perfore un agujero dentro del círculo dibujado, dejando un margen de aproximadamente uno a dos milímetros desde el borde del círculo. Coloque la parte superior cortada del tubo cónico sobre el agujero perforado. Utilizando una pipeta de transferencia, agregue aproximadamente un cuarto de mililitro, o 250 microlitros de cloruro de metileno sobre los bordes cortados del tubo cónico para adherirlo a la tapa de 150 milímetros.Finalmente, selle la tapa de 150 milímetros al recipiente de 150 milímetros aplicando un cordón de un milímetro de espesor de sellador de caucho de silicona alrededor del borde interno del plato de Petri superior. Se muestra un esquema de un anillo de sello ensamblado. El color azul representa el área de células endoteliales sembradas.Las flechas rojas exterior e interior indican el movimiento orbital del anillo de cizallamiento y del medio dentro del anillo de cizallamiento cuando se coloca en un agitador orbital. Prepárese para la esterilización pipeteando aproximadamente 10 milímetros de PBS dentro del anillo de cizallamiento recién formado, a través del puerto del tubo cónico de 15 mililitros. Agite suavemente para eliminar cualquier residuo dentro del anillo de cizallamiento.Retire el PBS con una pipeta de Pasteur y un aspirador al vacío. Repita el lavado con PBS hasta que se elimine todo el material residual. Para esterilizar el anillo de corte, se utilizará una combinación de enjuague con etanol al 70 % y exposición a irradiación UV.Saque la tapa ventilada, introduzca aproximadamente 10 mililitros de etanol al 70 % mediante pipeta a través del puerto de acceso y vuelva a colocar la tapa enroscándola. Gire y voltee el anillo de sello varias veces asegurándose de que el interior del anillo de sello quede bien lavado. Bajo una campana de cultivo celular, aspire el exceso de etanol al 70 %.Con una botella rociadora, rocíe completamente el puerto de acceso y la tapa con etanol al 70 %. A continuación, coloque el anillo de cizallamiento y la tapa bajo radiación UV en la cabina de cultivo celular hasta que estén completamente secos. Una vez que el anillo de cizallamiento esté seco, vuelva a colocar la tapa enroscándola.Almacene los anillos de corte esterilizados a temperatura ambiente hasta que se utilicen en el cultivo celular. Para prepararse para un estudio de estrés cortante, primero siembre células endoteliales en los anillos de corte esterilizados siguiendo el protocolo estándar de cultivo celular. Permita que el cultivo alcance la confluencia antes de iniciar los estudios de flujo.Cuando las células hayan alcanzado la confluencia, coloque los anillos de corte experimentales en una plataforma agitadora orbital que esté ubicada en el estante inferior del incubador, para minimizar el estrés y las vibraciones del estante. Coloque los anillos de corte del grupo de control estático dentro del mismo incubador. Deje los anillos de corte en la plataforma agitadora durante la duración deseada de la aplicación del estrés de corte.Después de que las capas celulares hayan estado expuestas al esfuerzo cortante durante el tiempo deseado, retire los anillos de esfuerzo cortante del incubador. Retire la tapa del anillo de esfuerzo cortante y recupere las células y/o el medio para el análisis final deseado. Tenga en cuenta que, tras abrir los anillos de esfuerzo cortante, los investigadores pueden recolectar células y medio para su análisis utilizando varios métodos.Se muestran resultados representativos del aspecto de monocapas de células endoteliales cerebrales humanas CMEC D3 en anillos de cizallamiento tras 48 horas de exposición a flujo laminar periódico o condición estática. Se observó que la alineación del cultivo no siempre es paralela a la dirección del flujo indicada por las flechas. Se muestran algunas respuestas al cizallamiento periódico en monocapas de células endoteliales microvasculares retinianas de rata. Tras 72 horas de cizallamiento fluido periódico en anillos de cizallamiento, se produjo una reducción significativa de la molécula de adhesión célula plaquetaria-endotelial en relación con el control de carga Beta-actina.Una vez dominado, se pueden construir varios anillos de corte en aproximadamente tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar alinear cuidadosamente el plato interno con el plato externo, y que se forme un sello hermético entre ellos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir y utilizar anillos de corte como un método sencillo para realizar estudios in vitro de flujo periódico de fluidos y tensiones cortantes en células endoteliales. No olvide que trabajar con cloruro de metileno puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar bajo una campana extractora, durante los pasos que lo requieran.

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Investigación

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Biología

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La Asamblea y la Aplicación de Shear Anillos: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento (Video) | JoVE Journal

La Asamblea y la Aplicación de 'Shear Anillos': A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

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