La Asamblea y la Aplicación de 'Shear Anillos': A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento
31 de octubre de 2016
Se conocen diferentes niveles y patrones de cizallamiento del fluido para modular la expresión génica endotelial, el fenotipo y la susceptibilidad a la enfermedad. Discutimos el ensamblaje y el uso de 'anillos de cizallamiento': un modelo que produce patrones de esfuerzo cortante unidireccionales y periódicos. Los anillos de cizallamiento son fáciles de ensamblar, económicos y pueden producir altos rendimientos de celda.
El objetivo general de este modelo es crear un método sencillo y económico para estudios de flujo periódico de fluidos y tensiones cortantes in vitro sobre células endoteliales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Fisiología de Células Endoteliales. Por ejemplo, cómo afecta el esfuerzo cortante periódico a la forma, estructura y funcionamiento de las células endoteliales.
La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un dispositivo de cultivo celular ensamblado fácilmente, que proporciona áreas de superficie relativamente grandes para la evaluación de las respuestas celulares. Este procedimiento será demostrado por el Sr. Luke White, un estudiante de medicina en mi laboratorio. Comience este procedimiento utilizando un software de presentación para crear una plantilla de construcción de anillo de cizallamiento con un perfil de borde externo de 150 milímetros y un diámetro interno de 100 milímetros colocado en el centro del círculo de 150 milímetros.
Imprima la plantilla en una hoja de papel blanco tamaño A4. Trabajando bajo una campana extractora con ventilación adecuada y usando guantes, pipete 10 milímetros de cloruro de metileno en un recipiente de Petri de vidrio de 150 milímetros. Es fundamental que el recipiente sea de vidrio, ya que el cloruro de metileno solubiliza la mayoría de los plásticos.
Coloque un plato de Petri de plástico de 150 milímetros sobre la plantilla externa de corte. Utilice una herramienta rotativa para perforar un orificio de 3 milímetros en el centro de un plato de 100 milímetros. Retire todas las virutas de plástico producidas durante la perforación.
Manteniendo el plato de Petri de 100 milímetros con una mano enguantada, inviértalo y sumerja el borde superior del plato en la solución de cloruro de metileno durante aproximadamente tres segundos. Permita que el exceso de cloruro de metileno gotee desde el plato de 100 milímetros y luego transfiera rápidamente el borde húmedo hacia abajo sobre el centro del plato de 150 milímetros. Alinee cuidadosamente el plato de 100 milímetros con la plantilla marcada.
Gire suavemente la placa de 100 milímetros en sentido horario y antihorario varias veces para asegurar una buena adhesión a la placa de 150 milímetros. Una vez que el cloruro de metileno se haya secado, dé la vuelta a las placas de Petri recién unidas y examine cuidadosamente los puntos de contacto. Si no se ha formado completamente un sello hermético, inyecte 0,5 mililitros de cloruro de metileno a través del orificio de 3 milímetros con una pipeta de transferencia.
Tomar el recipiente y girarlo suavemente para permitir que el cloruro de metileno alcance el borde. Después de asegurarse de que se ha formado un sello hermético entre los dos recipientes de Petri, sellar el orificio en el recipiente de 100 milímetros aplicando una gota de 3 milímetros de sellador de caucho de silicona. Utilizando una herramienta rotatoria equipada con una cabeza de corte plana, cortar la porción superior de 3 centímetros de un tubo de cultivo celular de poliestireno conocónico de 15 milímetros, dejando al menos un centímetro del tubo debajo de la tapa.
Utilice el lado plano de la cabeza de corte para pulir el borde del tubo cortado hasta que quede liso y plano. Retire todas las virutas de plástico producidas por el lijado. Con un marcador, trace el contorno del tubo cónico de 15 mililitros sobre la tapa de la placa de 150 milímetros, aproximadamente a 0,5 centímetros del borde de la placa.
Perfore un agujero dentro del círculo dibujado, dejando un margen de aproximadamente uno a dos milímetros desde el borde del círculo. Coloque la parte superior cortada del tubo cónico sobre el agujero perforado. Utilizando una pipeta de transferencia, agregue aproximadamente un cuarto de mililitro, o 250 microlitros de cloruro de metileno sobre los bordes cortados del tubo cónico para adherirlo a la tapa de 150 milímetros.
Finalmente, selle la tapa de 150 milímetros al recipiente de 150 milímetros aplicando un cordón de un milímetro de espesor de sellador de caucho de silicona alrededor del borde interno del plato de Petri superior. Se muestra un esquema de un anillo de sello ensamblado. El color azul representa el área de células endoteliales sembradas.
Las flechas rojas exterior e interior indican el movimiento orbital del anillo de cizallamiento y del medio dentro del anillo de cizallamiento cuando se coloca en un agitador orbital. Prepárese para la esterilización pipeteando aproximadamente 10 milímetros de PBS dentro del anillo de cizallamiento recién formado, a través del puerto del tubo cónico de 15 mililitros. Agite suavemente para eliminar cualquier residuo dentro del anillo de cizallamiento.
Retire el PBS con una pipeta de Pasteur y un aspirador al vacío. Repita el lavado con PBS hasta que se elimine todo el material residual. Para esterilizar el anillo de corte, se utilizará una combinación de enjuague con etanol al 70 % y exposición a irradiación UV.
Saque la tapa ventilada, introduzca aproximadamente 10 mililitros de etanol al 70 % mediante pipeta a través del puerto de acceso y vuelva a colocar la tapa enroscándola. Gire y voltee el anillo de sello varias veces asegurándose de que el interior del anillo de sello quede bien lavado. Bajo una campana de cultivo celular, aspire el exceso de etanol al 70 %.
Con una botella rociadora, rocíe completamente el puerto de acceso y la tapa con etanol al 70 %. A continuación, coloque el anillo de cizallamiento y la tapa bajo radiación UV en la cabina de cultivo celular hasta que estén completamente secos. Una vez que el anillo de cizallamiento esté seco, vuelva a colocar la tapa enroscándola.
Almacene los anillos de corte esterilizados a temperatura ambiente hasta que se utilicen en el cultivo celular. Para prepararse para un estudio de estrés cortante, primero siembre células endoteliales en los anillos de corte esterilizados siguiendo el protocolo estándar de cultivo celular. Permita que el cultivo alcance la confluencia antes de iniciar los estudios de flujo.
Cuando las células hayan alcanzado la confluencia, coloque los anillos de corte experimentales en una plataforma agitadora orbital que esté ubicada en el estante inferior del incubador, para minimizar el estrés y las vibraciones del estante. Coloque los anillos de corte del grupo de control estático dentro del mismo incubador. Deje los anillos de corte en la plataforma agitadora durante la duración deseada de la aplicación del estrés de corte.
Después de que las capas celulares hayan estado expuestas al esfuerzo cortante durante el tiempo deseado, retire los anillos de esfuerzo cortante del incubador. Retire la tapa del anillo de esfuerzo cortante y recupere las células y/o el medio para el análisis final deseado. Tenga en cuenta que, tras abrir los anillos de esfuerzo cortante, los investigadores pueden recolectar células y medio para su análisis utilizando varios métodos.
Se muestran resultados representativos del aspecto de monocapas de células endoteliales cerebrales humanas CMEC D3 en anillos de cizallamiento tras 48 horas de exposición a flujo laminar periódico o condición estática. Se observó que la alineación del cultivo no siempre es paralela a la dirección del flujo indicada por las flechas. Se muestran algunas respuestas al cizallamiento periódico en monocapas de células endoteliales microvasculares retinianas de rata. Tras 72 horas de cizallamiento fluido periódico en anillos de cizallamiento, se produjo una reducción significativa de la molécula de adhesión célula plaquetaria-endotelial en relación con el control de carga Beta-actina.
Una vez dominado, se pueden construir varios anillos de corte en aproximadamente tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar alinear cuidadosamente el plato interno con el plato externo, y que se forme un sello hermético entre ellos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir y utilizar anillos de corte como un método sencillo para realizar estudios in vitro de flujo periódico de fluidos y tensiones cortantes en células endoteliales. No olvide que trabajar con cloruro de metileno puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar bajo una campana extractora, durante los pasos que lo requieran.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo presenta un modelo conocido como "anillos de cizallamiento" que genera patrones periódicos de tensión de cizallamiento unidireccional para estudiar las células endoteliales. El método es sencillo, económico y produce un alto número de células, facilitando la investigación en la fisiología de las células endoteliales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Fisiología de la Célula Endotelial
- Esforzo Cortante del Fluido
- Modelos In Vitro
Antecedentes
- El estrés cortante del fluido influye en la expresión génica endotelial y en la susceptibilidad a enfermedades.
- Comprender los efectos del estrés cortante es fundamental para la biología vascular.
- Los métodos actuales pueden carecer de eficiencia o complejidad.
- Los anillos de cizalladura proporcionan un enfoque novedoso para estudiar estos efectos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rentable para estudiar el flujo periódico de fluidos.
- Investigar cómo el esfuerzo cortante periódico afecta la morfología y función de las células endoteliales.
- Mejorar la comprensión de las respuestas endoteliales a los estímulos mecánicos.
Métodos Utilizados
- Ensamblaje de una plantilla de construcción de anillo de cizalladura.
- Uso de un dispositivo de cultivo celular para la evaluación de áreas superficiales grandes.
- Aplicación de flujo periódico de fluidos a células endoteliales.
- Realización del procedimiento por un estudiante de medicina.
Resultados principales
- Los anillos de cizallamiento producen eficazmente patrones controlados de tensión de cizallamiento.
- El método permite la evaluación significativa de la respuesta celular.
- Es posible obtener altos rendimientos celulares con esta técnica.
- El cizallamiento periódico influye en la forma y función de las células endoteliales.
Conclusiones
- Los anillos de cizallamiento son una herramienta valiosa para la investigación endotelial.
- Este modelo puede avanzar en la comprensión de la fisiología endotelial.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las respuestas de las células endoteliales al estrés cortante periódico son fundamentales para comprender la fisiopatología vascular y para identificar dianas terapéuticas sensibles a estímulos mecánicos. El modelo de anillo de cizalladura proporciona un sistema in vitro escalable y reproducible que permite la evaluación de alto rendimiento de fenotipos endoteliales bajo condiciones hemodinámicas controladas. Esto apoya la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en programas de descubrimiento cardiovascular al vincular la dinámica del flujo de fluidos con lecturas moleculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de mecanotransducción endotelial bajo patrones fisiológicos de esfuerzo cortante.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas sensibles al esfuerzo cortante mediante fenotipos cuantificables de adhesión y alineación.
- Valor predictivo: Facilita la selección fenotípica de compuestos que modulan las respuestas endoteliales al flujo periódico.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Proporciona una plataforma estandarizada con gran área superficial para la formación consistente de monocapas endoteliales.
- Escalabilidad: Permite la generación de múltiples réplicas para estudios de respuesta a la dosis y de evolución temporal bajo cizallamiento orbital.
- Resultado cuantitativo: Permite medir cambios dependientes del esfuerzo cortante en la expresión de moléculas de adhesión plaquetaria-endotelial como lectura funcional.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela condiciones de esfuerzo cortante fisiopatológicas implicadas en la inflamación vascular y la trombosis.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos in vitro con la disfunción endotelial in vivo mediante biomarcadores medibles como la disminución de PECAM-1.
- Reducción mecanicista de riesgos: Ayuda a priorizar objetivos al establecer vínculos causales entre los patrones de estrés cortante y los cambios en el fenotipo endotelial.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo del anillo de corte se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la identificación de dianas guiada por hipótesis y la validación preclínica de terapéuticas vasculares mediante la provisión de un estímulo mecánico fisiológicamente relevante.
- Biología del descubrimiento: Permite probar hipótesis sobre vías sensibles al esfuerzo cortante en la fisiología endotelial mediante flujo periódico controlado.
- Selección: Proporciona puntos finales cuantitativos y reproducibles de adhesión y morfología adecuados para la evaluación de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Genera lecturas normalizadas (por ejemplo, relaciones de PECAM-1 a beta-actina) que permiten la comparación entre diferentes condiciones y la selección de resultados positivos.
- Investigación traslacional: Facilita el avance alineado con biomarcadores mediante la modelización de patrones de esfuerzo cortante asociados a la activación o disfunción endotelial.
- Reutilización empresarial: Representa un sistema de bajo costo y modular, adaptable entre subtipos endoteliales y equipos de proyectos, para un uso sostenido en programas de mecanobiología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las respuestas endoteliales a las fuerzas hemodinámicas mediante perfiles definidos y periódicos de esfuerzo cortante.
- Valor operativo: Asegura la estandarización del ensayo y el mantenimiento de la esterilidad mediante un ensamblaje sencillo y un contenedor de fluido sellado con silicona.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar una visión temprana de la vulnerabilidad hemodinámica de los objetivos vasculares.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de vías sensibles a la mecánica basada en resultados fenotípicos dependientes del esfuerzo cortante.
Consideraciones de Implementación
- Requiere técnica aséptica y familiaridad con la unión basada en disolventes utilizando cloruro de metileno bajo campana extractora.
- Depende del acceso a agitadores orbitales compatibles con entornos de incubadora para la aplicación prolongada de esfuerzo cortante.
- Necesita la normalización del siembra celular y la evaluación de la confluencia para garantizar una exposición reproducible al esfuerzo cortante.
- Implica consideraciones sobre la compatibilidad de materiales, ya que el cloruro de metileno daña los plásticos y requiere sustratos de vidrio o resistentes.
- Se limita a magnitudes y frecuencias de esfuerzo cortante alcanzables mediante movimiento orbital; no es adecuado para simulaciones de flujo de alta frecuencia o turbulento.
