La Asamblea y la Aplicación de 'Shear Anillos': A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento
31 de octubre de 2016
Se conocen diferentes niveles y patrones de cizallamiento del fluido para modular la expresión génica endotelial, el fenotipo y la susceptibilidad a la enfermedad. Discutimos el ensamblaje y el uso de 'anillos de cizallamiento': un modelo que produce patrones de esfuerzo cortante unidireccionales y periódicos. Los anillos de cizallamiento son fáciles de ensamblar, económicos y pueden producir altos rendimientos de celda.
El objetivo general de este modelo es crear un método simple y económico para estudios de flujo de fluido periódico in vitro y esfuerzo cortante en células endoteliales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología de las células endoteliales. Por ejemplo, ¿cómo afecta el cizallamiento periódico a la forma, estructura y funcionamiento de las células endoteliales?
La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un dispositivo de cultivo de tejidos ensamblado de forma sencilla, que proporciona superficies relativamente grandes para la evaluación de las respuestas celulares. Demostrando este procedimiento, estará el Sr. Luke White, un estudiante de medicina en mi laboratorio. Comience este procedimiento utilizando el software de presentación para crear una plantilla de construcción de anillo de cizalla con un perfil de borde exterior de 150 milímetros y un diámetro interno de 100 milímetros colocado en el centro del círculo de 150 milímetros.
Imprime la plantilla en una hoja de papel blanco A4. Trabajando bajo una campana extractora con ventilación adecuada y usando guantes, pipetee cloruro de metileno de 10 milímetros en una placa de Petri de vidrio de 150 milímetros. Es fundamental que el plato sea de vidrio, ya que el cloruro de metileno solubiliza la mayoría de los plásticos.
Alinee una placa de Petri de plástico de 150 milímetros en la plantilla de corte exterior. Use una herramienta rotativa para perforar un agujero de tres 3 milímetros en el centro de un plato de 100 milímetros. Retire las virutas de plástico producidas por la perforación.
Mientras sostiene la placa de Petri de 100 milímetros con una mano enguantada, invierta y sumerja el borde superior de la placa en el charco de cloruro de metileno durante aproximadamente tres segundos. Permita que el exceso de cloruro de metileno gotee del plato de 100 milímetros y luego transfiera rápidamente el borde del plato mojado hacia el centro del plato de 150 milímetros. Alineando cuidadosamente el plato de 100 milímetros sobre la plantilla marcada.
Gire suavemente el plato de 100 milímetros en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj varias veces para garantizar una buena adherencia al plato de 150 milímetros. Una vez que el cloruro de metileno se haya secado, voltee las placas de Petri recién unidas e inspeccione cuidadosamente los puntos de contacto. Si no se ha formado un sello hermético, inyecte 0,5 mililitros de cloruro de metileno a través del orificio de 3 milímetros con una pipeta de transferencia.
Levante el plato y gírelo suavemente para permitir que el cloruro de metileno llegue al borde. Después de asegurarse de que se ha formado un sello hermético entre las dos placas de Petri, selle el orificio en la placa de 100 milímetros aplicando una gota de 3 milímetros de sellador de caucho de silicona. Con una herramienta rotativa equipada con un cabezal de corte plano, corte la porción superior de 3 centímetros de un tubo de cultivo de tejidos de poliestireno conocole de 15 milímetros, dejando al menos un centímetro del tubo por debajo de la tapa.
Use el lado plano del cabezal de corte para pulir el borde del tubo cortado hasta que quede liso y plano. Retire las virutas de plástico producidas por la molienda. Con un marcador, trace el tubo de concola de 15 mililitros cortado en la tapa del plato de 150 milímetros aproximadamente a 0,5 centímetros del borde del plato.
Perfora un agujero dentro del círculo dibujado, dejando un margen de aproximadamente uno a dos milímetros desde el borde del círculo. Coloque la parte superior del tubo de conocole cortado sobre el orificio perforado. Con una pitette de transferencia, aplique aproximadamente un cuarto de mililitro o 250 microlitros de cloruro de metileno en los bordes cortados del tubo de conocole para unir el tubo de conocole a la tapa de 150 milímetros.
Finalmente, selle la tapa de 150 milímetros en el plato de 150 milímetros aplicando una gota de sellador de caucho de silicona de un milímetro de grosor alrededor del borde interior de la placa de Petri superior. Se muestra un esquema de un anillo de sellado ensamblado. El azul representa el área de las células endoteliales plateadas.
Las flechas rojas exterior e interior indican el movimiento orbital del anillo de cizallamiento y los medios dentro del anillo de cizallamiento cuando se colocan en un agitador orbital. Prepárese para la esterilización pipeteando aproximadamente 10 milímetros de PBS en el anillo de cizallamiento recién formado, a través del puerto del tubo de conocola de 15 mililitros. Gire para eliminar cualquier residuo dentro del anillo de cizalla.
Retire el PBS con una pipeta Pasteur y un aspirador de vacío. Repita el lavado con PBS hasta que se eliminen todos los residuos. Para esterilizar el anillo de cizalla, se utilizará una combinación de un enjuague con etanol al 70% e irradiación UV.
Desenrosque el tapón ventilado, pipetee aproximadamente 10 mililitros de etanol al 70% a través del puerto de acceso y vuelva a enroscar el tapón. Gire y voltee el anillo para sellar varias veces, asegurándose de que el interior del anillo para sellar esté completamente lavado. Bajo una campana de cultivo de tejidos, aspire el exceso de etanol al 70%.
Con una botella rociadora, rocíe a fondo el puerto de acceso y la tapa con etanol al 70%. A continuación, coloque el anillo de cizallamiento y la tapa bajo la radiación UV en la campana de cultivo de tejidos hasta que esté completamente seco. Una vez que el anillo de seguridad esté seco, vuelva a enroscar la tapa.
Guarde los anillos de cizalla esterilizados a temperatura ambiente hasta que se utilicen en la siembra de cultivos celulares. Para prepararse para un estudio de esfuerzo por cizallamiento, primero coloque células endoteliales en anillos de cizallamiento esterilizados siguiendo el protocolo estándar de cultivo celular. Permitir que el cultivo alcance la confluencia antes de iniciar los estudios de flujo.
Cuando las células hayan alcanzado la confluencia, coloque los anillos de cizallamiento experimentales en un agitador orbital que se coloca en el estante inferior de la incubadora para minimizar la tensión y la vibración del estante. Coloque los anillos de cizallamiento del grupo de control estático dentro de la misma incubadora. Deje los anillos de cizallamiento en el agitador durante la duración deseada de la aplicación del esfuerzo cortante.
Después de que las capas de células se hayan expuesto al cizallamiento durante el período de tiempo deseado, retire los anillos de cizallamiento de la incubadora. Retire la tapa del anillo de cizallamiento y recupere las celdas y/o medios para el análisis de punto final deseado. Tenga en cuenta que después de abrir los anillos de cizallamiento, los investigadores pueden recolectar células y medios para su análisis utilizando varios métodos.
Se muestran resultados representativos de la aparición de mono capas de células endoteliales cerebrales CMEC D3 humanas en anillos de cizallamiento después de 48 horas de cizallamiento periódico del fluido o exposición estática, se observó que la alineación del cultivo no siempre es paralela a la dirección del flujo indicada por las flechas. Algunas respuestas al cizallamiento periódico se muestran en las monocapas de células endoteliales microvasculares de la retina de rata. 72 horas de cizallamiento periódico del fluido en los anillos de cizallamiento dieron como resultado una reducción significativa en la molécula de adhesión plaqueta-células endoteliales en relación con el control de la carga de beta-actina.
Una vez dominados, se pueden construir varios anillos de cizalla en aproximadamente tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar alinear cuidadosamente el plato interior con el plato exterior, y que se forma un sello hermético entre ellos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir y usar anillos de cizallamiento como un método simple para realizar estudios de flujo de fluido periódico in vitro y esfuerzo de cizallamiento en células endoteliales. No olvide que trabajar con cloruro de metileno puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar debajo de una campana extractora, mientras se realizan los pasos que lo requieren.
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Resumen
Este artículo presenta un modelo conocido como "anillos de cizallamiento" que genera patrones periódicos de tensión de cizallamiento unidireccional para estudiar las células endoteliales. El método es sencillo, económico y produce un alto número de células, facilitando la investigación en la fisiología de las células endoteliales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Fisiología de la Célula Endotelial
- Esforzo Cortante del Fluido
- Modelos In Vitro
Antecedentes
- El estrés cortante del fluido influye en la expresión génica endotelial y en la susceptibilidad a enfermedades.
- Comprender los efectos del estrés cortante es fundamental para la biología vascular.
- Los métodos actuales pueden carecer de eficiencia o complejidad.
- Los anillos de cizalladura proporcionan un enfoque novedoso para estudiar estos efectos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rentable para estudiar el flujo periódico de fluidos.
- Investigar cómo el esfuerzo cortante periódico afecta la morfología y función de las células endoteliales.
- Mejorar la comprensión de las respuestas endoteliales a los estímulos mecánicos.
Métodos Utilizados
- Ensamblaje de una plantilla de construcción de anillo de cizalladura.
- Uso de un dispositivo de cultivo celular para la evaluación de áreas superficiales grandes.
- Aplicación de flujo periódico de fluidos a células endoteliales.
- Realización del procedimiento por un estudiante de medicina.
Resultados principales
- Los anillos de cizallamiento producen eficazmente patrones controlados de tensión de cizallamiento.
- El método permite la evaluación significativa de la respuesta celular.
- Es posible obtener altos rendimientos celulares con esta técnica.
- El cizallamiento periódico influye en la forma y función de las células endoteliales.
Conclusiones
- Los anillos de cizallamiento son una herramienta valiosa para la investigación endotelial.
- Este modelo puede avanzar en la comprensión de la fisiología endotelial.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las respuestas de las células endoteliales al estrés cortante periódico son fundamentales para comprender la fisiopatología vascular y para identificar dianas terapéuticas sensibles a estímulos mecánicos. El modelo de anillo de cizalladura proporciona un sistema in vitro escalable y reproducible que permite la evaluación de alto rendimiento de fenotipos endoteliales bajo condiciones hemodinámicas controladas. Esto apoya la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en programas de descubrimiento cardiovascular al vincular la dinámica del flujo de fluidos con lecturas moleculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de mecanotransducción endotelial bajo patrones fisiológicos de esfuerzo cortante.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas sensibles al esfuerzo cortante mediante fenotipos cuantificables de adhesión y alineación.
- Valor predictivo: Facilita la selección fenotípica de compuestos que modulan las respuestas endoteliales al flujo periódico.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Proporciona una plataforma estandarizada con gran área superficial para la formación consistente de monocapas endoteliales.
- Escalabilidad: Permite la generación de múltiples réplicas para estudios de respuesta a la dosis y de evolución temporal bajo cizallamiento orbital.
- Resultado cuantitativo: Permite medir cambios dependientes del esfuerzo cortante en la expresión de moléculas de adhesión plaquetaria-endotelial como lectura funcional.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela condiciones de esfuerzo cortante fisiopatológicas implicadas en la inflamación vascular y la trombosis.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos in vitro con la disfunción endotelial in vivo mediante biomarcadores medibles como la disminución de PECAM-1.
- Reducción mecanicista de riesgos: Ayuda a priorizar objetivos al establecer vínculos causales entre los patrones de estrés cortante y los cambios en el fenotipo endotelial.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo del anillo de corte se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la identificación de dianas guiada por hipótesis y la validación preclínica de terapéuticas vasculares mediante la provisión de un estímulo mecánico fisiológicamente relevante.
- Biología del descubrimiento: Permite probar hipótesis sobre vías sensibles al esfuerzo cortante en la fisiología endotelial mediante flujo periódico controlado.
- Selección: Proporciona puntos finales cuantitativos y reproducibles de adhesión y morfología adecuados para la evaluación de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Genera lecturas normalizadas (por ejemplo, relaciones de PECAM-1 a beta-actina) que permiten la comparación entre diferentes condiciones y la selección de resultados positivos.
- Investigación traslacional: Facilita el avance alineado con biomarcadores mediante la modelización de patrones de esfuerzo cortante asociados a la activación o disfunción endotelial.
- Reutilización empresarial: Representa un sistema de bajo costo y modular, adaptable entre subtipos endoteliales y equipos de proyectos, para un uso sostenido en programas de mecanobiología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las respuestas endoteliales a las fuerzas hemodinámicas mediante perfiles definidos y periódicos de esfuerzo cortante.
- Valor operativo: Asegura la estandarización del ensayo y el mantenimiento de la esterilidad mediante un ensamblaje sencillo y un contenedor de fluido sellado con silicona.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar una visión temprana de la vulnerabilidad hemodinámica de los objetivos vasculares.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de vías sensibles a la mecánica basada en resultados fenotípicos dependientes del esfuerzo cortante.
Consideraciones de Implementación
- Requiere técnica aséptica y familiaridad con la unión basada en disolventes utilizando cloruro de metileno bajo campana extractora.
- Depende del acceso a agitadores orbitales compatibles con entornos de incubadora para la aplicación prolongada de esfuerzo cortante.
- Necesita la normalización del siembra celular y la evaluación de la confluencia para garantizar una exposición reproducible al esfuerzo cortante.
- Implica consideraciones sobre la compatibilidad de materiales, ya que el cloruro de metileno daña los plásticos y requiere sustratos de vidrio o resistentes.
- Se limita a magnitudes y frecuencias de esfuerzo cortante alcanzables mediante movimiento orbital; no es adecuado para simulaciones de flujo de alta frecuencia o turbulento.
