Desencadenar el estrés celular y la muerte Uso convencional UV láser confocal Microscopía
3 de febrero de 2017
Las manipulaciones dirigidas para causar estrés dirigido o muerte en células individuales han sido relativamente difíciles de lograr. Aquí, se describe un enfoque de ablación de resolución de una sola célula para estresar selectivamente y matar células individuales en cultivos celulares y animales vivos basado en un láser UV confocal estándar.
El objetivo general de este enfoque de ablación celular es estresar selectivamente o matar células individuales en cultivo celular o en animales vivos. Este método permite a los investigadores estudiar el destino de una sola célula moribunda y la respuesta de las células, como la microglía y los astrocitos, al sitio de ablación circundante. La principal ventaja de esta técnica es la orientación precisa de las células individuales, y que esto se puede lograr con un microscopio confocal normal que está equipado con un láser de 405 nanómetros.
Utilizamos el pez cebra como sistema modelo para estudiar enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de la neurona motora o la demencia frontotemporal. Visualizar la muerte de una neurona motora y sus consecuencias posteriores proporciona una excelente oportunidad para comprender mejor los procesos dinámicos involucrados en la enfermedad. Nuestro enfoque para infligir estrés celular de una manera dependiente de la dosis permite una caracterización detallada de las interacciones celulares.
Por ejemplo, el aclaramiento de la microglía después de la muerte nueronal. Si bien este método proporciona información sobre los mecanismos de enfermedad de un organismo vivo, también se puede aplicar de manera similar en células aisladas en cultivo. Después de establecer líneas transgénicas masculinas y femeninas para el apareamiento de acuerdo con el protocolo de texto, use un colador de té de plástico para recolectar embriones después del desove exitoso colando el agua del tanque.
Luego use agua de huevo para enjuagar los huevos y transfiéralos a agua de huevo en una placa de Petri. Examinar los embriones bajo un microscopio óptico para determinar la fertilización. Luego incube los huevos fertilizados a 28 grados centígrados.
Cuando los embriones alcancen de dos a cinco días después de la fertilización o DPF, colóquelos bajo un microscopio compuesto de fluorescencia y examine los embriones para determinar la expresión adecuada de fluoróforos. Luego, separe el pescado etiquetado brillantemente en un plato fresco con agua de huevo para incrustarlo más tarde. Para incrustar el pez cebra en agarosa, prepare una solución de anestesia agregando cuatro gramos por litro de MS 222 gota a gota a una placa de Petri que contenga agua de huevo.
Prepare un caldo de agarosa de bajo punto de fusión y agua de huevo y alícuota en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Coloque una alícuota en un bloque de calor a 38 a 40 grados centígrados y deje que se equilibre. Para tiempos de imagen de más de cuatro horas, pipetee aproximadamente 300 microlitros de agarosa a lo largo del círculo interior de un plato con fondo de vidrio para preparar un círculo en forma de rosquilla con una pequeña abertura en el centro.
Para montar el pez cebra en agarosa para microscopía, después de anestesiar el pez de acuerdo con el protocolo de texto, use una pipeta ajustable para extraer una larva y dejar que se hunda hasta el fondo de la punta. Deje caer la larva en un volumen mínimo de líquido en agarosa precalentada. A continuación, saque el pescado con agarosa y expórtelo rápidamente en un plato de 35 milímetros con fondo de vidrio previamente preparado.
Bajo un microscopio de disección, use un pincel estándar para colocar al animal o varios animales dentro de la agarosa de costado para que el cuerpo y la cola sean planos. Deje reposar el pescado incrustado durante 10 a 15 minutos hasta que la agarosa esté firmemente cuajada. Luego use aproximadamente dos mililitros de agua de huevo con tricaína para rellenar cuidadosamente la placa de Petri de 35 milímetros.
Coloque la placa de Petri con una larva incrustada en la platina del microscopio confocal y, utilizando una iluminación de campo claro y un aumento de 40x, concéntrese en el lado dorsal de la médula espinal del animal. Cambie a un ajuste de fluorescencia adecuado y visualice la estructura de interés para confirmar que todos los parámetros de imagen son los necesarios para la ablación posterior. Para determinar el grosor de la estructura para la ablación con láser UV, utilice la unidad Z para verificar la parte superior e inferior de la estructura de interés enfocándose manualmente hacia arriba y hacia abajo.
Registre manualmente el plano Z que se ablacionará. Por ejemplo, el centro de la célula. Para llevar a cabo la ablación con láser, inicie el asistente FRAP haciendo clic en el menú desplegable en la parte superior del menú del software.
En la nueva ventana, determine los parámetros de la imagen para el enfoque de ablación seleccionando el formato, la velocidad de escaneo y el promedio. Si aún no se ha seleccionado el plano Z para la ablación, presione el botón Live y enfoque a través de la muestra hasta que la estructura fluorescente o el plano Z deseado a ablacionar esté enfocado. Una vez establecidos los parámetros generales de la imagen, acceda al paso Blanqueador para controlar los componentes específicos de la ablación.
A continuación, active el láser de 405 nanómetros para el procedimiento de blanqueo. A continuación, utilice la opción Acercar para maximizar la intensidad del blanqueo en el ROI seleccionado reduciendo el campo de escaneo y, por lo tanto, maximizando el tiempo de permanencia. Seleccione una o varias ROI para la ablación utilizando cualquiera de las herramientas de dibujo de la ventana Adquisición de imágenes.
Apunte al montículo de axones, por ejemplo, con la herramienta de dibujo circular de aproximadamente cuatro a ocho micrómetros. Después de establecer el ROI, seleccione el botón Curso de tiempo y confirme el número de ciclos en los que se escanearán y ablacionarán los ROI. Elija los fotogramas Pre-Bleach y Post-Bleach como desee para permitir una visión general de toda la imagen justo antes e inmediatamente después del proceso de blanqueo.
Estos ajustes permiten a los investigadores múltiples capas de refinamiento. A través del ajuste de la potencia del láser, la velocidad de escaneo, el promedio de líneas, el tamaño de la región de interés y las repeticiones, esta técnica ofrece un alto grado de libertad para causar estrés o muerte en células individuales. Después de establecer todos los parámetros de ablación necesarios, presione Ejecutar experimento y controle la eficiencia de la ablación.
Consulte el protocolo de texto para obtener detalles adicionales. En este experimento, se llevó a cabo la ablación con láser UV en neuronas motoras que expresan GFP en la médula espinal de pez cebra transgénico. La expresión de GFP impulsada por promotores de neuronas motoras como 3 MINX one, IO one o MET permite la visualización de alta resolución de los cuerpos celulares, los axones principales y las ramas periféricas que se extienden hasta los músculos.
La ablación exitosa de las neuronas en la médula espinal se ha logrado cuando la fluorescencia se desvanece inmediatamente después de la ablación y nunca se reanuda. La especificidad de este enfoque se confirma como se muestra aquí, donde una sola neurona objetivo se convirtió utilizando el fotofluro fotoconvertible Kaede que cambia su emisión de verde a rojo después de la exposición a la luz ultravioleta. Para apuntar a celdas con diferentes intensidades, hay disponibles múltiples capas de ajuste fino ajustando la potencia del láser, la velocidad de escaneo, el promedio de líneas, el tamaño del ROI que se va a ablacionar y las repeticiones.
Como se muestra aquí, las neuronas motoras con proyecciones axonales largas que fueron ablacionadas en el soma con intensidades más bajas de láser UV revelaron una ampolla característica que continuó desde el soma a lo largo del axón con el tiempo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada configuración confocal es única y que la potencia de salida del láser para cada instrumento es específica y puede diferir. Después del procedimiento, se pueden observar rasgos característicos de la muerte celular apoptótica en las neuronas ablacionadas.
Los marcadores apoptóticos como XN 5 o los cambios morfológicos como la degeneración somal o la formación de ampollas externas pueden detectarse de forma reproducible. Se pueden realizar pruebas adicionales para responder a otras preguntas, como cómo se ve afectado el rendimiento en la natación por la ablación de una o varias neuronas en la médula espinal. Al cruzar diferentes líneas de peces cebra transgénicos, los investigadores pueden investigar la respuesta de otras células a la destrucción celular inducida por láser.
Estos métodos proporcionan una plataforma experimental única para comprender los mecanismos moleculares precisos de una enfermedad como la EMN in vivo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar el pez cebra para la microscopía confocal y cómo realizar la ablación con láser UV de una sola célula.
Descripción general
Este artículo describe una novedosa técnica de ablación con resolución a nivel de célula individual que permite a los investigadores inducir estrés o eliminar selectivamente células individuales en cultivos celulares y animales vivos. Mediante el uso de un láser ultravioleta confocal estándar, este método proporciona información sobre las respuestas e interacciones celulares tras la muerte celular dirigida.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación sobre enfermedades neurodegenerativas
Antecedentes
- La manipulación dirigida de células individuales ha sido un desafío.
- Comprender las respuestas celulares al estrés es fundamental en las enfermedades neurodegenerativas.
- La microglía y los astrocitos desempeñan funciones importantes en respuesta a la muerte neuronal.
- El pez cebra sirve como un modelo eficaz para estudiar estos procesos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método preciso para inducir estrés o muerte en células individuales.
- Estudiar el destino de las células en muerte y las respuestas celulares circundantes.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas.
Métodos Utilizados
- Uso de un microscopio confocal equipado con un láser de 405 nm para la ablación.
- Aplicación de un enfoque dependiente de la dosis para inducir estrés celular.
- Inmersión de larvas de pez cebra en agarosa para la obtención de imágenes y ablación.
- Monitoreo de las respuestas celulares tras la ablación mediante microscopía de fluorescencia.
Resultados principales
- Ablación exitosa de neuronas motoras en peces cebra transgénicos.
- La desaparición inmediata de la fluorescencia tras la ablación indica un targeting eficaz.
- Caracterización de la eliminación por microglía tras la muerte neuronal.
- Conocimientos sobre los procesos dinámicos implicados en enfermedades neurodegenerativas.
Conclusiones
- La técnica desarrollada permite una alta precisión en el estudio de las respuestas individuales de las células.
- Este método puede aplicarse tanto en entornos in vivo como in vitro.
- Investigaciones futuras pueden aprovechar este enfoque para explorar los mecanismos de las enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la ablación precisa de células individuales dependiente de la dosis, utilizando microscopía confocal convencional, ofreciendo un enfoque escalable para estudiar las respuestas al estrés celular y la señalización intercelular en modelos de enfermedades neurodegenerativas. Al permitir la visualización en tiempo real de las reacciones de microglía y astrocitos frente a lesiones neuronales dirigidas, apoya la reducción mecanicista de riesgos en las etapas iniciales de validación de dianas y en los flujos de trabajo de cribado fenotípico. La técnica mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles de la cinética de muerte celular y la activación glial en sistemas fisiológicamente relevantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la inducción controlada de estrés celular en neuronas individuales dentro de tejido intacto.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma reproducible para la validación funcional de dianas utilizando parámetros de ablación dependientes de la dosis y del tiempo.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al vincular los resultados de muerte celular individual con respuestas gliales descendentes relevantes para las vías neuroinflamatorias.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia de la degeneración axonal y la fragmentación celular para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita la preparación para cribado de alto contenido mediante parámetros láser ajustables (potencia, velocidad de escaneo, tamaño del área de interés) para inducir estrés de manera consistente.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en modelos de cultivo celular y en peces cebra in vivo sin necesidad de equipo especializado más allá de un sistema confocal equipado con láser de 405 nm.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las observaciones de ablación de células individuales en fase de descubrimiento con la validación preclínica de mecanismos neurodegenerativos en pez cebra.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la evaluación de la activación de microglía y la degeneración axonal como biomarcadores trasladables de lesión neuronal.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite la reducción del riesgo mecanicista mediante la caracterización de fenotipos de muerte celular dependientes de la dosis y de las respuestas celulares circundantes antes de las pruebas con compuestos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir estudios de ablación guiados por hipótesis que aportan información sobre la confianza en el blanco y la clarificación de la vía antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la inducción precisa y reproducible de estrés celular para esclarecer las vías de muerte celular y la dinámica de activación de la glía.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos y resueltos en el tiempo (por ejemplo, pérdida de fluorescencia, blebbing, degeneración axonal) adecuados para análisis automatizados basados en imágenes en ensayos de compuestos.
- Analítica: Ofrece datos de respuesta a la dosis y series temporales que permiten la comparación estadística de condiciones de ablación y respuestas celulares entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad desde la lesión de una sola célula en pez cebra hasta modelos fenotípicos de enfermedades neurodegenerativas, apoyando la validación de dianas alineadas con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable en diversos equipos de descubrimiento en neurociencia, adaptable a diferentes tipos celulares y modelos de enfermedad mediante infraestructura estándar de microscopía confocal.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en los mecanismos de muerte celular específicos y en las respuestas gliales.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante el control de parámetros láser y la compatibilidad con microscopios confocales convencionales.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana del acoplamiento al objetivo mediante lecturas fenotípicas de muerte neuronal e inflamación neuroinmune.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al generar datos mecanicistas sobre la muerte celular dependiente de la dosis y las interacciones celulares posteriores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal, manejo de pez cebra y optimización de parámetros de ablación basada en fluorescencia.
- Depende del acceso a un microscopio confocal equipado con un láser de 405 nm y conjuntos de filtros adecuados para la excitación en ultravioleta y la detección de emisión.
- Necesita la estandarización de la potencia del láser, velocidad de escaneo, tamaño de la región de interés (ROI) y número de repeticiones entre usuarios y sesiones para obtener resultados de ablación reproducibles.
- Requiere adaptación de los protocolos de inclusión e imagen cuando se aplica el método a diferentes sistemas modelo (por ejemplo, cultivo celular frente a organismos intactos).
- Las limitaciones prácticas incluyen la posible fototoxicidad más allá de la región de interés seleccionada y la variabilidad en la salida del láser entre diferentes sistemas confocales, lo que exige una calibración específica para cada instrumento.
