Name: Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a evaluar la reserva de calcio del retículo sarcoplásmico y la eliminación diastólica en cardiomiocitos aislados. Este método permite estudiar el manejo intracelular de calcio en condiciones patológicas como diabetes e insuficiencia cardíaca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), médico y salud ciencia programa de la provincia de Zhejiang (no. 201646246, Dongwu Lai) y las Ciencias de la salud y Plan de tecnología de la ciudad de Hangzhou (n º 2013A28, Ding Lin).

animal todos los experimentos fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de Investigación Experimental, Academia China de ciencias médicas chinas y la Universidad de Zhejiang.
 1. preparación de la solución <ol><li>preparar todas las soluciones como se describe en la tabla 1.</li></ol>
 2. aislamiento de izquierda Ventricular (LV) cardiomiocitos Nota: LV cardiomiocitos son aisladas enzimáticamente mediante un sistema de perfusión de Langendroff como se describió anteriormente 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
<ol><li>Instalar el sistema de perfusión Langendroff. Llene el sistema de perfusión con solución Tyrode Normal (NT), temperatura 36,5 ° c y eliminar cualquier burbuja de aire en el tubo de.</li>
	<li>Pesan y anestesiar una rata Sprague-Dawley por inyección intraperitoneal (ip) de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirme el estado anestésico evaluando respuesta pizca de cola o dedo del pie después de 5 minutos</li>
	<li>Abrir la cavidad abdominal debajo del proceso xifoides con una tijera quirúrgica, levante el proceso xifoides y abre el cofre con la tijera. Quitar el pericardio, levante levemente el corazón con fórceps curvado, identificar el arco aórtico y cortar el corazón de tijeras de la raíz de la aorta.</li>
	<li>Transferir el corazón a un plato de 60 mm y lavarlo con solución de NT. Mantener la aorta con dos pinzas de disección micro y móntelo en la cánula de perfusión de Langendorff y luego ligar firmemente la aorta en la cánula utilizando suturas quirúrgicas. 
	Nota: Un operador experto puede terminar este proceso dentro de los 15 s.</li>
	<li>Inundar el corazón con solución 30 mL NT para recuperar la circulación de las arterias coronarias. Luego, cambiar la solución 30 ml Ca 2 +-libre solución de Tyrode (taurina, 1 mg/mL BSA de 10 mM) para detener los latidos del corazón. A continuación, cambie la solución a la solución de aislamiento de colagenasa A (0,6 mg/mL) para la digestión de la enzima. 
	Nota: Uso colagenasa para experimentos con ratas diabéticas o colagenasa II para experimentos sin ratas diabéticas.</li>
	<li>Después de la digestión para 20-25 minutos, cambiar rápidamente la solución de perfusión para el Ca 2 +-libre solución Tyrode para detener aún más la digestión. Luego, mantenga el corazón con unas pinzas, cortado de la cánula y coloque el corazón en un plato de 35 mm que contenga solución KB (ver tabla 1).</li>
	<li>Disecan la pared del LV con tijeras y pinzas. Corte la aurícula, ventrículo derecho y zona de la ensambladura auriculoventricular. El tejido restante es LV; traslado a una nueva placa de 35 mm con solución KB. Pique el tejido del LV en pedazos pequeños.</li>
	<li>Pipetear las piezas con un gotero plástico filtrada y resuspender en solución de 10 mL KB.</li>
	<li>Filtro de las células con 150 μm filtro de acero inoxidable de abertura y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue a 150 x g por 30 s y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender los miocitos en solución de 10 mL KB, reposar 6 minutos, descartar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en solución de 10 mL KB. 
	Nota: Todas las medidas se realizaron a 36 ° C en soluciones de gaseado con 100% O 2.</li>
</ol> 3. Reintroducción de calcio <ol><li>después de colocar por 20 min en solución KB, deseche el sobrenadante y resuspender los miocitos con solución de calcio reintroducción A (0.3m m Ca 2 +, 4,5 mL Ca 2 +-solución de Tyrode gratuita, NT de 1,5 mL de solución) durante 10 minutos</li>
	<li>Repita el procedimiento anterior con solución de reintroducción de calcio B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-solución de Tyrode gratuita, NT de 3 mL de solución).</li>
	<li>Repita el procedimiento anterior con solución de NT (1.2m m Ca 2 +) para purificar los miocitos disponibles. Los miocitos aislados de LV en esta solución y estudiar dentro de 4-6 h.</li>
</ol> 4. Set Up de perfusión sistema <ol><li>Conecte el tubo de entrada con la solución de NT para la perfusión de la cámara ( figura 1A).</li>
	<li>Para perfusión de aguja de la blanco del miocito, conecte la punta múltiple multi-cañón (p. ej., lápiz de perfusión, conocido en adelante como lápiz), fijo en el instrumental quirúrgico, a la válvula de control sistema de perfusión. Añadir solución de NT y cafeína 10 mM a cada columna del lápiz ( figura 1A).</li>
	<li>Evacuar cualquier burbuja de aire en los tubos para evitar la obstrucción de aire.</li>
	<li>Cuenta el número de goteo desde la punta del micrón del lápiz de 10 s y ajustar manualmente el regulador de flujo para mantener la velocidad del flujo a una velocidad aproximada de 3 s. de goteo/10</li>
</ol> 5. Las mediciones de Ca intracelular 2 + transitorio y el acortamiento del sarcómero 7 , 8 , 9 <ol><li>suspensión pipeta 10 μL en la diapositiva, contar el número de células por un contador de células bajo el microscopio y calcular la densidad. Diluir los miocitos a una concentración aproximada de 50.000 células/mL.</li>
	<li>Añadir el Fura-2 acetoxymethyl (AM) stock (un colorante sensible de calcio) en una suspensión de 1 mL de miocitos para llevar la concentración final de 2 μm. mantener en la oscuridad por 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar a 150 g durante 30 s y volver a suspender los cardiomiocitos con solución de NT 2 veces.</li>
	<li>Giro de la luz y mantener las células en la oscuridad. Colocar los miocitos en la cámara de perfusión durante 15 minutos. Luego iniciar la perfusión de cámara (1.5 mL/min) con solución de NT. Ritmo de los miocitos con estimulación de campo de 1 Hz usando un estimulador (duración de onda ms de 4,0, amplitud de pulso 8.0 V) durante 5 minutos</li>
	<li>Seleccione un miocito con buena forma (forma de varilla, filo y claro estriaciones cruzadas) y contracción estimulada estable (sin contracción espontánea) debajo de los 10 x objetivo microscopio. A continuación, cambiar la ampliación microscópica a 40 x y girar la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal.</li>
	<li>Marco el miocito solo ajustando el adaptador de estructura celular. Asegúrese de que el fondo es claro.</li>
	<li>Exponer los miocitos a la luz emitida por una lámpara de xenón, con 340 380 nm longitud de onda excitación filtros o y la imagen de los miocitos a través de un objetivo de 40 x. Detectar la señal de fluorescencia a 510 nm. Mientras tanto, tenga en cuenta los cambios de longitud de sarcómera de los miocitos y grabar utilizando el módulo de borde suave al mismo tiempo.</li>
	<li>Registro de la fluorescencia por un sistema de fotomultiplicador doble excitación de fluorescencia. Ejecute el programa de grabación para el calcio en el sistema de imagen, haga clic en &#34; archivo/nuevo archivo &#34; para crear un nuevo archivo de registro y haga clic en la &#34; Inicio &#34; botón para longitud de sarcómero y fluorescencia síncrono registro.</li>
</ol> 6. Evaluación de la Ca de SR 2 + reserva y diastólica Ca 2 + función eliminar 7 , 8 , 9 <ol><li>Interlink el &#34; Aux Out &#34; puerto de el estimulador con el &#34; análogo en &#34; puerto en el sistema de control de válvula (p. ej., comandante de la válvula, véase Tabla de materiales) por un cable BNC (para sincronizar la señal de la TTL).</li>
	<li>Preset un programa para cambiar las válvulas de perfusión automáticamente como se describió anteriormente 8 , 9; Pasos detallados para la operación se enumeran como sigue.
	<ol><li>Predefinidos los parámetros de la válvula de controlan de software según la tabla 2 y haga clic en el &#34; descargar &#34; el botón para descargar la secuencia de cargado en el programa. Haga clic en el &#34; TriggER &#34; botón para activar la función de trigger. 
		Nota: El sistema de control de la válvula puede ejecutar la secuencia después de recibir la señal de la TTL.</li>
		<li>Preset el estimulador a modo de secuencia y definir los parámetros según la tabla 3.</li>
	</ol></li> <li>Set estimulador en &#34; S1 paso &#34; a paso LV miocitos a 1 Hz. iniciar la perfusión de la aguja a la velocidad de 1,5 mL/min con solución NT. 
	Nota: Debido a la velocidad de la corriente de la aguja es más rápido que la perfusión de la cámara, la refracción de la luz de la secuencia de la aguja es diferente de la refracción de la luz de la perfusión de la cámara. La diferencia de refracción de la luz indica el rango de perfusión aguja eficaz, que rodea el destino del miocito.</li>
	<li>Seleccione un destino del miocito bajo visión microscópica de baja potencia (en la secuencia de abajo a arriba), y asegúrese de que se puede llegar por la micro punta del lápiz. Cambiar la ampliación del microscopio a 400 x. Girar la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal. Ajuste la abertura rectangular en el adaptador de estructura celular a una ventana conveniente que llena de los miocitos. Asegurar que exista un mínimo fondo; No permita que otros miocitos o restos de células muertas en esta ventana.</li>
	<li>Ajustar la posición del lápiz en el instrumental quirúrgico y cuidadosamente coloque la punta de la micro a la distancia del radio del campo de visión para el miocito blanco bajo 400 x aumentos de microscopio.</li>
	<li>Ajustar el rango de corriente de aguja para sobre todo cubrir el objetivo del miocito y asegúrese de que el miocito no puede ser arrastrado por el flujo aguja.</li>
	<li>Después de 60 s básicos de estimulación, rodar el cursor estimulador para el &#34; paso D2 &#34;. 
	Nota: El resto del Protocolo se ejecutarán automáticamente por el estimulador y el sistema de control de la válvula. Basado en el ajuste anterior, el protocolo podría ser ejecutado automáticamente como en la figura 2A, básica de estimulación con solución de NT para 60 1 Hz s. Luego pausa estimulación y demora de 2 s, rápidamente cambiar a perfusión de cafeína de 10 mM de 15 s (funcionalmente libera Ca 2 + almacenamiento en SR) y luego cambiar a solución NT.</li>
	<li>Al final de la grabación, detectar la fluorescencia de fondo para miocitos individuales. Haga clic en el &#34; pausa &#34; botón para pausar el archivo de registro, mover el punto de vista microscópico a una zona en blanco. Haga clic en el &#34; registro &#34; botón para reanudar la grabación durante segundos y grabar numérico 340 y 380 nm intensidad los valores de corrección de fondo.</li>
	<li>Abierto el &#34; operación, constante &#34; cuadro de diálogo y llenar los valores en el &#34; fondo &#34; forman, respectivamente, el software puede corregir Fura 2 valores del cociente restando el fondo.</li>
</ol> 7. Análisis de datos 9 <ol><li>para la medición de calcio transitorios y sarcómeras acortamiento en la fase de establecimiento del paso básica, promedio de los impulsos de contracción y luego analizar parámetros dinámicos, como oscilaciones de calcio, la constante de tiempo de deterioro transitorio del calcio (Tau-1 Hz), utilizando el software automáticamente. 
	Nota: Si el software no entra bien el segmento de decaimiento, exportar el rastro de decadencia para la guarnición de curva exponencial mono manual.</li>
	<li>Pulsos de calcio inducida por la cafeína, seleccione sólo el pulso con una onda escarpada para el análisis de la función de eliminación de calcio. Excluir las células con alteración de la señal, pulso anormal o que fluyó a mitad del camino centraa.</li>
	<li>Medir la amplitud del pulso de calcio inducida por la cafeína (Ca-cafeína, un índice de SRCa 2 + reserva).</li>
	<li>Obtener la constante de tiempo de decaimiento del pulso de calcio inducida por la cafeína (Tau-cafeína) instalando mono exponencial curva (duración de 10 s) manualmente desde el software ( figura 2).</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li>
<li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li>
<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+inhibition+in+heart+failure%2C+beneficial%2C+harmful%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Flujo de calcio liberado de lo SR es el Ca2 + fuente principal para la sístole en el corazón. A cierto punto, la amplitud del SR Ca2 + contenido y el fraccionario Ca2 + de la SR reflejan el SR Ca2 + reserva disponible para la contracción cardiaca. Por otra parte, la Ca2 + reserva de SR depende de la capacidad de la recaptación de Ca SR2 + , Ca2 + fuga de SR y su equilibrio a través del SR durante diástole12,<su...

Calcio intracelular ([Ca2 +]) reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en cardiomiocitos1. Como sabemos, inducida por el calcio Ca2 + lanzamiento inicia la excitación-contracción de acoplamiento, que traducen la señal eléctrica a la contracción. Despolarización de la membrana activa lo sarcolemales Ca tipo L2 + canales, que inducen Ca2 + lanzamiento de SR en el citoplasma a través de receptores de Ryanodina (RyR2) de 2. La transitoria elevada citoplásmicas Ca2 + inicia la contracción de las miofibrillas. Durante el diástole, citoplásmicas Ca2 + es reuptaken en el SR con el SR Ca2 +-ATPasa 2 (SERCA2) y bombeado en el cardiomiocito a través de la Na+-Ca2 + cambiador (NCX)2. Este proceso conduce a la contracción y relajación de los cardiomiocitos.
El SR cardiaco es una red intracelular de la membrana que rodea la maquinaria contráctil. Sirve como un depósito de Ca2 + para la contracción, y reabsorbe Ca intracelular2 + durante la relajación. El SR Ca2 + reserva disponible para beats es determinada para la contractilidad cardiaca. Mientras tanto, la eliminación de Ca intracelular2 + es crítica para la diástole cardiaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes e insuficiencia cardíaca, alteración Ca2 + despacho y deprimido SR Ca2 + tienda en cardiomiocitos puede estar involucrado en el proceso de disfunción cardiaca2,3 ,4.
Para medir Ca SR2 + liberación y diastólica Ca2 + retiro en cardiomiocitos, hay dos métodos ampliamente utilizados: la integridad de la corriente NCX basado en abrazadera del remiendo5,6y el Ca inducida por la cafeína 2 + pulso basado en Ca2 + fluorescencia imagen7,8,9. Lo anterior depende el hecho de que el Ca2 + de la SR es en gran medida bombeada fuera de la célula por NCX. Sin embargo, este enfoque está limitado por sus requerimientos de equipo avanzado y experto. En el presente estudio, describimos un método conveniente para evaluar reserva de SR Ca2 + y Ca2 + retiro en miocitos mediante la medición de un inducido por cafeína Ca2 + pulso basado en un Ca2 + fluorescencia sistema de imagen. Brevemente, intracelular Ca2 + fluorescencia indica Fura-2. Por la interconexión del sistema de estimulación y sistema de perfusión, presentamos un programa para la perfusión y el sistema de estimulación automáticamente. cafeína 10 mM fue empleada para inducir rápidamente la total liberación de Ca2 + en el SR. Las constantes de tiempo de decaimiento exponencial (Tau) de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína se obtuvieron de mono exponencial curva de ajuste, que reflejan la contribución de SERCA y NCX para diastólica Ca2 + retiro en consecuencia.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutámico</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>cafeína</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Langendorff</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>Micromanipulador</td> PlexiThermo-S-LANGC <td></td></tr><tr><td></td><td>Eslabones</td><td></td><td>Marchauser MM33</td></tr><tr><td>Cámara de perfusión</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión por gravedad controlada por válvula</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>software de control de válvulas</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de caudal de precisión</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Colector de Perfusión Lápiz AutoMate</td><td>Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Punta extraíble de micras</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de medición de fluorescencia y dimensionamiento de celdas</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Software de grabación</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Ratas Sprague-dawley</td> Beijing <td>Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Cardiaco retículo sarcoplásmico (SR) sirve como un depósito de Ca2 + para la contracción, que reuptakes intracelular Ca2 + durante la relajación. El SR Ca2 + reserva disponible para golpes es determinada para contractibility cardiaca, y la eliminación de Ca intracelular2 + es crítica para la función diastólica cardíaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes y la insuficiencia cardíaca, remoción de calcio deteriorada y SR Ca2 + tienda en cardiomiocitos pueden implicar en el progreso de la disfunción cardiaca. Aquí, describimos un protocolo para evaluar SRCa2 + reserva y diastólica Ca2 + extracción. Brevemente, un cardiomiocito solo fue enzimático aislado, y la intracelular Ca2 + fluorescencia indicada con Fura-2 se registró por un sistema de proyección de imagen del calcio. Para emplear cafeína para inducir total SR Ca2 + liberación, preselección de un programa de interruptor automático de la perfusión por la interconexión del sistema de estimulación y el sistema de perfusión. Entonces, la guarnición de curva exponencial mono fue utilizada para analizar las constantes de tiempo de decaimiento de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína. En consecuencia, la contribución de la SR Ca2 +-ATPasa (SERCA) y Na+-Ca2 + cambiador (NCX) a quitar calcio diastólico se evaluó.

Aquí ilustramos streptozotocin (STZ) - indujo ratas diabéticas (DM) y pareados por edad Sprague - Dawley (SD) las ratas por ejemplo. las ratas macho SD 8 semanas de edad (200 ± 20 g) recibieron una inyección intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para el búfer de grupo o citrato de DM en el grupo control. Una semana después de la administración de STZ, ratas con glucosa en la sangre &#62; 16,7 mmol/L se considera diabético. Después de 8 semanas, los miocitos del LV se aislaron enzimáticame...

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca2 + reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la reserva de calcio del retículo sarcoplasmático y la función de eliminación intracelular de calcio diastólico en cardiomiocitos aislados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el mecanismo de manejo intracelular de calcio bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes y la insuficiencia cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es su comodidad y que está menos limitada por la técnica y el equipo.Para comenzar este procedimiento, prepare el sistema de perfusión Langendorff. Llene el sistema de perfusión con solución NT, ajuste la temperatura a 36,5 grados Celsius y elimine cualquier burbuja de aire en el tubo. A continuación, abra la cavidad abdominal debajo del proceso xifoides, levante el proceso xifoides y abra el tórax con una tijera.Luego, retire el pericardio, levante ligeramente el corazón con pinzas curvas, identifique el arco aórtico y corte el corazón en la raíz de la aorta. A continuación, transfiera el corazón a una placa de 60 milímetros y lávelo con solución NT. Sujete la aorta con dos pinzas microquirúrgicas y colóquela en la cánula de perfusión Langendorff.Luego, ligue firmemente la aorta a la cánula utilizando suturas quirúrgicas. Posteriormente, perfunda el corazón con 30 mililitros de solución NT para recuperar la circulación de las arterias coronarias. A continuación, cambie el perfusado a 30 mililitros de solución Tyrode sin calcio para detener los latidos del corazón.A continuación, cambie el perfusado a la solución de aislamiento con colagenasa A para la digestión enzimática. Después de la digestión durante 20 a 25 minutos, cambie rápidamente la solución de perfusión a la solución de Tyrode sin calcio para detener la digestión adicional. Luego sostenga el corazón con pinzas, córtelo de la cánula y coloque el corazón en una placa de 35 milímetros que contenga la solución KB.A continuación, localice el área del ventrículo izquierdo. Corte la aurícula, el ventrículo derecho y la zona de la unión atrioventricular. Luego, transfiera el ventrículo izquierdo a una nueva placa de 35 milímetros con solución KB y pique el tejido en trozos pequeños.Pipetee suavemente los fragmentos con una pipeta plástica filtrada. A continuación, filtre las células mediante un filtro de acero inoxidable con una abertura de 150 micrones y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros. Después, centrifugue la muestra a 150 ×g durante 30 segundos y deseche el sobrenadante.ReSuspender los miocitos en 10 mililitros de solución KB y dejarlos sedimentar durante seis minutos. Posteriormente, desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 mililitros de solución KB durante 20 minutos. Después de sedimentar en la solución KB durante 20 minutos, desechar el sobrenadante y resuspender los miocitos con la solución A de reintroducción de calcio. Repetir el procedimiento anterior con la solución B de introducción de calcio. Luego, repetir el procedimiento anterior con la solución NT para purificar los miocitos disponibles.Guarde los miocitos ventriculares aislados en esta solución y estúdielos dentro de las cuatro a seis horas siguientes. A continuación, agregue solución NT y solución de cafeína 10 milimolar a cada columna del lápiz. Elimine cualquier burbuja de aire en los tubos para evitar obstrucciones por aire.Ahora, conecte el tubo de entrada con la solución NT para la perfusión de la cámara. Para la perfusión con aguja del miocito diana, conecte la punta del manifold multibarro a un sistema de perfusión controlado por válvula. Posteriormente, cuente el número de gotas que salen de la punta micrométrica del lápiz durante 10 segundos y ajuste manualmente el regulador de flujo para mantener la velocidad del flujo a aproximadamente tres gotas por cada 10 segundos.En este procedimiento, agregue el stock de fura-2-acetoximetil a un mililitro de la suspensión de miocitos para obtener una concentración final de dos micromolares. Incube en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, deseche el sobrenadante y resuspenda los cardiomiocitos con solución NT dos veces.A continuación, apague la luz y mantenga las células en la oscuridad. Coloque los miocitos en la cámara de perfusión durante 15 minutos antes de perfundirlos con la solución NT. Estimule los miocitos con una frecuencia de un hercio mediante estimulación de campo durante cinco minutos utilizando un estimulador.Ahora, seleccione un miocito con buena forma y contracción estimulada estable bajo el objetivo microscópico de 10X. Haga clic en Archivo Nuevo archivo para crear un nuevo archivo de grabación. A continuación, cambie la magnificación microscópica a 40X y gire la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal.Luego, enmarque el miocito individual ajustando el adaptador de enmarcado celular y asegúrese de que el fondo esté limpio. Posteriormente, exponga los miocitos a la luz emitida por una lámpara de xenón con filtros de excitación de longitud de onda de 340 o 380 nanómetros e image los miocitos a través de un objetivo de 40X. Detecte la señal fluorescente a 510 nanómetros.Haga clic en el botón Inicio para registrar simultáneamente la fluorescencia y la longitud del sarcómero utilizando el sistema de fotomultiplicador de fluorescencia con doble excitación. Observe los cambios en la longitud del sarcómero de los miocitos y realice el registro simultáneamente usando el módulo de borde suave. En este procedimiento, conecte el puerto aux out del estimulador con la entrada analógica del sistema de control de válvulas mediante un cable BNC.A continuación, configure los parámetros en el software de control de la válvula, haga clic en el botón de descarga para descargar la secuencia cargada en el programa y haga clic en el botón de activación para habilitar la función de activación. Luego, configure el estimulador en modo de secuencia y establezca los parámetros. Posteriormente, coloque el estimulador en el paso S1 para estimular los miocitos ventriculares izquierdos a un hercio.Inicie la perfusión con la aguja a una velocidad de 1,5 mililitros por minuto con la solución NT. Seleccione un miocito objetivo bajo la vista microscópica de baja potencia y asegúrese de que pueda ser alcanzado por la micro-punta del lápiz. A continuación, cambie la magnificación del microscopio a 400X.Gire la orientación de la cámara CCD para mantener el miocito en posición horizontal. Luego, ajuste la abertura rectangular debajo del adaptador de encuadre celular a una ventana adecuada que se llene con los miocitos. A continuación, ajuste la posición del lápiz fijado en el micromanipulador y coloque cuidadosamente la micropunta a una distancia igual al radio del campo de visión respecto al miocito objetivo.Luego, ajuste el rango del chorro de la aguja para que cubra principalmente el miocito objetivo y asegúrese de que el miocito no pueda ser arrastrado por el flujo de la aguja. Después de 60 segundos de estimulación básica, gire el cursor del estimulador al paso D2. El resto del protocolo será ejecutado automáticamente por el estimulador y el controlador de válvulas.Haga clic en el botón Pausa para detener la grabación del archivo y mueva la vista microscópica a un área en blanco cercana. Luego, haga clic en el botón Grabar para reanudar la grabación durante unos segundos y registrar los valores numéricos de intensidad a 340 y 380 nanómetros para la corrección del fondo. Después, abra el cuadro de diálogo Constante de operación y complete los valores en el formulario de fondo.El software puede corregir los valores de la relación fura-2 restando el fondo. Aquí se muestra una ilustración del protocolo para cambiar automáticamente las válvulas de perfusión y el sistema de estimulación. Esta figura muestra los valores estadísticos de la reserva de calcio del retículo sarcoplásmico y de la liberación fraccional de calcio para contracciones estimuladas a un hercio en los grupos diabético y Sprague Dawley.El grupo diabético mostró una disminución significativa en la reserva de calcio del retículo sarcoplásmico y en la liberación fraccional de calcio del retículo sarcoplásmico en comparación con el grupo Sprague Dawley. Aquí, el panel del software muestra un ajuste manual de curva monoexponencial para la constante de tiempo de decaimiento del pulso de calcio inducido por cafeína. Estos gráficos de barras comparan la Tau-cafeína y la relación Tau-1Hz/Tau-cafeína entre los grupos diabético y Sprague Dawley.El grupo diabético mostró valores significativamente aumentados de Tau-cafeína y Tau-1Hz/Tau-cafeína en comparación con el grupo Sprague Dawley. Este procedimiento proporciona una herramienta factible y conveniente para explorar el mecanismo de manejo del calcio intracelular en la disfunción cardíaca. Al realizar este procedimiento, existen algunos puntos clave que deben tenerse en cuenta, como la adherencia estable de los miocitos al plato, envolver el conmutador de canales, controlar la velocidad de flujo de la perfusión con aguja y la distancia adecuada entre la punta de la aguja y el miocito objetivo.

assessment-sarcoplasmic-reticulum-calcium-reserve-intracellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Este artículo describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad del miofilamento Ca2+ durante la contracción en miocitos cardíacos aislados del corazón de rata. Junto con la electrofisiología cardíaca, los niveles de Ca2+ del citosol sistólico/diastólico y la contracción/relajación, esta medición es imprescindible para respaldar los mecanismos que median el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca en corazones sanos y enfermos.

Evaluación de los miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.

Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada

Presentamos la metodología para el aislamiento de miocitos murinos y cómo obtener trazas de voltaje o calcio simultáneamente con rastros de acortamiento de sarcomere utilizando fotometría de fluorescencia con mediciones simultáneas de geometría celular digital.

Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

Este protocolo tiene como objetivo describir paso a paso la técnica de extracción y evaluación de la función cardíaca utilizando cardiomiocitos despellejados. Esta metodología permite la medición y la agudomodulación de la función de miofilamento utilizando pequeñas biopsias congeladas que se pueden recoger de diferentes lugares cardíacos, desde ratones hasta hombres.

Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (&lt;50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca2+) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.

Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores

Este protocolo describe un método para medir simultáneamente el diámetro citosólico, el calcio libre [Ca2+]i y los vasos en vasos linfáticos en contracción y luego calcular las concentraciones absolutas de Ca2+ , así como los parámetros de contractilidad/ritmicidad. Este protocolo se puede utilizar para estudiar el Ca2+ y la dinámica contráctil en una variedad de condiciones experimentales.

Evaluación en tiempo real de la contractilidad absoluta, citosólica, libre de Ca2+ y correspondiente en vasos linfáticos aislados y presurizados

Aprende a evaluar la reserva de calcio del retículo sarcoplásmico y la eliminación diastólica en cardiomiocitos aislados. Este método permite estudiar el manejo intracelular de calcio en condiciones patológicas como diabetes e insuficiencia cardíaca.

Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas (Video) | JoVE Journal

Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Explorar más videos