Name: Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprende un protocolo de inmunohistoquímica semi-automatizado para identificar tipos de fibras musculares esqueléticas en ratón. Este método permite analizar la morfología y composición de fibras con alta precisión y velocidad.

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Agradecemos a la Fundación Boettcher y la Asociación de Esclerosis Lateral Amiotrófica (#17-II-344) su apoyo a esta investigación.

todos los procedimientos que involucran ratones fueron aprobados por la Universidad de Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care y uso (91813(05)1D).
 1. día 1: primaria (1°) Immunostaining con albúmina sérica bovina (BSA) bloqueo <ol><li>al aire secciones congeladas del músculo del miembro posterior de ratón (por ejemplo, tibial anterior, sóleo) montado en diapositivas cargadas de ~ 30 min 11. dibujar un borde alrededor de las secciones usando una barrera hidrofóbica PAP pluma.</li>
	<li>Lugar ~ 250 μl de 5% BSA/tampón de fosfato salino (PBS/BSA) en cada diapositiva para bloquear la Unión de anticuerpos no específicos. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Al bloqueo, preparar 1:50 las diluciones del anticuerpo 1 ° sobrenadante en el 5% BSA/PBS (todos son anticuerpos monoclonales de ratón; ver tabla 1 6 , 12) preparar 250 μl de solución por diapositiva. Mantener las poblaciones de anticuerpos de 1° y diluciones en hielo.</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> tabla 1: anticuerpos primarios utilizados para distinguir MyHCs.
<ol start="4"> <li>después de la aspiración de la solución al bloqueo 5% BSA/PBS, Añadir 250 μl de la dilución de anticuerpos de 1° a las diapositivas correspondientes. Añadir 250 μl de 5% BSA/PBS para secundaria (2°) anticuerpo negativo de control que sólo desliza.</li>
	<li>Incubar a 4 ° C durante 24-48 h en un ambiente húmedo. 
	Nota: Un plato de Petri cubiertas en papel de aluminio con papel de filtro humedecido puede servir como una cámara de incubación adecuada.</li>
</ol> 2. Día 2:2 ° Immunostaining con los anticuerpos fluorescentes <ol><li>aspirar 1° solución de anticuerpo o 5% BSA/PBS solución de control. Lave todo desliza tres veces, 10 minutos con 5% de BSA.</li>
	<li>Al lavarse, preparar diluciones 1: 200 de los anticuerpos purificados, conjugados fluoróforo 2 ° de 5% BSA/PBS (véase el cuadro 2, todos son cabra anti-ratón). Preparar 250 μl de solución por diapositiva. Mantener anticuerpos conjugados fluoróforo 2° en la oscuridad en hielo.</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> tabla 2: anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo se usan para visualizar primario anticuerpo reconocimiento de MyHCs.
<ol start="3"> <li>después de la aspiración de la tercera aplicación de la solución al bloqueo 5% BSA/PBS, Añadir 250 μl de dilución de anticuerpo de 2° a todas las diapositivas. Incubar durante 90 minutos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y húmedo.</li>
	<li>Solución de aspirado 2° anticuerpo. Lave todo desliza tres veces, 10 minutos con 5% BSA/PBS.</li>
	<li>Enjuague con PBS. Seca durante 10 minutos</li>
	<li>Montar el cubreobjetos con un medio de montaje acuoso no permanente, de baja viscosidad.</li>
	<li>Cuando esté seco, sellar los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas. Secar y guardar en un oscuro slidebox.</li>
</ol> 3. Diapositivas con microscopía de epifluorescencia de imágenes <ol><li>limpiar los portaobjetos con un trapo de laboratorio empapado en etanol 70% pequeñas,.</li>
	<li>Obtener imágenes digitales de las secciones de músculo immunostained usando un microscopio de epifluorescencia equipado con un aparato fotográfico (ver la Tabla de materiales).
	<ol><li>Seleccione un área de aproximadamente 1 mm 2 (objetivo de 10 X, NA 1.4).</li>
		<li>Ver fluorescencia de anticuerpos conjugados con Alexa 488 2° vía un 505 nm largo filtro. Ve la fluorescencia generada por excitación de anticuerpos conjugados con Alexa 594 2° a través de un filtro de paso de largo 595 nm. Digitalizar imágenes con un ordenador PC equipado con un software de tratamiento de imágenes compatible. Incluyen la barra de escala del software para su posterior análisis de imágenes.</li>
	</ol></li></ol> 4. Análisis de imágenes con Fiji Nota: antes de proceder con el análisis, Fiji (disponible libremente de los institutos nacionales de salud, Bethesda, MD) debe ser instalado a través de https://imagej.net/Fiji/Downloads. También, la macro utilizada en este proceso se proporciona en el Archivo suplementario. Coloque el archivo de macro en un directorio accesible.
<ol><li>Carga un brightfield imagen de una sección seleccionada en Fiji. Desplácese hasta Plugins &#8594; segmentación &#8594; segmentación de Weka Trainable.</li>
	<li>Con el fin de establecer las áreas celulares de la sección, trace una línea en una fibra y haz clic &#34; Agregar clase 1 &#34;. A continuación, trace una línea en el espacio entre las fibras y haga clic en &#34; añadir a la clase 2 &#34; para marcar los dominios extracelulares. Repita hasta que hay etiquetas de 5-10 en cada clase.
	<ol><li>Haga clic en clasificador de tren. En la superposición de roja y verde resultante, agregar más etiquetas manualmente (ver paso 4.2) para piezas mal segmentados de la imagen, si es necesario. Repita hasta que las fibras (rojo) se separan adecuadamente el espacio entre las fibras (verde).</li>
	</ol></li> <li>Clic &#34; probabilidad de conseguir &#34; y guardar la imagen en una carpeta recién etiquetada.</li>
	<li>Repita el procedimiento anterior (pasos de 4.2-4.3) con la imagen fluorescente del mismo campo. Etiqueta immunostained fibras como &#34; clase 1 &#34; y todas las regiones no fluorescente como &#34; clase 2 &#34;. Guardar el mapa de probabilidad resultante en la misma carpeta donde se almacena la imagen procesada brightfield.</li>
	<li>Abrir uno de los mapas de probabilidad previamente guardado en Fiji. Trazar una línea recta en la barra de escala proporcionada el software de imágenes. Ir a analizar &#8594; establecer escala. Cambiar los parámetros (es decir, distancia conocida, unidad de longitud) a sus valores apropiados según lo dado por la barra de escala, a continuación, compruebe el &#34; Global &#34; caja para estandarizar la escala para cada imagen.</li>
	<li>Vaya a Plugins &#8594; Macros &#8594; ejecutar &#8594; Tyagi et al. fibra cuantificación macro.ijm (véase el Archivo suplementario). Inmediato, aparecerá un panel de navegación. Abre la imagen &#39; carpeta de host s; aparecerá un cuadro de diálogo. Para cada cuadro de diálogo, cambie el &#34; fondo &#34; desplegable valor a &#34; luz. &#34; Nota: la carpeta ahora se popularán con imágenes de los contornos de la fibra y archivos de software de hoja de cálculo de los resultados (diámetro de Feret y CSA son más pertinentes para cuantificar la morfología de la fibra; parámetros medidos pueden ajustarse en analizar las mediciones de conjunto). Datos de la morfología de fibra generados por la función del poro-análisis de Fiji serán transferidos automáticamente a los archivos de software de hoja de cálculo para ambas imágenes de campo fluorescente y brillante.</li>
	<li>Calcular la fracción de fibras expresando un determinado MyHC en un campo al dividir el número de fibras fluorescentes en el campo por el número de fibras totales en la correspondiente imagen de campo brillante.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

Los autores tienen intereses contradictorios a revelar.

Aquí, hemos proporcionado una dirección útil para la identificación de tipos de fibras de músculo esquelético. De esta manera, se describe un nuevo algoritmo para el análisis de los datos.
Puesto que en gran parte, nuestros resultados los anteriores informes5,8,10 confirman y reflejan nuestras propias mediciones manuales, el algoritmo parece ser exacta. Aún así, nos encontramos con algunas trampas exp...

Se ha sabido por una cierta hora que músculo esquelético se compone de fibras individuales de muchos tipos1. Inicialmente, dos grupos de fibras se caracterizaron basado en sus propiedades contráctiles y llamado, apropiadamente, contracción lenta (tipo I) y de contracción rápida (tipo II). Estas categorías se distinguen sobre la base de metabolismo de la fibra. Desde el tipo I fibras son ricas en mitocondrias y dependen del metabolismo oxidativo, se aclarado por sólidamente positiva de nicotinamida-adenin-dinucleótido-tetrazolio reductasa (NADH-TR) diaphorase2 o Succinato deshidrogenasa (SDH)3 de tinción. Por el contrario, exhiben menor fibras de tipo II y grados variables de NADH-TR diaphorase o SDH la coloración y se dividieron en dos subgrupos de contracción rápida (tipo IIA y tipo IIB) algo crudamente basados en su relativa capacidad oxidativa. Estas distinciones entre las fibras han sido visualizadas más eficazmente por miosina-ATPasa la coloración donde el tipo I fibras de manchan oscuras después de una preincubación a pH 4.0 y fibras de tipo IIB absorben precipitado siguiente preincubación a pH 10.0 con fibras de tipo IIA la coloración intermedio4.
Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de fibra tipo5. Tipo I, tipo IIA y tipo IIB fibras pueden ser todos identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC. Además, otro tipo metabólico intermedio fibra de contracción rápida, tipo IIX, ha sido identificado6. Las fibras híbridas expresando más MyHC también han sido confirmados5,7,8. Algunas especies como el gato y el Babuino se saben expresa tipo IIB MyHCs6. Aunque MyHC inmunotinción es actualmente la evaluación de estado de la técnica de la composición del músculo, el análisis de los datos obtenidos mediante esta técnica es engorrosa y requiere mucho tiempo sin asistencia automática. Para ello, un puñado de métodos semiautomáticos para analizar estos datos han sido desarrollados5,9,10. Aquí, presentamos un protocolo relativamente estándar para la identificación inmunohistoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, junto con una novela semi-automatizada algoritmo que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra con precisión.

<table><tbody><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% en PBS</td></tr><tr><td>Barrera hidrofóbica Pap Pen</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>de uñas L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Microscopio de fluorescencia invertida y campo claro</td><td>Descontinuado</td><td></td>SPOT RT/KE Soluciones de imagen SPOT RT940 Dell Optiplex BA-F8 Estudios del desarrollo de anticuerpos primarios Banco de hibridomas en la Universidad de Iowa ratón monoclonal IgG2b;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Banco</td><td>de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa</td><td></td><td>IgG1 de ratón monclonal; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3</td><td>Banco de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa</td><td></td><td>ratón monoclonal IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Banco</td><td>de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa</td><td></td><td>IgGM de ratón monoclonal; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>cabra anti-ratón; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>cabra anti-ratón; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>cabra anti-ratón; 1:200</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>isopentano</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>frío con nitrógeno líguido</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, diluido a 1x</td></tr><tr><td>Toallitas Kim</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Durante años, distinciones entre tipos de fibras de músculo esquelético se visualizaron mejor manchando de la miosina-ATPasa. Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX y fibras de tipo IIB ahora pueden ser identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC; sin embargo, manual análisis de estos datos puede ser lento y abajo-derecha tedioso. En este sentido, rápida y precisa evaluación de morfología y composición del tipo de fibra es una herramienta muy accesible. Aquí, presentamos un protocolo para la coloración de immunohistochemical de la estado-de-arte de MyHCs en secciones congeladas de músculo de ratón trasera junto con un algoritmo novela semi-automatizado que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra. Como era de esperar, el músculo de soleus muestra coloración para tipo I y tipo las fibras IIA, pero no para las fibras tipo IIX o tipo IIB. Por otro lado, el músculo anterior de tibialis fue compuesto predominante de fibras de tipo IIX y tipo IIB, una pequeña fracción de fibras de tipo IIA y poca o ninguna tipo I fibras. Varias transformaciones de imagen fueron utilizadas para generar mapas de probabilidad con el fin de medir diferentes aspectos de la morfología de la fibra (es decir, área de sección transversal (CSA), diámetro de Feret máximo y mínimo). Los valores obtenidos para estos parámetros entonces fueron comparados con los valores obtenidos manualmente. No hubo diferencias significativas se observaron entre ambos modos de análisis con respecto a la CSA, máxima o mínima diámetro de Feret (todos p &#62; 0.05), indicando la precisión de nuestro método. Así, nuestro protocolo de análisis de inmunotinción puede aplicarse a la investigación de los efectos en la composición de músculo en muchos modelos de envejecimiento y miopatía.

Miembro posterior los músculos (es decir, tibial anterior, sóleo) disecados de un ratón C57BL/6 Masculino de edad desconocida eran flashes congelado por hundir un molde de plástico que contiene el músculo en OCT en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Luego, usando un cryotome, secciones seriales de 8-10 μm fueron a-20 ° C y transferidas a vidrio cargado positivamente diferentes diapositivas12.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.

Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

El objetivo general de este protocolo es utilizar la inmunohistoquímica de última generación para identificar con precisión y rapidez los tipos de fibras del músculo esquelético. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología muscular, como si los cambios en el tipo de fibra son provocados por la pérdida de proteínas funcionales. Aunque este método puede ofrecer información sobre muchos modelos de enfermedades musculares, también puede utilizarse en sistemas como modelos de knock-in y knock-out para revelar el impacto mayor de una sola molécula en la función muscular básica.Para comenzar, seque al aire secciones congeladas de músculo de ratón sobre portaobjetos cargados durante aproximadamente media hora. Una vez secas, dibuje un borde alrededor de las secciones en cada portaobjeto utilizando un marcador PAP hidrofóbico. A continuación, para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos, agregue aproximadamente 250 microlitros de BSA al 5 % en PBS dentro de los bordes trazados e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora.Mientras tanto, prepare una dilución de uno a 50 del anticuerpo primario en PBS con BSA al 5%. Prepare aproximadamente 250 microlitros por portaobjetos y mantenga la dilución del anticuerpo en hielo. Después del período de bloqueo, aspire la solución de bloqueo de los portaobjetos y agregue alícuotas de 250 microlitros de la dilución del anticuerpo.Como control negativo, aplique 5 % de BSA en PBS sin el anticuerpo primario. A continuación, coloque una hoja de papel de filtro humedecido en la placa de Petri y cúbrala con papel de aluminio para crear una cámara de incubación. Luego incube las laminillas a cuatro grados Celsius durante 24 a 48 horas en la cámara o en un entorno similar con la misma humedad.Después de la incubación con el anticuerpo primario, aspire la solución de los portaobjetos y lave los portaobjetos tres veces. Para cada lavado, aplique aproximadamente 250 microlitros de BSA al 5 % en PBS durante unos 10 minutos. Mientras lava los portaobjetos, prepare diluciones de uno a 200 de los anticuerpos secundarios purificados conjugados con fluorocromo.Prepare al menos 250 microlitros por portaobjetos y mantenga la solución en la oscuridad y sobre hielo. Después del tercer lavado, agregue 250 microlitros de la dilución del anticuerpo secundario a los portaobjetos. Luego, incube los portaobjetos durante 90 minutos a temperatura ambiente en un ambiente húmedo y oscuro.Después de la incubación, aspire la solución de anticuerpos y lave los portaobjetos tres veces como antes. Después de eliminar todo el anticuerpo secundario en exceso, enjuague los portaobjetos con PBS y déjelos secar al aire durante 10 minutos. Por último, monte los portaobjetos utilizando un medio acuoso de baja viscosidad no permanente.Una vez que el medio se seque, selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y transfiera las preparaciones a una caja de almacenamiento opaca. Antes de obtener imágenes de una preparación, limpie el cubreobjetos con etanol al 70 %. Luego, obtenga imágenes digitales utilizando un microscopio de epifluorescencia.Bajo aumento bajo, seleccione un área de interés de un milímetro cuadrado. Para visualizar los anticuerpos conjugados con Alexa 488, utilice un filtro de paso largo de 505 nanómetros. Para visualizar los anticuerpos conjugados con Alexa 594, utilice un filtro de paso largo de 595 nanómetros.Con los filtros configurados correctamente, comience a capturar imágenes digitales. Asegúrese de incluir una barra de escala para el análisis posterior. Para el análisis, instale Fiji en el macro proporcionado con esta publicación.Guarde el archivo macro en un directorio de fácil acceso. Ahora, cargue una imagen de campo claro de una sección seleccionada y vaya a la opción de segmentación entrenable de Weka. Con el fin de delimitar las áreas celulares de la sección, dibuje una línea sobre una fibra y haga clic en agregar a la clase uno.Luego, para marcar los dominios extracelulares, dibuje una línea en el espacio entre las fibras y haga clic en agregar a la clase dos. Repita este proceso hasta que se hayan definido cinco a diez etiquetas de cada clase. Puede ser difícil marcar los límites intersticiales.El uso de la función de zoom permite marcar estos límites con mayor precisión. A continuación, seleccione la opción de entrenar el clasificador. En la superposición resultante de color rojo y verde, agregue manualmente más etiquetas a las partes de la imagen que fueron segmentadas incorrectamente por el proceso automatizado.Haga esto hasta que las fibras marcadas en rojo se separen adecuadamente de los espacios intermedios marcados en verde. Luego, haga clic en obtener probabilidad y guarde la imagen en una nueva carpeta de archivos. Ahora, repita todo el proceso utilizando la imagen fluorescente tomada del mismo campo.Etiquete las fibras inmunomarcadas como clase uno y todas las regiones no fluorescentes como clase dos. Finalmente, guarde el mapa de probabilidad resultante en la misma carpeta donde se almacenó la imagen de campo claro procesada. Ahora, abra uno de los mapas de probabilidad guardados previamente en Fiji.Dibuje una línea recta sobre la barra de escala proporcionada por el software de imagen. Seleccione establecer escala e introduzca los valores correctos según la barra de escala. Luego active la opción global para estandarizar la escala en cada imagen.Ahora, ejecute la macro Tyagi para la cuantificación de fibras y aparecerá el panel de navegación. Luego, abra la carpeta principal de las imágenes. En el cuadro de diálogo asociado, cambie el valor del menú desplegable de fondo a claro.La función de mediciones establecidas puede utilizarse para definir qué parámetros deben medirse. El área de la sección transversal (CSA) y el diámetro de las fibras son las medidas más relevantes para cuantificar la morfología de las fibras. Después de ejecutar la macro, la carpeta se llenará con imágenes de los contornos de las fibras y hojas de cálculo con las mediciones realizadas por la función de análisis deficiente.Los músculos tibial anterior y sóleo se analizaron utilizando los métodos descritos porque están compuestos principalmente por fibras de contracción rápida o de contracción lenta. Se identificaron varias cadenas pesadas de miosina diferentes mediante el uso de anticuerpos específicos. Una fracción considerable de las fibras musculares del sóleo expresó cadenas pesadas de miosina de tipo uno y tipo dos A, y una cantidad considerable del resto de las fibras fue positiva para el tipo dos X. En contraste, prácticamente no se observaron fibras de tipo dos B.En comparación, los músculos tibiales anteriores teñidos estaban compuestos principalmente por fibras de cadena pesada de miosina de tipo dos B y tipo dos X, con menores contribuciones de fibras que expresan cadenas de tipo dos A y prácticamente ninguna fibra que expresara cadenas de tipo uno. El análisis morfométrico de un músculo tibial anterior analizado con anticuerpos SC-71 dirigidos contra la cadena pesada de miosina de tipo dos A proporcionó varias transformaciones de imagen utilizadas para crear mapas de probabilidad. A partir de este sencillo análisis automatizado, los datos resultaron completamente comparables con los generados mediante cálculos manuales mucho más tediosos.En conjunto, el análisis proporcionó datos de aproximadamente 6.000 fibras individuales en total. El alto rendimiento de datos facilitó considerablemente el análisis estadístico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar inmunotinción en secciones musculares y utilizar el software semiautomatizado proporcionado para facilitar el análisis del tipo y la composición de las fibras musculares.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que el músculo puede ser regionalmente heterogéneo y que se requiere el análisis de muchos campos musculares para una evaluación rigurosa del tipo y composición de las fibras musculares. En combinación con este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la tinción con tricrómica para responder preguntas adicionales, como si el desarrollo de fibrosis ocurre en paralelo con los cambios en la composición del tipo de fibra.

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Medicina

Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

Aquí, se presenta un protocolo para análisis rápido de la fibra muscular, lo que permite mejorar la calidad de la tinción, y la adquisición de ese modo automático y la cuantificación de las poblaciones de fibra utilizando el ImageJ software disponible libremente.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.

Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Este protocolo demuestra el aislamiento de una sola fibra del músculo esquelético humano liofilizado y la clasificación del tipo de fibra de acuerdo con la isoforma de la cadena pesada de miosina (MHC) utilizando la técnica de transferencia de puntos. Las muestras de fibra MHC I y II identificadas se pueden analizar más a fondo para detectar diferencias específicas del tipo de fibra en la expresión de proteínas mediante Western blot.

Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Inyecciones locales de un marcador mitocondrial con marcador mitocondrial terminal de células de Schwann en vivo para microscopía confocal. Este método utiliza pruebas de concepto demostradas en tejido muscular esquelético de ratones con músculo sano o enfermo para proporcionar una visualización mitocondrial de alta resolución.

Métodos para la cuantificación in situ de la morfología mitocondrial en células musculares y terminales de Schwann de ratones

Un conjunto de straight-forward de los métodos para aislar y determinar la identidad de las proteínas más abundantes se expresa en el músculo esquelético. Cerca de 800 puntos se vislumbran en un gel bidimensional de los músculos de 10 mg, lo que permite la determinación de los específicos de género expresión de la proteína. Estos métodos dan resultados equivalentes en la mayoría de los tejidos.

Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

Aprende un protocolo de inmunohistoquímica semi-automatizado para identificar tipos de fibras musculares esqueléticas en ratón. Este método permite analizar la morfología y composición de fibras con alta precisión y velocidad.

Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

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