Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo funcional sobre cómo elucidar el epítopo de un anticuerpo monoclonal neutralizante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la virología que permitan definir las interacciones entre el huésped y el virus, desarrollar terapéuticas y herramientas diagnósticas, todo lo cual puede contribuir al diseño de vacunas. La principal ventaja de esta técnica es que puede realizarse con técnicas básicas de cultivo celular y biología molecular, sin necesidad de instrumentos o equipos especiales.

El procedimiento será demostrado por Mark Bailey, estudiante de medicina y doctorado del laboratorio de Peter Palese. Comience este procedimiento con la caracterización de los anticuerpos basada en la inhibición de la hemoaglutinación, o IH, y en actividades de neutralización, tal como se describe en el protocolo escrito. Los anticuerpos neutralizantes que presentan actividad de IH se analizan posteriormente preparando primero cuatro diluciones del anticuerpo de interés en concentraciones crecientes en PBS al uno por uno, en un volumen de 100 microlitros por dilución.

A continuación, prepare un stock de virus de un millón de unidades formadoras de placas por mililitro en un volumen de 400 microlitros de PBS al 1×. Luego, mezcle 100 microlitros de un millón de unidades formadoras de placas por mililitro de virus con 100 microlitros de cada dilución de anticuerpo o con 100 microlitros de PBS al 1×. Incube las muestras durante una hora en un incubador a 37 °C con 5 % de dióxido de carbono.

Después de agitar brevemente en vórtex, inyecte 200 microlitros de cada mezcla en huevos embrionados de pollo libres de patógenos específicos. A continuación, incube los huevos a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante 40 a 44 horas. Tras la incubación, sacrifique los huevos embrionados infectados con el virus colocándolos a cuatro grados Celsius durante un mínimo de seis horas.

A continuación, recolecte el líquido alantóideo de los huevos según lo descrito previamente. Finalmente, confirme las variantes de escape realizando el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI) según se describe en el protocolo del texto. Para generar variantes de escape frente a anticuerpos neutralizantes que carecen de actividad HI, el virus debe ser pasado en presencia de cantidades crecientes de anticuerpo.

Siembre células MDCK en una placa de seis pocillos a una densidad de un millón de células por pocillo. Incube las células durante un mínimo de cuatro horas en un incubador a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Mientras tanto, diluya el stock de virus hasta un millón de unidades formadoras de placas por mililitro.

Prepare una dilución única de anticuerpo a 0,02 miligramos por mililitro en MEM 1x con tripsina tratada con TPCK en un volumen de 250 microlitros. Utilice concentraciones más altas de anticuerpo para todos los pases siguientes. Mezcle 250 microlitros de virus diluido con 250 microlitros de anticuerpo diluido, o 250 microlitros de MEM 1x como control sin anticuerpo.

Incube la mezcla de virus y anticuerpo durante 30 minutos en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Tras la incubación de las células, aspire el medio utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y lave la monocapa celular con un mililitro de PBS al 1×. Añada 500 microlitros de las mezclas en los pocillos antes de incubar en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante una hora.

Después de una hora, suplemente los pocillos con dos mililitros de MEM al uno por ciento con tripsina tratada con TPCK. Revise las células a las 48 horas posteriores a la infección en busca de signos del efecto citopático, o CPE, al microscopio, o realice un ensayo de hemaglutinación para detectar crecimiento viral. Si hay crecimiento CPE en el cultivo suplementado con anticuerpo, recolecte el sobrenadante en múltiples criotubos.

Etiquete los tubos con el número de pase y almacénelos a menos 80 grados Celsius. Guarde 100 microlitros del sobrenadante para infectar una monocapa fresca de MDCK con dos mililitros de MEM uno por suplementado con tripsina TPCK y anticuerpo. Recuerde incluir un control sin anticuerpo para cada pase.

Aumente la concentración del anticuerpo en cada paso sucesivo hasta que el crecimiento viral siga siendo viable, incluso con la concentración final de 0,6 miligramos por mililitro de anticuerpo. Congele múltiples viales del sobrenadante de cada paso y almacénelos a menos 80 grados Celsius. Continúe con el aislamiento y el análisis de las variantes escapadas según se describe en el protocolo del texto.

Los anticuerpos inducidos por vacunas, aislados de individuos vacunados con la vacuna candidata contra la influenza A H7N9, se utilizaron para generar variantes de mutantes de escape. El mapeo de mutantes de escape reveló que muchos de los anticuerpos reconocieron residuos críticos en ubicaciones distintas en la HA viral. Cada residuo, indicado en rojo, representa la ubicación de aminoácidos críticos necesarios para la unión eficiente de un anticuerpo monoclonal, mientras que la mayoría de los anticuerpos positivos en HI presentaron residuos de mutantes de escape cerca de sitios antigénicos previamente descritos en la H7HA. Los anticuerpos negativos en HI generaron mutantes de escape con mutaciones puntuales en la región del tallo.

Una vez dominada, esta técnica puede aplicarse para elucidar los determinantes estructurales de la protección frente a otros patógenos. Esta técnica no se limita únicamente a la generación de variantes de escape de anticuerpos monoclonales, sino que también puede utilizarse contra compuestos antivirales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elucidar el epítopo de unión de los anticuerpos monoclonales mediante la generación de variantes de escape in vitro.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener precaución al trabajar con virus y utilizar el equipo de protección personal adecuado.