Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo de trabajo sobre cómo dilucidar el epítopo de un anticuerpo monoclonal neutralizante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la virología que pueden ayudar a definir las interacciones del virus huésped, desarrollar terapias y herramientas de diagnóstico, todo lo cual puede ayudar en el diseño de vacunas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar con técnicas básicas de cultivo de tejidos y biología molecular sin necesidad de instrumentos o equipos especiales.

Bailey, MD, estudiante de doctorado del laboratorio de Peter Palese, demostrará el procedimiento. Comience este procedimiento con la caracterización de los anticuerpos basada en la inhibición de la hemoaglutinación, o HI, y las actividades de neutralización como se describe en el protocolo de texto. Los anticuerpos neutralizantes que tienen actividad HI se analizan más a fondo preparando primero cuatro diluciones del anticuerpo de interés en concentraciones crecientes en un PBS multiplicado en un volumen de 100 microlitros por dilución.

A continuación, prepare un stock de virus de un millón de unidades formadoras de placas por mililitro en un volumen de PBS de 400 microlitros. Luego, mezcle 100 microlitros de un millón de unidades formadoras de placas por mililitro de virus con 100 microlitros de cada dilución de anticuerpo o 100 microlitros de una vez PBS. Incubar las muestras durante una hora en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Después de un breve vórtice, inyecte 200 microlitros de cada mezcla en huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos. Luego, incuba los huevos a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono durante 40 a 44 horas. Después de la incubación, sacrifique los huevos embrionados infectados con el virus colocándolos a cuatro grados centígrados durante un mínimo de seis horas.

A continuación, extraiga el líquido alantoico de los huevos como se describió anteriormente. Por último, confirme las variantes de escape realizando el ensayo HI como se describe en el protocolo de texto. Para generar variantes de escape contra anticuerpos neutralizantes que carecen de actividad HI, el virus debe pasar en presencia de cantidades crecientes de anticuerpos.

Placa de células MDCK en una placa de seis pocillos a una densidad de un millón de células por pocillo. Incubar las células durante un mínimo de cuatro horas en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Mientras tanto, diluya el stock de virus a un millón de unidades formadoras de placas por mililitro.

Prepare una dilución única de anticuerpo a 0,02 miligramos por mililitro en una vez MEM con tripsina tratada con TPCK en un volumen de 250 microlitros. Use concentraciones de anticuerpos más altas para todos los pasajes siguientes. Mezcle 250 microlitros de virus diluido con 250 microlitros de anticuerpo diluido, o 250 microlitros de MEM como control sin anticuerpos.

Incubar la mezcla de anticuerpos del virus durante 30 minutos en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación de las células, aspire el medio con una pipeta Pasteur de vidrio y lave la monocapa de células con un mililitro de PBS una vez. Agregue 500 microlitros de las mezclas en los pocillos antes de incubar en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora.

Después de una hora, suplementar los pocillos con dos mililitros de MEM con tripsina tratada con TPCK. Revise las células a las 48 horas después de la infección en busca de signos del efecto citopático, o CPE, en el microscopio, o realice un ensayo de hemoaglutinación para detectar un crecimiento viral. Si hay CPE de crecimiento en el cultivo suplementado con anticuerpos, coseche el sobrenadante en múltiples criotubos.

Etiquete los tubos con el número de paso y guárdelos a menos 80 grados centígrados. Guarde 100 microlitros del sobrenadante para infectar una nueva monocapa de MDCKs con dos mililitros de MEM una vez suplementado con TPCK, tripsina y anticuerpo. Recuerde incluir un control sin anticuerpos para cada paso.

Aumentar la concentración del anticuerpo en cada paso sucesivo hasta que el crecimiento del virus siga siendo viable, incluso con la concentración final de 0,6 miligramos por mililitro de anticuerpo. Congele los múltiples viales de sobrenadante de cada pasaje y guárdelos a menos 80 grados centígrados. Continúe con el aislamiento y el análisis de las variantes de escape como se detalla en el protocolo de texto.

Los anticuerpos inducidos por la vacuna aislados de individuos vacunados con la vacuna candidata contra la influenza A H7N9 se utilizaron para generar variantes mutantes de escape. El mapeo de mutantes de escape reveló que muchos de los anticuerpos reconocían residuos críticos en distintos lugares del HA viral. Cada residuo, indicado en rojo, representa la ubicación de los aminoácidos críticos necesarios para la unión eficiente de un anticuerpo monoclonal, mientras que la mayoría de los anticuerpos HI positivos han escapado de los residuos mutantes cerca de los sitios antigénicos previamente informados del H7HA. Los anticuerpos HI-negativos generaron mutantes de escape con mutaciones puntuales en la región de stock.

Una vez dominada, esta técnica se puede aplicar para dilucidar los determinantes estructurales de la protección contra otros patógenos. Esta técnica no solo se limita a generar variantes de escape de anticuerpos monoclonales, sino también contra compuestos antivirales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo dilucidar el epítopo de unión de los anticuerpos monoclonales mediante la generación de variantes de escape in vitro.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener cuidado al trabajar con virus y utilizar el equipo de protección personal adecuado.