Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas
December 5th, 2017
Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.
El objetivo general de este procedimiento es utilizar arterias de resistencia aisladas para probar la reactividad de los vasos a los estímulos vasoactivos. También mostrará cómo evaluar los cambios en los mecanismos de control del músculo liso y las propiedades mecánicas pasivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular con respecto a los mecanismos de control del músculo liso endotelial y vascular en arterias de pequeña resistencia durante diversas afecciones.
La principal ventaja de esta técnica es que las arterias de pequeña resistencia pueden aislarse del entorno de las células parenquimatosas y mantenerse a su presión normal mientras se prueban las respuestas a los estímulos vasoactivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de la disfunción vascular. Este tipo de manipulación no es posible in vivo.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la enfermedad vascular periférica, también se puede aplicar a la enfermedad de las arterias coronarias. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la microcanulación son difíciles de aprender debido a la delicadeza del procedimiento y a la necesidad de evitar dañar la arteria. El día del experimento, prepare dos litros de una solución salina fisiológica en un matraz Erlenmeyer de dos litros.
Al agregar el material tampón 20X, asegúrese de que la solución se equilibre continuamente con la mezcla de gases y agite con una barra de agitación magnética. A continuación, observe el pH mientras agrega 0,28 gramos de fosfato monosódico a la mezcla. Según sea necesario, espolvoree el pH añadiendo gotas de ácido clorhídrico normal (6) o de solución de hidróxido de sodio normal (6,5) de una pipeta Pasteur para que el pH se mantenga en 7,4.
A continuación, añada 1,98 gramos de glucosa a la solución salina fisiológica. A continuación, prepare 500 mililitros de una solución salina fisiológica sin calcio diluyendo la solución madre 20X en agua desionizada. A continuación, añada 25 mililitros del material tampón 20X en un matraz Erlenmeyer y añada 0,07 gramos de fosfato monosódico a la solución mientras controla y ajusta el pH de la solución.
Use un tubo de tetrafluoroetileno para conectar un tanque de gas que contenga la mezcla de gas adecuada al baño de órganos. Burbujear continuamente la solución a una velocidad suficiente para asegurar un burbujeo continuo, pero no turbulento, de la solución que fluye hacia la cámara del recipiente. Además, coloque una pequeña piedra difusora conectada a la mezcla de gases de equilibrio en la cámara del recipiente para ayudar a mantener la composición gaseosa de la solución salina fisiológica.
Coloque la solución salina fisiológica en una botella Mariotte de dos litros. Agregue un tubo de vidrio central a un tapón para que sirva como un depósito que entregará continuamente la solución salina fisiológica al baño de órganos farmacológicos que suministra la solución a la cámara del recipiente. Coloque la abertura del tubo de vidrio central en el frasco Mariotte al mismo nivel que la parte superior de la solución salina fisiológica en el baño de órganos.
Esto asegurará una presión hidrostática constante para la entrega de la solución salina fisiológica en el baño de órganos. Utilice un tubo de polietileno conectado a un tubo de vidrio en forma de J para administrar la solución salina fisiológica desde el frasco de Mariotte hasta el baño de órganos. Para la profusión lumenal, utilice un tubo de polietileno para conectar la pipeta de entrada a un depósito de solución salina fisiológica compuesto por una jeringa de plástico de 66 CC elevada a una posición que mantenga la presión de entrada deseada.
Controle la presión conectando un transductor de presión al sistema a través de una llave de paso. A continuación, conecte la pipeta de salida a un tubo de polietileno a un depósito similar al depósito de entrada para permitir que la solución salina fisiológica fluya a través del recipiente en respuesta a un gradiente de presión. Además, use una llave de paso similar y una conexión de transductor de presión para monitorear la presión de salida.
Retire el cerebro de una rata Sprague Dawley y colóquelo en posición supina en una placa de Petri de vidrio llena de solución salina fisiológica helada. Luego, coloque el plato debajo de un estereoscopio. Use un par de tijeras Vannas y una pinza Dumont número cinco de punta fina para extirpar las arterias cerebrales medias del cerebro.
Luego, limpie cualquier tejido cerebral residual de la arteria cerebral media con las pinzas. Transfiera la arteria a la cámara del vaso sosteniéndola suavemente por el extremo del segmento extirpado y colóquela cuidadosamente en la cámara. A continuación, enrosque la arteria cerebral en la micropipeta de entrada tirando de ella hacia la base de la pipeta hasta que la punta avance hacia el lumen de la arteria.
Asegure la arteria en la pipeta de entrada atando un lazo preparado a partir de una fibra de una sola hebra previamente cardada con suturas 10-0 alrededor de la arteria. A continuación, fije el extremo opuesto de la arteria cerebral media a la pipeta de salida apretando un segundo bucle de sutura alrededor del vaso y utilice el micrómetro conectado al soporte de pipeta de entrada para estirar la arteria hasta su longitud in situ. Ate todas las ramas laterales con hebras individuales marcadas con suturas 10-0 para mantener una presión constante en la arteria.
A continuación, configure un microscopio de video que consta de una cámara de video conectada a un microscopio de disección que está conectada a un micrómetro de video y un monitor de televisión. Utilice esta configuración para medir el diámetro interno de la arteria. Evaluar el tono miogénico y las respuestas de los vasos a los estímulos vasodilatadores asegurándose de que la arteria exhibe un nivel adecuado de tono activo antes del experimento.
Deseche las arterias que carezcan de tono activo en reposo, con la excepción de los vasos, como las pequeñas arterias mesentéricas, que normalmente no exhiben tono activo en reposo. A continuación, agregue concentraciones crecientes de acetilcolina a la cámara del vaso y mida los diámetros de los vasos para probar la reactividad dependiente del endotelio de la arteria de resistencia cánula. En este ejemplo, la arteria exhibe disfunción endotelial como lo demuestra su incapacidad para dilatarse en respuesta a la acetilcolina.
Al final del experimento, determine el diámetro máximo de la arteria agregando una solución salina fisiológica sin calcio al perfusionado y superfusado. Utilice esta medida para calcular el porcentaje de tono en reposo activo. La demostración de una dilatación máxima en una solución salina fisiológica libre de calcio verifica que el fracaso de la arteria para dilatarse en respuesta a la acetilcolina se debió a una disfunción endotelial y no a una incapacidad de la arteria para relajarse debido a una remodelación estructural del vaso.
Esta figura ilustra las respuestas al vasodilatador dependiente del endotelio acetilcolina en arterias cerebrales medias aisladas de ratas macho sensibles a la sal de Dahl en las tres cepas congénitas estrechadas. Esto muestra que la dilatación dependiente del endotelio a la acetilcolina estaba ausente en la cepa parental sensible a la sal y en las dos cepas congénitas que conservaban el alelo Renan sensible a la sal. Se restableció la dilatación normal en la cepa congénita portadora del alelo marrón Renan de Noruega en el fondo genético sensible a la sal, lo que apoya la hipótesis de que la disfunción endotelial en ratas SS se debe a una regulación alterada del gen Renan.
En este experimento, el fracaso de la dieta alta en sal para eliminar la dilatación dependiente del endotelio a la acetilcolina en una cepa particular de rata, los hallazgos sobre los contribuyentes al estrés oxidativo vascular y la disfunción endotelial durante las elevaciones en la ingesta de sal en la dieta. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en tres a 3 1/2 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular la arteria aislada con mucho cuidado para evitar daños en el músculo liso y especialmente en el endotelio.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la adición de agonistas vasoconstrictores y vasodilatadores o antagonistas de los receptores, con el fin de responder a preguntas como los mecanismos que afectan a la reactividad vascular a diferentes sustancias y los mecanismos de acción de los fármacos sobre los vasos sanguíneos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biología vascular y la fisiología microcirculatoria exploraran el músculo liso y la función endotelial en arterias de resistencia de diferentes lechos vasculares de animales de experimentación y humanos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar este método para evaluar los mecanismos de control del músculo liso endotelial y vascular en arterias de pequeña resistencia de diferentes lechos vasculares.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visión general
Este manuscrito presenta protocolos de microscopía de video in vitro para evaluar la función vascular en arterias de resistencia cerebral de rata. También detalla técnicas para evaluar la densidad de microvasos y la perfusión del tejido.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología vascular
- Función microvascular
- Mecanismos de control endotelial y muscular liso
Antecedentes
- Las arterias de resistencia juegan un papel crucial en la regulación del flujo sanguíneo.
- Entender la reactividad de los vasos a los estímulos vasoactivos es esencial para la investigación vascular.
- Las arterias aisladas pueden proporcionar información sobre la función vascular sin complicaciones in vivo.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar el conocimiento de la disfunción vascular y sus implicaciones para la terapia.
Propósito del estudio
- Evaluar la reactividad de los vasos en arterias de resistencia aisladas.
- Evaluar cambios en los mecanismos de control del músculo liso.
- Investigar las propiedades mecánicas pasivas de las arterias de pequeña resistencia.
Métodos utilizados
- Protocolos de microscopía de video in vitro.
- Lectina marcada con fluorescencia para la evaluación de la densidad de microvasos.
- Fluorimetria de flujo láser Doppler para evaluar la perfusión del tejido.
- Aislamiento de arterias de resistencia para mantener la presión normal durante las pruebas.
Resultados principales
- Demostró la capacidad de aislar arterias de resistencia de su entorno.
- Mostró cómo probar las respuestas a los estímulos vasoactivos de manera efectiva.
- Proporcionó información sobre las interacciones endotelial y muscular lisa vascular.
- Destacó las implicaciones para el diagnóstico de la disfunción vascular.
Conclusiones
- Esta técnica permite un estudio detallado de la función vascular en un entorno controlado.
- Puede conducir a avances en la comprensión de las enfermedades vasculares.
- Los hallazgos pueden informar acercamiento terapéuticos para la disfunción vascular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of vascular targets by isolating resistance arteries from confounding parenchymal influences, providing predictive confidence in endothelial and smooth muscle control mechanisms. It supports target validation in preclinical models by maintaining physiological pressure and allowing direct assessment of vasoactive responses. The approach bridges molecular reductionist findings with integrative vascular physiology, enhancing translational relevance for cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing endothelial-dependent and independent vasodilator pathways in isolated resistance arteries.
- Operational Value: Enables functional target validation by assessing changes in smooth muscle control mechanisms and passive mechanical properties under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying vascular phenotypes linked to specific genetic backgrounds, such as Renan allele regulation in salt-sensitive hypertension models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline vascular tone and reactivity profiles.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through pressure-controlled perfusion and video microscopy-based diameter measurements.
- Scalability: Highlights platform reuse across vascular beds and genetically engineered rat strains for consistent compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Discusses application to peripheral and coronary artery disease models through evaluation of endothelial dysfunction in genetically defined rat strains.
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by using techniques applicable to both isolated vessels and in vivo perfusion assessments via Laser Doppler Flowmetry.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by distinguishing endothelial dysfunction from structural remodeling via calcium-free solution-induced maximal dilation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, supporting mechanistic insight before compound screening in vascular biology programs.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of endothelial and vascular smooth muscle control mechanisms in small-resistance arteries under various conditions.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible isolation and cannulation techniques that maintain arterial integrity for consistent vasoactive stimulus testing.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements (internal diameter changes via video microscopy) that enable comparison of vasodilator and vasoconstrictor responses.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through parallel use of Laser Doppler Flowmetry for tissue perfusion and fluorescent lectin labeling for microvessel density in related vascular studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability across vascular beds and rat strains, reducing redundant model development in cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vascular control pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of isolated artery preparations for consistent pharmacological profiling.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by confirming target engagement in physiologically relevant ex vivo models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on confirmed endothelial function and smooth muscle responsiveness in disease-relevant genetic models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microvascular dissection, cannulation techniques, and video microscopy operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including pressure-regulated perfusion systems, video microscopes with micrometers, and pressure transducers.
- Cross-team standardization requirements for arterial isolation, suture ligation, and pressure maintenance protocols across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, including adjustment of perfusion pressures and solution compositions for different vascular beds and species.
- Practical limitations supported by source material: delicate microcannulation steps require significant training to avoid endothelial or smooth muscle damage, and arteries lacking active resting tone (e.g., small mesenteric arteries) may be excluded from tone-dependent analyses.
