Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas
5 de diciembre de 2017
Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.
El objetivo general de este procedimiento es utilizar arterias de resistencia aisladas para probar la reactividad de los vasos a los estímulos vasoactivos. También mostrará cómo evaluar los cambios en los mecanismos de control del músculo liso y las propiedades mecánicas pasivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular con respecto a los mecanismos de control del músculo liso endotelial y vascular en arterias de pequeña resistencia durante diversas afecciones.
La principal ventaja de esta técnica es que las arterias de pequeña resistencia pueden aislarse del entorno de las células parenquimatosas y mantenerse a su presión normal mientras se prueban las respuestas a los estímulos vasoactivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de la disfunción vascular. Este tipo de manipulación no es posible in vivo.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la enfermedad vascular periférica, también se puede aplicar a la enfermedad de las arterias coronarias. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la microcanulación son difíciles de aprender debido a la delicadeza del procedimiento y a la necesidad de evitar dañar la arteria. El día del experimento, prepare dos litros de una solución salina fisiológica en un matraz Erlenmeyer de dos litros.
Al agregar el material tampón 20X, asegúrese de que la solución se equilibre continuamente con la mezcla de gases y agite con una barra de agitación magnética. A continuación, observe el pH mientras agrega 0,28 gramos de fosfato monosódico a la mezcla. Según sea necesario, espolvoree el pH añadiendo gotas de ácido clorhídrico normal (6) o de solución de hidróxido de sodio normal (6,5) de una pipeta Pasteur para que el pH se mantenga en 7,4.
A continuación, añada 1,98 gramos de glucosa a la solución salina fisiológica. A continuación, prepare 500 mililitros de una solución salina fisiológica sin calcio diluyendo la solución madre 20X en agua desionizada. A continuación, añada 25 mililitros del material tampón 20X en un matraz Erlenmeyer y añada 0,07 gramos de fosfato monosódico a la solución mientras controla y ajusta el pH de la solución.
Use un tubo de tetrafluoroetileno para conectar un tanque de gas que contenga la mezcla de gas adecuada al baño de órganos. Burbujear continuamente la solución a una velocidad suficiente para asegurar un burbujeo continuo, pero no turbulento, de la solución que fluye hacia la cámara del recipiente. Además, coloque una pequeña piedra difusora conectada a la mezcla de gases de equilibrio en la cámara del recipiente para ayudar a mantener la composición gaseosa de la solución salina fisiológica.
Coloque la solución salina fisiológica en una botella Mariotte de dos litros. Agregue un tubo de vidrio central a un tapón para que sirva como un depósito que entregará continuamente la solución salina fisiológica al baño de órganos farmacológicos que suministra la solución a la cámara del recipiente. Coloque la abertura del tubo de vidrio central en el frasco Mariotte al mismo nivel que la parte superior de la solución salina fisiológica en el baño de órganos.
Esto asegurará una presión hidrostática constante para la entrega de la solución salina fisiológica en el baño de órganos. Utilice un tubo de polietileno conectado a un tubo de vidrio en forma de J para administrar la solución salina fisiológica desde el frasco de Mariotte hasta el baño de órganos. Para la profusión lumenal, utilice un tubo de polietileno para conectar la pipeta de entrada a un depósito de solución salina fisiológica compuesto por una jeringa de plástico de 66 CC elevada a una posición que mantenga la presión de entrada deseada.
Controle la presión conectando un transductor de presión al sistema a través de una llave de paso. A continuación, conecte la pipeta de salida a un tubo de polietileno a un depósito similar al depósito de entrada para permitir que la solución salina fisiológica fluya a través del recipiente en respuesta a un gradiente de presión. Además, use una llave de paso similar y una conexión de transductor de presión para monitorear la presión de salida.
Retire el cerebro de una rata Sprague Dawley y colóquelo en posición supina en una placa de Petri de vidrio llena de solución salina fisiológica helada. Luego, coloque el plato debajo de un estereoscopio. Use un par de tijeras Vannas y una pinza Dumont número cinco de punta fina para extirpar las arterias cerebrales medias del cerebro.
Luego, limpie cualquier tejido cerebral residual de la arteria cerebral media con las pinzas. Transfiera la arteria a la cámara del vaso sosteniéndola suavemente por el extremo del segmento extirpado y colóquela cuidadosamente en la cámara. A continuación, enrosque la arteria cerebral en la micropipeta de entrada tirando de ella hacia la base de la pipeta hasta que la punta avance hacia el lumen de la arteria.
Asegure la arteria en la pipeta de entrada atando un lazo preparado a partir de una fibra de una sola hebra previamente cardada con suturas 10-0 alrededor de la arteria. A continuación, fije el extremo opuesto de la arteria cerebral media a la pipeta de salida apretando un segundo bucle de sutura alrededor del vaso y utilice el micrómetro conectado al soporte de pipeta de entrada para estirar la arteria hasta su longitud in situ. Ate todas las ramas laterales con hebras individuales marcadas con suturas 10-0 para mantener una presión constante en la arteria.
A continuación, configure un microscopio de video que consta de una cámara de video conectada a un microscopio de disección que está conectada a un micrómetro de video y un monitor de televisión. Utilice esta configuración para medir el diámetro interno de la arteria. Evaluar el tono miogénico y las respuestas de los vasos a los estímulos vasodilatadores asegurándose de que la arteria exhibe un nivel adecuado de tono activo antes del experimento.
Deseche las arterias que carezcan de tono activo en reposo, con la excepción de los vasos, como las pequeñas arterias mesentéricas, que normalmente no exhiben tono activo en reposo. A continuación, agregue concentraciones crecientes de acetilcolina a la cámara del vaso y mida los diámetros de los vasos para probar la reactividad dependiente del endotelio de la arteria de resistencia cánula. En este ejemplo, la arteria exhibe disfunción endotelial como lo demuestra su incapacidad para dilatarse en respuesta a la acetilcolina.
Al final del experimento, determine el diámetro máximo de la arteria agregando una solución salina fisiológica sin calcio al perfusionado y superfusado. Utilice esta medida para calcular el porcentaje de tono en reposo activo. La demostración de una dilatación máxima en una solución salina fisiológica libre de calcio verifica que el fracaso de la arteria para dilatarse en respuesta a la acetilcolina se debió a una disfunción endotelial y no a una incapacidad de la arteria para relajarse debido a una remodelación estructural del vaso.
Esta figura ilustra las respuestas al vasodilatador dependiente del endotelio acetilcolina en arterias cerebrales medias aisladas de ratas macho sensibles a la sal de Dahl en las tres cepas congénitas estrechadas. Esto muestra que la dilatación dependiente del endotelio a la acetilcolina estaba ausente en la cepa parental sensible a la sal y en las dos cepas congénitas que conservaban el alelo Renan sensible a la sal. Se restableció la dilatación normal en la cepa congénita portadora del alelo marrón Renan de Noruega en el fondo genético sensible a la sal, lo que apoya la hipótesis de que la disfunción endotelial en ratas SS se debe a una regulación alterada del gen Renan.
En este experimento, el fracaso de la dieta alta en sal para eliminar la dilatación dependiente del endotelio a la acetilcolina en una cepa particular de rata, los hallazgos sobre los contribuyentes al estrés oxidativo vascular y la disfunción endotelial durante las elevaciones en la ingesta de sal en la dieta. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en tres a 3 1/2 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular la arteria aislada con mucho cuidado para evitar daños en el músculo liso y especialmente en el endotelio.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la adición de agonistas vasoconstrictores y vasodilatadores o antagonistas de los receptores, con el fin de responder a preguntas como los mecanismos que afectan a la reactividad vascular a diferentes sustancias y los mecanismos de acción de los fármacos sobre los vasos sanguíneos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biología vascular y la fisiología microcirculatoria exploraran el músculo liso y la función endotelial en arterias de resistencia de diferentes lechos vasculares de animales de experimentación y humanos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar este método para evaluar los mecanismos de control del músculo liso endotelial y vascular en arterias de pequeña resistencia de diferentes lechos vasculares.
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Descripción general
Este manuscrito presenta protocolos de microscopía de video in vitro para evaluar la función vascular en arterias cerebrales de resistencia de rata. También detalla técnicas para evaluar la densidad de microvasos y la perfusión tisular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vascular
- Función microvascular
- Mecanismos de control endotelial y del músculo liso
Antecedentes
- Las arterias de resistencia desempeñan un papel crucial en la regulación del flujo sanguíneo.
- Comprender la reactividad del vaso frente a estímulos vasoactivos es esencial para la investigación vascular.
- Las arterias aisladas pueden proporcionar información sobre la función vascular sin las complicaciones in vivo.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar el conocimiento sobre la disfunción vascular y sus implicaciones para la terapia.
Objetivo del estudio
- Evaluar la reactividad vascular en arterias de resistencia aisladas.
- Evaluar los cambios en los mecanismos de control del músculo liso.
- Investigar las propiedades mecánicas pasivas de las arterias pequeñas de resistencia.
Métodos Utilizados
- Protocolos de microscopía de video in vitro.
- Lectina marcada con fluorescencia para la evaluación de la densidad de microvasos.
- Flujo Doppler láser para evaluar la perfusión tisular.
- Aislamiento de arterias de resistencia para mantener la presión normal durante las pruebas.
Resultados principales
- Demuestra la capacidad de aislar arterias resistentes de su entorno.
- Muestra cómo probar eficazmente las respuestas a estímulos vasoactivos.
- Proporciona conocimientos sobre las interacciones entre el endotelio y el músculo liso vascular.
- Destaca las implicaciones para el diagnóstico de la disfunción vascular.
Conclusiones
- Esta técnica permite el estudio detallado de la función vascular en un entorno controlado.
- Puede conducir a avances en la comprensión de las enfermedades vasculares.
- Los hallazgos podrían orientar enfoques terapéuticos para la disfunción vascular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la eliminación mecanicista de riesgos asociados a objetivos vasculares mediante el aislamiento de arterias de resistencia de influencias parenquimatosas confusas, proporcionando una confianza predictiva en los mecanismos de control endotelial y del músculo liso. Apoya la validación de objetivos en modelos preclínicos al mantener la presión fisiológica y permitir la evaluación directa de las respuestas vasoactivas. Este enfoque conecta hallazgos reduccionistas moleculares con la fisiología vascular integradora, mejorando la relevancia traslacional para el descubrimiento de fármacos cardiovasculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de vías vasodilatadoras dependientes e independientes del endotelio en arterias de resistencia aisladas.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos al evaluar cambios en los mecanismos de control del músculo liso y en las propiedades mecánicas pasivas bajo condiciones controladas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar fenotipos vasculares asociados a fondos genéticos específicos, como la regulación del alelo Renan en modelos de hipertensión sensible a la sal.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el establecimiento de perfiles de tono vascular y reactividad basales.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante perfusión controlada por presión y mediciones del diámetro basadas en microscopía de video.
- Escalabilidad: Destaca la reutilización de la plataforma en diferentes lechos vasculares y cepas de ratas modificadas genéticamente para la evaluación consistente de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Analiza la aplicación a modelos de enfermedad arterial periférica y coronaria mediante la evaluación de la disfunción endotelial en cepas de ratas con definición genética.
- Continuidad traslacional: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando técnicas aplicables tanto a vasos aislados como a evaluaciones de perfusión in vivo mediante fluometría láser Doppler.
- Avance ajustado al riesgo: Aborda la reducción mecanicista del riesgo al distinguir la disfunción endotelial del remodelado estructural mediante la dilatación máxima inducida por soluciones libres de calcio.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos, facilitando una comprensión mecanicista antes del cribado de compuestos en programas de biología vascular.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos de control endotelial y del músculo liso vascular en arterias de resistencia pequeñas bajo diversas condiciones.
- Selección: Describe la preparación del ensayo mediante técnicas reproducibles de aislamiento y canulación que mantienen la integridad arterial para pruebas consistentes de estímulos vasoactivos.
- Análisis: Destaca las mediciones cuantitativas de variables dependientes (cambios en el diámetro interno mediante microscopía de video) que permiten comparar las respuestas vasodilatadoras y vasoconstrictoras.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica mediante el uso paralelo de fluometría láser Doppler para evaluar el flujo tisular y la marcación con lectinas fluorescentes para determinar la densidad de microvasos en estudios vasculares relacionados.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en diferentes lechos vasculares y cepas de ratas, reduciendo el desarrollo redundante de modelos en programas de investigación cardiovascular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas, reducción de la ambigüedad mecanicista en las vías de control vascular.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de preparaciones de arterias aisladas para un perfil farmacológico consistente.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías mediante la confirmación del compromiso de la diana en modelos ex vivo fisiológicamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la función endotelial confirmada y en la respuesta del músculo liso en modelos genéticos relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en disección microvascular, técnicas de canulación y manejo de microscopía de video.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluidos sistemas de perfusión con regulación de presión, microscopios de video con micrómetros y transductores de presión.
- Requisitos de estandarización entre equipos para el aislamiento arterial, ligadura con sutura y protocolos de mantenimiento de presión en diferentes laboratorios.
- Consideraciones para la adaptación en distintos sistemas modelo, incluyendo el ajuste de las presiones de perfusión y las composiciones de las soluciones para diferentes lechos vasculares y especies.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía: los delicados pasos de microcanulación requieren una formación considerable para evitar daños endoteliales o del músculo liso, y las arterias que carecen de tono en reposo activo (por ejemplo, arterias mesentéricas pequeñas) podrían excluirse de los análisis dependientes del tono.
