Biofilm oral toma de muestras para análisis de microbioma en niños sanos

El objetivo general de este procedimiento es presentar un método estandarizado para el muestreo de biopelículas orales para el análisis del microbioma en niños sanos. Esto se logra primero preparando y esterilizando los instrumentos y el material. A continuación, se prepara al niño para la toma de muestras de biopelícula.

A continuación, se toma una muestra de biopelícula de tres sitios, el surco subgingival, la mucosa del pliegue vestibular y la saliva. Por último, las muestras se almacenan sistemáticamente. En última instancia, los análisis del microbioma oral se realizarán para responder a preguntas clínicas y científicas.

Hola, soy Elizabeth y soy ortodoncista. Mi investigación se centra en los cambios en el microbioma oral que acompañan al tratamiento de ortodoncia. El muestreo de biofilm oral puede ser complicado.

El espacio en el surco subgingival es limitado, especialmente en los niños. Al comparar nuestros datos de microbioma con la investigación mundial, encontramos una falta de protocolos de muestreo estandarizados. Con este video, damos el primer paso para llenar este vacío.

Las puntas de papel calibradas y estériles que se suelen utilizar en la terapia endodóntica se cortan en la primera marca del anillo para estandarizar su longitud. Después del corte, las puntas de papel deben ser irradiadas con rayos UV para evitar la contaminación por ADN y ARN. Los tubos para el almacenamiento se esterilizarán en autoclave y también se irradiarán con rayos UV.

Antes de la toma de muestras de biopelícula, los dientes deben limpiarse por completo, comenzando con la aplicación de manteca de cacao. Luego, los dientes se manchan con la revelación de placa. Después de teñir, la boca se enjuaga con agua.

Los dientes se cepillan correctamente con un cepillo de dientes eléctrico y agua. No se aplica pasta de dientes, ya que esto alteraría el biofilm oral. Se utiliza un retractor de mejillas y lengua para mantener la boca abierta y seca.

La colocación del retractor requiere manos hábiles y firmes, para minimizar las molestias al niño y mantener el procedimiento lo más corto posible. Se utilizan pinzas dentales estériles y el sitio de muestreo no se ve afectado durante todo el procedimiento. Los dientes se limpian y secan con hisopos de algodón estériles para evitar la absorción de líquido supragingival durante la toma de muestras de puntos de papel.

Se pueden utilizar diferentes métodos para la toma de muestras de biopelícula en la cavidad oral. Debido al espacio limitado en el surco subgingival de los niños, el muestreo de puntos de papel es el método de elección. Los puntos de papel se insertan tangencialmente hasta una longitud definida de cuatro milímetros durante 20 segundos.

Se debe tener especial cuidado de no traumatizar el epitelio de unión. A continuación, las puntas de papel se cortan en la tercera marca a una longitud estandarizada de cuatro milímetros. La punta de papel también se puede insertar simultáneamente en el mismo sitio o se pueden agrupar muestras de varios sitios.

Se retira el aparato de campo seco para la toma de muestras de mucosa y saliva. Las puntas de papel se pueden aplicar de la misma manera para muestrear la biopelícula mucosa en el pliegue vestibular. La biopelícula salival se puede recolectar escupiendo saliva no estimulada.

Dependiendo del diseño del estudio, los puntos de papel se almacenarán como muestras individuales, agrupadas o paralelas. Un sistema de almacenamiento codificado por colores facilitará la gestión posterior de las muestras. Finalmente, las muestras se almacenan para el análisis del microbioma a menos 80 grados centígrados.

Se han desarrollado varios kits comerciales para la identificación rápida y precisa de bacterias periodontopógenas. Los puntos de papel se envían a laboratorios especializados. La extracción, preparación y análisis del ADN se realizan en un plazo de tres horas.

El ADN también se puede utilizar en la investigación para estudios de microbioma. La secuenciación de próxima generación, por ejemplo, da como resultado conjuntos de datos completos de microbioma. Se puede analizar la abundancia relativa global de ciertas especies bacterianas, así como los cambios en la microbiota debidos a condiciones cambiantes.

Este gráfico de barras y mapa de calor muestra la abundancia relativa de la microbiota subgingival en el filo y a nivel de orden. Las diferencias en la composición microbiana a lo largo del tiempo, las comparaciones entre o dentro de los individuos o los diferentes métodos de muestreo se presentan en los histogramas. Esta figura muestra los resultados de una comparación de dos métodos de muestreo, Modo A y Modo B, en diferentes niveles taxonómicos.

El análisis estadístico de los valores creados con la secuenciación de próxima generación se puede presentar en tablas. Los diferentes puntos de tiempo que se muestran en esta tabla se pueden analizar en diferentes niveles taxonómicos. Los valores p se calculan para demostrar hallazgos significativos.

Por último, el microbioma oral a nivel de OTU se puede visualizar con análisis de coordenadas principales. Esta figura muestra las diferencias intra e interindividuales en cinco sujetos. Un agrupamiento de ciertos grupos puede mostrar cambios en la composición del microbioma.

Esta animación 3D muestra los resultados de un estudio de casos y controles. Los puntos rojos son los casos. Los puntos azules son los controles.

Una clara agrupación de los casos después de la intervención ortodóncica en T3, los grandes puntos rojos, visualizan un cambio en el microbioma. Los puntos azules que muestran el grupo de control se distribuyen uniformemente. Este método puede proporcionar información sobre el muestreo clínico de biopelículas en el surco subgingival de niños sanos.

Elegimos los puntos de papel como los más adecuados para este compartimento vulnerable. En este video, aplicamos el método solo a la condición permanente. También se puede aplicar a condiciones mixtas o maduras.

Con algunos de los pacientes, también se pueden tomar muestras de sitios periodontalmente enfermos de acuerdo con el mismo protocolo. Hola, me llamo Bárbara y soy microbióloga molecular. Cuando analizo biopelículas en el laboratorio, necesito confiar en una biblioteca de muestras clínicas imparciales.

Cada paso en el campo interdisciplinario de la investigación microbiana oral debe estar completamente estandarizado. Y hay un dato más importante. Solo se puede tener éxito en un equipo.

Así que trata siempre bien a tus compañeros.