Name: Stereotactically dirigido la ablación de la corteza auditiva de ratas y la localización de la lesión en el cerebro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende la ablación estereotáctica de la corteza auditiva en ratas para investigación en neurociencia. Este método permite localizar lesiones con precisión usando un mapa de coordenadas y análisis postmortem.

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Esta investigación fue apoyada por una beca del Ministerio de economía y competitividad (MINECO) del gobierno de España, SAF2016-78898-C2-2-R.

este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con ambas normativa española (Real Decreto 53/2013 - Ley 32/2007) y las directrices de la Unión Europea (Directiva 2010/63/EU) en el cuidado y uso de animales en investigación biomédica.
 1. Preparación de la rata Nota: realizamos los experimentos en ratas machos para evitar los cambios hormonales.
<ol><li>El animal con una mezcla de clorhidrato de ketamina (30 mg/kg) y el clorhidrato de xilacina (5 mg/kg) inyectados por vía intramuscular, con esta dosis, la rata debe profundamente anestesiar para alrededor 1 h. de Anesthetize</li>
	Pizca de <li>la rata &#39; toe s; ausencia de un retiro reflejo indica que el animal es totalmente inconsciente. Si la rata responde a la pizca, dar anestesia suplementaria en un tercio de la dosis inicial.</li>
	<li>Afeitado del cuero cabelludo y desinfectar el área quirúrgico con povidona-yodo.</li>
	<li>Colocar el animal sobre una almohadilla de calefacción para mantener una temperatura de 38 ° C y estabilizar el animal &#39; cabeza en un marco estereotáctica usando dos barras de oreja y una barra de bocado. Tenga cuidado para evitar la perforación de la membrana del tímpano con las barras oído.</li>
	<li>Proteger los ojos aplicando una gota de gel oftálmico o suero salino a cada ojo.</li>
</ol> 2. Ubicación de la CA en el hueso Temporal de la rata <ol><li>con un bisturí, hacer una incisión a lo largo de la línea media para exponer el cráneo y retraiga el periostio que cubre la superficie del cráneo.</li>
	<li>Utilizar una punta de algodón estéril para eliminar suavemente la sangre que cubre la superficie del cráneo para visualizar bregma, lambda y interaural 0 según el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro 22.</li>
	<li>Hacer una incisión en el músculo temporal cerca de su inserción dorsal sobre el cráneo con un bisturí. Tirar el músculo utilizando una aguja y sutura material y fijar el material de sutura para el marco estereotáctico; Esto expondrá el hueso temporal. Si se presenta sangrado, lavar con solución salina estéril fría.</li>
	<li>Colocar una aguja recta estéril en el micromanipulador stereotactic, asegurándose de que está plenamente asegurado.</li>
	<li>Baje lentamente la aguja hasta que quede justo encima de la superficie del cráneo, por lo que la punta de la aguja se establece en 0 interaural. Definir este punto como cero y determinar las coordenadas de este punto.</li>
	<li>Dependiendo del área cerebral de interés, varían las coordenadas stereotactic. Determinar las coordenadas utilizando el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro 22. Una vez determinadas las coordenadas, mueva la aguja para que coincida con esas coordenadas.</li>
	<li>Blanco la CA utilizando las coordenadas de los siguientes cuatro puntos: A: A / P =-5,80 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +-8,67 mm. Baje la aguja hasta justo encima del hueso temporal para visualizar cada uno de estos cuatro puntos. Utilizando un rotulador, marca los puntos en el hueso temporal y conectarlos con el fin de dibujar un rectángulo; el rectángulo servirá como una guía para abrir de una ventana en el hueso ( figura 1).</li>
</ol> 3. Exposición quirúrgica de la CA <ol><li>abrir la ventana utilizando un taladro eléctrico y una broca pequeña broca (0.6 mm Ø). Perfore el perímetro del rectángulo a 8.000 rpm hasta que el hueso da lejos. Enfriar la superficie de perforación por lavado con solución salina estéril frío para evitar daños a estructuras subcorticales. El hueso que da forma, puede detectarse una caída en la resistencia. Tenga cuidado de no perforar el cerebro.</li>
	<li>Cuando las fronteras están flojas, tire hacia arriba del hueso de cubierta con pinzas finas y almacenarlo en solución salina estéril fría.</li>
</ol> 4. Ablación de la CA <ol><li>utilizando un microscopio quirúrgico (10 X), con cuidado corte las meninges con una cuchilla microquirúrgica y eliminarlos usando dos pinzas de punta fina. Si se presenta sangrado, lavar con solución salina estéril fría.</li>
	<li>Aspire suavemente la CA usando un dispositivo de succión quirúrgico (presión -0,24 bar) acoplado a una aguja estéril de punta Roma de 20 G. Este punto es fundamental y debe realizarse con mucho cuidado: aspirar sólo las seis capas corticales y no la materia blanca subyacente.</li>
	<li>Aspirar hasta detener la hemorragia de las arterias perforantes.</li>
	<li>Una vez terminada la aspiración, cubra el área lesionada con el hueso extraído y aplicar una gasa hemostática absorbible.</li>
	<li>Dejar que el músculo temporal recupera su posición original y luego sutura la piel con herida clips (9 mm). Aplique un ungüento antibiótico (véase la Tabla de materiales). Seguir aplicar el ungüento sobre la herida dos veces al día durante tres días. 
	Nota: Cada aplicación consiste en una capa delgada aplicada sobre la herida.</li>
	<li>Buprenorfina de inyectar por vía subcutánea en la parte posterior de la rata (0,05 mg/kg) como un analgésico 1 h después de la cirugía y luego cada 8 h durante 72 h.</li>
	<li>Mantener el animal en la almohada hasta que se despierta y volver a su jaula de alojamiento recuperar.</li>
	<li>Casa animales individualmente para evitar que los compañeros de jaula tocando el área suturado y proporcionar algunos elementos de enriquecimiento. Cambiar el aserrín diariamente para prevenir infecciones y revise cuidadosamente que el animal se recupera correctamente y no muestra signos de malestar.</li>
</ol> 5. Colección de tejido PRECAUCIÓN: al manipular el paraformaldehido (PFA), sólida y acuosa, usar equipo de protección personal (EPP) y utilizar un gabinete de seguridad.
 Nota: preparar 750 mL de solución de formaldehído disolviendo 4% (w/v) PFA en 1 x solución de tampón fosfato (PBS) con calor (55 º C). Filtrar la solución de formaldehído con papel de filtro. Preparar el timbre &#39; s solución al disolver 8,5 g de NaCl, 0,25 g de KCl, 0.2 g NaHCO 3 en 1.000 mL de agua (pH solución = 6.9).
<ol><li>Permite al animal sobrevivir como sea necesario para el estudio. Cuando se haya completado la investigación con la rata seccionada AC, terminal anestesiar por inyección intraperitoneal de 0,1 mL de pentobarbital sódico (60 mg/kg). Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la ausencia del reflejo de retirada.</li>
	<li>Cuando el animal está anestesiado profundamente, realizar una perfusión intracardiaca 23 de 125 mL de Ringer &#39; s solución seguido de 750 mL de solución de formaldehído mediante el uso de una aguja de calibre de 1,8 mm de diámetro interior.</li>
	<li>Una vez terminada la perfusión, decapita a la rata en la primera vértebra cervical.</li>
	<li>Tijeras de uso para quitar la piel y el músculo de la cabeza y exponer el cráneo. Utilice tijeras para cortar y abrir el foramen magnum y retire la parte posterior del cráneo.</li>
	<li>Haga un transversal corte en el hueso orbital usando tijeras Spencer y usar gubias para cortar a lo largo de los bordes superiores del cráneo para exponer el cerebro. Tenga cuidado de no dañar el cerebro.</li>
	<li>Una vez que el cerebro es expuesto, retire con cuidado la duramadre con unas pinzas de punta fina. Utilice un dedo suavemente saque bajo y elevar el cerebro. Levante el cerebro y corte la unt de nerviosIl es gratuito. Sumergir el cerebro en solución de formaldehído y almacenar a 4 ° C por 24 h.</li>
</ol> 6. Localización de las lesiones AC <ol><li>después de la fijación posterior, coloque con cuidado el cerebro en una matriz de cerebro de rata sagital exponiendo la superficie lateral del cerebro.</li>
	<li>Colocar una cámara arriba de 21 cm la superficie de la corteza mediante un soporte de cámara, seleccione la &#34; disparo super macro &#34; modo y tomar una fotografía de la superficie del cerebro.</li>
	<li>Ponga el cerebro en una matriz de cerebro de rata coronal exponiendo la superficie dorsal del cerebro y tome otra foto.</li>
	<li>Utilizando un programa editor de imagen, abra las imágenes y escala abajo de 50% para que sea más fácil trabajar con ellos. Identificar el bregma, lambda y referencias 0 interaural en la fotografía según Paxinos y Watson coordenadas 19 y marque su posición en las imágenes ( figura 2). Dibujar el contorno de la ablación en la imagen lateral del cerebro. Calcular el perímetro de.</li>
	<li>Importación las coordenadas del mapa donde la primaria (A1) y las regiones secundarias (Dorsal y Ventral cortezas) de la CA son ubicada 18 en el archivo del programa editor donde se trabaja con las imágenes. Haga clic en el mapa y arrástrelo para superponerlo a la fotografía lateral del cerebro seccionado.
	<ol><li>Hacer el bregma y referencias de la lambda del mapa coordenado coinciden con el bregma y lambda referencias identificadas en la imagen del lateral cerebro.</li>
		<li>Usar el nebulizador nasal fisura como referencia para ajustar la imagen del cerebro para el mapa y hacer que coinciden ( figura 2B).</li>
	</ol></li> <li>Calcular el porcentaje de la lesión en relación con el área ocupada por la A.C.</li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Una cirugía exitosa depende dos factores: mantener vivo al animal durante y después del procedimiento y localizar con precisión el área de interés. Asegurar que la rata es profundamente anestesiada durante la cirugía (prueba el reflejo de retirada) y recibe suficientes analgésicos y antibióticos no ototóxicos deben ayudar a la supervivencia. Además, la rata se debe mantener sobre una almohada hasta que despierta de la anestesia para evitar la hipotermia. Sutura se reduce la susceptibilidad a la infección, y la técnica adecuada es de vital importancia: animales elegirá a sus clips de herida, por lo que debería ser implantados lo suficientemente apretado para evitar la remoción sin poner demasiada tensión en la herida.
Para localizar con precisión el AC (o cualquier otra área cortical), es importante determinar la posición de bregma y lambda 0 interaural para utilizarlos como referencias para el cálculo de los límites de la región específica. Cualquier error en el cálculo de las coordenadas resultará en la ablación parcial de la CA o la aspiración no deseada de otras zonas aledañas. Así, la punta de la aguja debe solamente toque el hueso 0 interaural y luego traducir las coordenadas anteroposterior y mediolateral según lo que se describe en el presente Protocolo.
En este manuscrito, también hemos descrito cómo exponer quirúrgicamente y ablar de la CA. Hay tres pasos fundamentales: el proceso de perforación, la apertura y el retiro de las meninges y la ablación por aspiración. Perforación se debe realizar a una velocidad baja con la presión mínima, como una perforación de alta velocidad genera calor que puede afectar a cerca de las estructuras subcorticales. Sin embargo, mantener una velocidad baja y el área de perforación con solución salina estéril fría de refrigeración deben prevenir cualquier daño. Además, la presión mínima es esencial para evitar una rotura repentina del cráneo y lesiones posteriores a la corteza subyacente. La apertura y el retiro de las meninges que cubren el AC deben realizarse con cuidado para no romper los vasos sanguíneos. Si se presenta sangrado, es generalmente desfavorable el pronóstico temprano y tardío y es cuestionable si tal animal cumple los criterios de inclusión de un estudio confiable. Se recomienda la eutanasia en este caso. Por último, la aspiración (probablemente el aspecto más difícil en la realización de una efectiva lesión), debe limitarse a la materia gris. Hay dos indicadores que pueden ayudar a detectar la presencia de la sustancia blanca: (1) un cambio en el contraste de color, como la materia blanca es más brillante que la materia gris; y (2) el cese del sangrado de las arterias perforantes.
Después de cualquier manipulación realizada en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión del procedimiento en la corteza para el posterior análisis y validación de los datos obtenidos del animal. En este manuscrito, detallamos cómo localizar la ablación realizada en la corteza, utilizando un mapa de coordenadas descrito previamente por nuestro grupo18. Este mapa fue construido usando referencias anatómicas obtenidas de reconstrucciones de la sección serie de secciones histológicas, correlacionadas con el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro22. En consecuencia, el mapa distingue entre la primaria (A1) y cortezas secundarias (Dorsal y Ventral) de la CA. La principal ventaja de este mapa de coordenadas es que permite la rápida localización de la lesión mediante la superposición de una fotografía tomada desde la superficie lateral del cerebro en una matriz de cerebro sagital. Otra ventaja es que los laboratorios con menos experiencia en anatomía pueden utilizar el mapa adaptándolo a sus modelos animales. Sólo es necesario establecer las distancias entre bregma y lambda referencias 0 interaural en un cerebro de control perfundido y escala el mapa arriba o hacia abajo en consecuencia. Usar el nebulizador nasal fisura como referencia para ajustar la imagen del cerebro para el mapa. La profundidad de la ablación no puede determinarse en este mapa de coordenadas, por lo que debe ser determinado en las secciones histológicas del cerebro.
La combinación de métodos estereotácticas con la exposición quirúrgica de la CA son métodos básicos que podrían adaptarse fácilmente por cualquier investigador que desee a la CA en la rata. Esto puede ser para un experimento agudo o uno que requiere la implantación de dispositivos permanentes. Además, la ablación quirúrgica de la AC se ha previamente utilizada como modelo para estudiar los efectos de privación crónica cortical en audiencia. Ablaciones AC podrían utilizarse también para estudiar los efectos que ablaciones AC unilaterales ejercen en otras áreas corticales, o servir como un modelo de movimiento. Así, los diseños experimentales que se describen aquí son métodos útiles que se pueden aplicar individualmente o en combinación con una amplia gama de diseños experimentales.

La rata es uno de los modelos animales más utilizados en Neurología auditiva. La robustez de su comportamiento, es capaz de trabajar a cientos de ensayos por día. Su sensibilidad y agudeza espectral audiencia1,2, y la organización anatómica y funcional de su sistema central, comparable de otros mamíferos3, hacen la rata en un modelo animal adecuado para el análisis de una amplia gama de temas de investigación en Neurociencia auditiva. La corteza auditiva de ratas (AC), en particular, ha sido objeto de varios estudios anatómicos y fisiológicos que han tratado de comprender su estructura, organización y papel en el procesamiento de sonido3. Hoy en día, la AC se ha vuelto popular entre los neurólogos interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia, percepción auditiva, la base sináptica de la organización del campo receptivo y el control cortical del procesamiento del sonido en el subcortical auditivo 5,4,6,7,de núcleos de8,9. Para abordar los desafíos que plantean estos nuevos enfoques, procedimientos que se pueden localizar con precisión y exponer quirúrgicamente la CA acelerará los esfuerzos de investigación. Técnicas estereotácticas permiten localizar regiones específicas en el cerebro sin pruebas de Fisiología. Aunque el tamaño del cerebro varía ligeramente entre los animales, la ubicación de cualquier área del cerebro puede ser determinada utilizando coordenadas stereotactic conjunto de hitos en el cráneo del cerebro de rata.
La ablación restringida de la AC es la extirpación quirúrgica de la región sensorial de la corteza más directamente relacionada con la audiencia. En contraste con otros métodos utilizados para bloquear la actividad de AC, tales como refrigeración o local lidocaína inyecciones10,11,12, la ablación quirúrgica de los resultados de AC en la pérdida crónica de la función. Así, ablaciones de AC son más adecuados para estudiar los efectos a largo plazo de privación cortical, así como los posteriores fenómenos de plasticidad de la lesión. La combinación de métodos estereotácticas con ablación quirúrgica de la CA se ha utilizado con éxito para estudiar los efectos fisiológicos, conductuales y moleculares de control cortical privación13,14,15 ,16,17,18,19. Por ejemplo, un modelo de rata con ablaciones bilaterales de AC se ha utilizado para estudiar los efectos de la ablación cortical en el reflejo de sobresalto auditivo y auditivas del médula oblonga (ABR) de respuestas16. Recientemente, hemos comparado los efectos que unilateral versus bilaterales ablaciones de los productos de rata AC en los umbrales de la ABR, amplitudes y latencias en diferentes momentos después de la lesión18. Además, el modelo de la rata de ablación AC restrictiva también se ha utilizado para estudiar el efecto de la degeneración vía corticofugal en la inferior collicus13,14,15 y el oído interno17 ,19. Después de que tal manipulación se realiza en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Aunque muy útiles, la principal limitación de tonotópica mapas basados en las respuestas neuronales20,21 son las técnicas electrofisiológicas necesarias para localizar los campos auditivos en el cerebro de la rata. Puesto que no todos los laboratorios tienen el equipo necesario o conocimientos para hacer tales grabaciones, se construyó un mapa de coordenadas basado en la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a una imagen de la superficie del cerebro18. Este mapa puede ser muy útil para localizar la CA sin pruebas de Fisiología.
El presente Protocolo describe un método para la ubicación stereotactically guiada, exposición quirúrgica y ablación de la CA en ratas. También describe cómo utilizar nuestro mapa coordenadas18 para fácilmente localizar la extensión de la lesión sobre una imagen de la superficie de los cerebros seccionados.

<table><tbody><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromotor dental</td><td>W& H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>Fresa de diamante</td><td>B Braun</td><td>GD021R</td><td>0,6 mm</td></tr><tr><td>Aspirador quirúrgico</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Merial</td><td></td><td>30 mg/kg</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer</td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidona yodada</td><td>Meda</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>suero salino estéril</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G aguja estéril</td><td>Terumo Neolus Puntas</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>de algodón</tr><tr><td>Material de sutura</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica</td><td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>Agujas quirúrgicas</td><td>World Precision Instruments</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK</td><td>Buprex</td><td>0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>Tijera</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>Tijera Spencer</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturí microquirúrgico</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>Gasa hemostática absorbible</td><td>Surgicel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggital rat Brain Matrix</td><td>Activational systems Inc.</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td>60 mg/kg</td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Olympus 5.1 MP</td><td>C-5060 lente zoom gran angular</td><td>F2.8-4.8</td></tr><tr><td>Pinzas enrolladas</td><td>Reflex 9</td><td></td><td>9 mm</td></tr><tr><td>Canvas 12</td><td>ACD Systems calibre</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>aguja</td><td></td><td></td><td>diámetro 1,8 mm</td></tr><tr><td>Embudo separador</td><td>labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>cebador GluA2 Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td></tr><tr><td>Cebador GluA2 Selecto</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGGGCTGTGTGTGTGTGTGA</td></tr><tr><td>Cebador GluA3 Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 GeneBank Inverso</td><td></td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

stereotactically dirigido la ablación de la corteza auditiva de ratas y la localización de la lesión en el cerebro

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

La corteza auditiva de ratas (AC) se está convirtiendo en popular entre los investigadores de Neurociencia auditiva que están interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia y procesos perceptivos auditivos cortical control de procesamiento en los núcleos auditivos subcorticales de sonido. Para hacer frente a nuevos retos, un procedimiento para localizar con precisión y quirúrgico exponer la corteza auditiva agilizaría este esfuerzo de investigación. Neurocirugía estereotáxica se utiliza rutinariamente en la investigación preclínica en modelos animales al engraft una aguja o electrodo en un lugar previamente definido dentro de la corteza auditiva. En el siguiente protocolo, utilizamos métodos estereotácticos de una forma novedosa. Identificamos cuatro puntos de coordenadas sobre la superficie de la temporal bone de la rata para definir una ventana que, una vez abierto, expone con precisión tanto el principal (A1) y secundaria (Dorsal y Ventral) cortezas de la A.C. con este método, entonces realizamos una cirugía ablación de la CA. Después de realiza dicha manipulación, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Así, describimos un método para localizar fácilmente la autopsia de la ablación de la AC utilizando un mapa de coordenadas construido mediante la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a la superficie del cerebro. La combinación de la localización stereotactically dirigido y ablación de la CA con la localización de la zona lesionada en post mortem de un mapa de coordenadas facilita la validación de la información obtenida de los animales y conduce a un mejor análisis y comprensión de los datos.

Se realizan una ubicación stereotactically guiada, exposición quirúrgica y la ablación unilateral de la CA en tres ratas de Wistar. La localización de la lesión confirmó que ablaciones en las tres ratas usurpó las subdivisiones principales de la CA (cortezas primarias dorsales y ventrales) y abarca un rango de 80 a 100% de la superficie total de AC (figura 2B).
El protocolo aquí descrito para realizar ablaciones AC restrictivas se ha utilizado previamente en nuestro laboratorio para estudiar los efectos a largo plazo de la privación del control cortical en los núcleos auditivos subcorticales, así como los posteriores fenómenos de plasticidad. En estos estudios, se validó el protocolo de ablaciones AC aplicando fisiológica (ABR), comportamiento (respuestas de sobresalto, prepulso inhibición; PPI) y molecular (DNA microarrays, qPCR y Western Blot) métodos13,14,15,16,17,18,19. Aquí, para demostrar la eficacia de nuestro protocolo, dejamos las tres ratas de AC por ablación sobrevivir durante una semana, y las cócleas durante la colección de tejidos recogidos paso a estudiar los cambios en la expresión de las subunidades AMPA más relevantes presentes en la cóclea adulta , GluA2 y GluA3, por qPCR. La comparación entre las transcripciones de AC ablación ratas y animales de control simulado donde se realizó todo el proceso de la cirugía pero no la ablación cortical mostraron una abajo-regulación de GluA2 y una para arriba-regulación de GluA3 en ambas cócleas (figura 3) , que está de acuerdo con nuestro anterior estudio19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figura 1: imágenes del rata del hueso temporal en tres pasos quirúrgicos diferentes. (A) transferencia de las coordenadas estereotáxicas de la CA en el hueso temporal. Las coordenadas de los cuatro puntos son: A: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +-8,67 mm. (B) las coordenadas se utilizan como referencia para dibujar un rectángulo en la superficie del hueso temporal que guiarán la apertura de una ventana. (C) muestra la ventana que se abre en el hueso después de la perforación. Las meninges con los vasos sanguíneos se observan en la superficie del cerebro. R: rostral, D: dorsal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figura 2: procedimiento para la localización de las lesiones en el cerebro de la rata. (A) fotografía de la superficie dorsal de un cerebro AC ablación con agujas stereotactically implantados en Lambda y Bregma (según coordenadas Paxinos y Watson,19). Las líneas punteadas marcan la posición de Bregma y Interaural 0 en la cuadrícula de 9 x 9 cm, así como en la superficie dorsal del cerebro. (B) fotografía de la superficie lateral del cerebro seccionado superpuesto al mapa de coordenadas de la CA. El perímetro de la lesión es marcado en rojo en la imagen. El perímetro de la zona de AC está marcado en negro en el mapa. En este ejemplo, el porcentaje de la ablación de AC con respecto al área total ocupado por el AC es 84.79%. AC: corteza auditiva, IA: inter aural, FR: fisura Nebulizador nasal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figura 3: cambios en los niveles de ARNm de las subunidades del receptor AMPA GluA2 y GluA3 después de la unilateral lesión tras ablaciones AC de 7 días. Resultados se presentan como la media ± desviación estándar del cambio doble. Cambios para GluA2 las transcripciones se representan en azul. En rojo se presentan cambios para las transcripciones de GluA3. Se observaron una disminución significativa en GluA2 y un aumento de GluA3 en ambas cócleas (ipsi - y contralateral a la ablación) en relación con controles del impostor con no ablaciones corticales en 7 días después de la cirugía; Esto está de acuerdo con nuestros anteriores resultados19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se describe un método para la ubicación stereotactically-dirigida, la exposición y la ablación de la corteza auditiva de ratas. La localización de la ablación se evaluó mediante post mortem de un mapa de coordenadas.

Stereotactically dirigido la ablación de la corteza auditiva de ratas y la localización de la lesión en el cerebro

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

El objetivo general de este procedimiento es describir la ablación estereotáctica de la corteza auditiva y el uso de un mapa de coordenadas para localizar la lesión en una imagen de la superficie del cerebro. Este método puede ayudar a los investigadores de la neurociencia auditiva a abordar el papel de los corticales en la vía de la percepción del sonido. Así como los mecanismos y la plasticidad posicional de la línea.La principal ventaja de esta técnica es que permite la exposición quirúrgica y la ablación de la corteza auditiva mediante el uso de métodos básicos que pueden ser adaptados por cualquier investigador. Por lo tanto, este método puede ser útil en el campo de la neurociencia auditiva, también se puede aplicar en otros sistemas como el visual y el somatosensorial. Este método también se puede utilizar para estudiar los defectos que la ablación unilateral de la corteza auditiva ejerce en otras áreas corticales.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la correcta identificación y traducción de las coordenadas estereotáxicas en el hueso temporal es esencial para localizar con precisión la corteza auditiva. Para comenzar este procedimiento, coloque a la rata anestesiada sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal. A continuación, estabilice la cabeza del animal en un marco estereotáxico utilizando dos barras para las orejas y una barra de mordida.Afeitar el cuero cabelludo y desinfectar la zona quirúrgica con povidona yodada. Con un bisturí, haga una incisión a lo largo de la línea media para exponer el cráneo y retraer el periostio que cubre la superficie del cráneo. Después de eso, use una punta de algodón estéril para eliminar suavemente la sangre que cubre la superficie del cráneo.Para visualizar Bregma, Lambda y la línea interaural, haga una incisión en el músculo temporal cerca de su inserción dorsal en el cráneo con un bisturí. Después de eso, extraiga el músculo con una aguja y material de sutura y fije el material de sutura al marco estereotáctico para exponer el hueso temporal. Baje lentamente una aguja recta estéril hasta que esté justo por encima de la superficie del cráneo, de modo que la punta de la aguja se ajuste al cero interaural.Establezca este punto en cero. A continuación, apunte al CA utilizando cuatro puntos. A continuación, baja la aguja justo por encima del hueso temporal para visualizar cada uno de estos cuatro puntos.Marca los puntos con un rotulador en el hueso temporal y conéctalos para dibujar un rectángulo. El rectángulo servirá de guía para abrir una ventana en el hueso. En este procedimiento, abra la ventana con un taladro eléctrico y una broca pequeña.Perfora el perímetro del rectángulo a 8.000 rpm hasta que el hueso ceda. Enfríe la superficie de perforación enjuagándola con solución salina estéril fría para evitar daños en las estructuras subcorticales. Cuando el hueso ceda, tenga cuidado de no perforar el cerebro.Cuando los bordes estén sueltos, levante el hueso que lo cubre con pinzas finas y guárdelo en solución salina fría y estéril. Con un microscopio quirúrgico, corte suavemente las meninges con un bisturí microquirúrgico y retírelas con dos pinzas de punta fina. Si se produce sangrado, enjuague el sitio quirúrgico con solución salina estéril fría.A continuación, aspire suavemente el aire acondicionado con un dispositivo de succión quirúrgico acoplado a una aguja estéril de punta roma de calibre 20. Aspira solo las seis capas corticales, y no la sustancia blanca subyacente. Este punto es crítico y debe realizarse con mucho cuidado.Una vez finalizada la aspiración, cubrir la zona quirúrgica con el hueso extraído y aplicar una gasa hemostática reabsorbible. Deje que el músculo temporal recupere su posición original y luego sutura la piel con clips para heridas. Después de eso, aplique ungüento antibiótico en la herida.Posteriormente, inyectar buprenorfina por vía subcutánea en el dorso de la rata como analgésico, una hora y ocho horas después de finalizada la cirugía. Mantenga al animal en la almohadilla térmica hasta que se despierte y devuélvalo a su jaula de alojamiento para que se recupere. Una vez finalizada la investigación realizada con la rata ablacionada con AC, anestesiarla terminalmente mediante inyección intraperitoneal de 0,1 mililitros de pentobarbital sódico.Después de realizar una profusión intracardíaca de solución de Ringer y formaldehído, retire la piel y el músculo de la cabeza para exponer el cráneo. Con unas tijeras Spencer, haz un corte transversal en el hueso orbital. Después de eso, retira la parte posterior del cráneo y usa rongeurs para cortar a lo largo de los bordes superiores del cráneo para exponer el cerebro.Tenga cuidado de no dañar el cerebro. Una vez que el cerebro esté expuesto, retire con cuidado la duramadre con pinzas de punta fina. Use un dedo para recoger suavemente por debajo y elevar el cerebro.Luego levanta el cerebro y corta los nervios hasta que quede libre. Posteriormente, sumerja el cerebro en una solución de formaldehído y guárdelo a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Después de la postfijación, coloque cuidadosamente el cerebro en una matriz cerebral de rata sagital, exponiendo la superficie lateral del cerebro.Coloque una cámara a 21 centímetros por encima de la superficie de la corteza con un soporte para cámara. Luego, seleccione el modo de disparo súper macro y tome una foto de la superficie del cerebro. A continuación, utilizando un programa de edición de imágenes, abra las imágenes y redúzcalas un 50%Identifique las referencias Bregma, Lambda y cero interaural y marque su posición en las imágenes.Dibuja el contorno de la ablación sobre la imagen lateral del cerebro. Importe el mapa de coordenadas donde se encuentran las regiones primaria y secundaria de la corteza auditiva al archivo del programa editor. A continuación, haz clic en el mapa y arrástralo para superponerlo a la fotografía lateral del cerebro ablacionado.Haga coincidir las referencias Bregma y Lambda del mapa de coordenadas con las referencias Bregma e IA identificadas en la imagen del cerebro lateral. Posteriormente, utiliza la fisura del Rhinal como referencia para ajustar la imagen del cerebro al mapa y hacerlos coincidir. Es importante confirmar que la materia blanca está intacta.Esto se puede hacer mediante la inmunotinción inicial de una sección seriada del cerebro. Para demostrar la eficacia de nuestro protocolo, mantuvimos a las tres ratas ablacionadas con AC sobrevivientes durante una semana y luego recolectamos las cócleas para estudiar los cambios en la expresión de las subunidades de AMPA más relevantes presentes en la cóclea adulta, GluA2 y GluA3 mediante qPCR. La comparación entre las transcripciones de ratas ablacionadas con AC y animales de control simulados mostró una regulación a la baja para GluA2 y una regulación al alza para GluA3 en ambas cócleas, lo que está de acuerdo con nuestro estudio previo.Al intentar la cirugía, es importante recordar tres cosas: perforar el hueso temporal a la velocidad más baja con la mínima presión, extirpar cuidadosamente las meninges para evitar romper los vasos sanguíneos y restringir la aspiración a la materia gris. Una vez dominado, la exposición quirúrgica y la ablación de la corteza auditiva se puede realizar en 45 minutos si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos fisiológicos, conductuales y/o inmunocitoquímicos para responder preguntas adicionales, como cómo la falta de la corteza auditiva afecta la función de otros sistemas sensoriales.

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Hemos desarrollado un método de traducción simultánea de imágenes de resonancia magnética funcional y de registro electrofisiológico en el cerebro de roedores, proporcionando una plataforma para la investigación de la relación entre la actividad neuronal y el nivel de oxigenación de la sangre depende de (BOLD) señal de resonancia magnética.

FMRI simultánea y electrofisiología en el cerebro de roedores

La ablación selectiva de la región específica del cerebro (s) mediante la infusión de una excitotoxina utilizando las coordenadas estereotáxicas se describe. Esta técnica también se podría adaptar para la infusión de otros productos químicos en el cerebro de rata.

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Este video muestra un procedimiento quirúrgico guiado estereotácticamente para ablar la corteza auditiva en una rata. Los pasos incluyen la identificación de puntos de referencia anatómicos en una rata anestesiada asegurada en un marco estereotáctico, la creación de una ventana en el cráneo por encima de la corteza auditiva, la aspiración de las capas corticales y la prestación de cuidados postoperatorios para evaluar el impacto de la ablación en el procesamiento del sonido.

Una técnica de ablación guiada estereotácticamente para la extirpación de la corteza auditiva en ratas

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Microelectrodos guiada implantación de electrodos en el Subtalámico Núcleo de ratas de largo plazo estimulación cerebral profunda

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Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Grabaciones electrofisiológicas de potenciales de campo locales y actividad de múltiples unidades de la vía hiperdirecta en ratas anestesiadas

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Un inalámbrico, interfaz bidireccional para la grabación en Vivo y estimulación de la actividad Neural en comportarse libremente las ratas

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Grabación concurrente de electroencefalografía Co localizada y potencial de campo Local en roedores

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In vivo Tomografía por emisión de positrones para revelar patrones de actividad inducida por estimulación cerebral profunda en ratas

Aprende la ablación estereotáctica de la corteza auditiva en ratas para investigación en neurociencia. Este método permite localizar lesiones con precisión usando un mapa de coordenadas y análisis postmortem.

Stereotactically dirigido la ablación de la corteza auditiva de ratas y la localización de la lesión en el cerebro

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