Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

Nuestro laboratorio ha estado utilizando el método del micógrafo de alambre para medir la contractilidad del músculo liso vascular durante muchos años. Utilizamos esta técnica para estudiar el mecanismo de contracción del músculo liso. Utilizamos este método para explorar nuevos fármacos para el tratamiento de la hipertensión.

La principal ventaja de esta técnica es que el segmento del vaso sobrevive al menos cuatro horas después del montaje y mantiene la contractilidad inducida por el potasio alto durante muchas veces. El sistema multicanal ofrece la oportunidad de realizar un cribado terapéutico intensivo de nuevos fármacos. Sujete el cuerpo del ratón sacrificado con el abdomen hacia arriba y humedezca el abdomen con etanol al 70%.

Luego, después de usar unas tijeras para cortar la piel a lo largo de la línea media ventral desde la ingle, haga incisiones en cada pierna desde el comienzo de la primera incisión. Tire de la piel hacia atrás en ambos lados, luego haga incisiones similares para abrir el peritoneo. A continuación, use tijeras para cortar el esófago, el colon y otros tejidos conectivos para aislar completamente el tracto gastrointestinal con vasculatura de alimentación del cuerpo.

Después de enjuagar la sangre del tracto gastrointestinal con HEPES-Tyrode, o solución H-T, transfiera el segmento aislado a una placa de Petri recubierta para la disección de la arteria mesentérica a temperatura ambiente. Alise el estómago, el yeyuno, el íleon y el ciego en el sentido de las agujas del reloj y fije el estómago y el ciego en el lado izquierdo y derecho respectivamente. Encienda la fuente de luz de transmisión de un microscopio estereoscópico y fije el intestino con alfileres para exponer las arterias mesentéricas disecadas.

A continuación, pinza los tejidos adiposos alrededor de las arterias con pinzas y aísla cuidadosamente las arterias cortando todos los tejidos conectivos con unas tijeras de disección. Agarre una arteria sobrante con fórceps y transfiera y sumerja el árbol de la arteria mesentérica en una solución H-T fría sin iones de calcio. Corte una porción de 1,4 milímetros de la arteria proximal a la pared intestinal de una arcada mesentérica y use dos pinzas para abrir ambos lados de este segmento de arteria con cuidado.

Prepara dos segmentos de alambre de acero inoxidable de 2,5 centímetros de longitud y colócalos en el mismo plato. Use fórceps para sujetar suavemente un extremo de la arteria. Luego, use otra pinza para insertar cuidadosamente dos cables en la luz de la arteria, uno por uno.

Asegúrese de que los cables se mantengan rectos y no toquen el endotelio. Con dos pinzas, sujete ambos cables fuera del recipiente roscado simultáneamente y transfiera con cuidado el recipiente de la placa de Petri a una cámara de micógrafo llena de solución H-T. Atornille las mordazas de la cámara para hacer espacio para el montaje, luego sujete ambos lados de uno de los dos cables insertados con dos pinzas y coloque el recipiente en el espacio de la mordaza.

Envuelva ambos lados del cable sujetado alrededor de los tornillos de la mordaza conectada al micrómetro. Fije el tornillo del lado izquierdo girándolo en el sentido de las agujas del reloj. Luego, use fórceps para enderezar el alambre.

A continuación, fije el tornillo del lado derecho girándolo en el sentido de las agujas del reloj. Asegúrese de que el vaso esté siempre dentro del espacio de la mandíbula, pero no toque la mandíbula para evitar daños. Cierre las dos mordazas con el micrómetro.

Asegúrese de que las dos mordazas estén lo suficientemente cerca pero que no se toquen entre sí, y que el cable no fijado esté encima del cable fijo. Con las pinzas derechas, doble con cuidado el cable desatornillado en la esquina de la mordaza conectada al transductor de fuerza y envuélvalo en el sentido de las agujas del reloj alrededor del tornillo del lado derecho. A continuación, fije el tornillo.

Repita el despliegue y envoltura del lado izquierdo del cable y fije el tornillo del lado izquierdo. A continuación, separe las mordazas ligeramente sin estirar el recipiente girando cuidadosamente el micrómetro para que el espacio entre las dos mordazas pueda acomodar los dos cables. A continuación, utilice pinzas para mover el cable en el lado del micrómetro al plano horizontal del cable en el lado del transductor.

Después de montar las arterias en las otras cámaras, conecte todas las cámaras al equipo y cubra las cámaras. Conecte el suministro de oxígeno al 100% y una sonda de temperatura y comience a calentar a 37 grados centígrados. Abra el software de gráficos.

Presione el botón Inicio' para comenzar a grabar. Seleccione el canal de interés en el menú DMT para abrir la ventana de normalización de DMT para el canal correspondiente. Introduzca los siguientes valores constantes en la ventana:Puntos finales de tejido a1, 0,1; Puntos finales de tejido a2, 4; Diámetro del alambre, 40.

A continuación, la ventana muestra la longitud del recipiente calculada como 1,40 milímetros. Lea el micrómetro de la cámara de tejido apropiada. Ingrese el valor en el cuadro de lectura del micrómetro y haga clic en el botón Agregar punto.

Este valor es el valor inicial de X. Después de un retraso de 60 segundos, la ventana muestra la fuerza y la presión efectiva correspondientes a este valor micrométrico. Al mismo tiempo, se activa la caja de lectura del micrómetro. Estire el recipiente que se está normalizando girando el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj.

Introduzca el valor del micrómetro en el cuadro de lectura del micrómetro y haga clic en el botón Añadir punto. Vuelva a esperar un tiempo de retardo de 60 segundos. Continúe estirando el recipiente y agregue valores de micrómetro hasta que la ventana muestre el valor del micrómetro X-one, que es la configuración de micrómetro calculada necesaria para estirar el recipiente a su IC-one.

Ajuste el micrómetro al valor X-uno. Después de la normalización, equilibre el recipiente en la cámara durante 15 a 20 minutos. Una vez equilibrado, desafíe el recipiente con una solución con alto contenido de potasio reemplazando la solución H-T con 5 mililitros de solución con alto contenido de potasio para inducir la contracción durante 10 minutos.

Después de repetir la incubación de 10 minutos en una solución fresca con alto contenido de potasio, lávese con cinco mililitros de solución H-T tres o cuatro veces. Nuevamente, desafíe el recipiente con cinco mililitros de solución de potasio con alto contenido de potasio para inducir la contracción. Después de cinco minutos, agregue 0,5 microlitros de la solución madre de Neoliensinina en la cámara para relajar el recipiente a una concentración final de un micromolar de Neoliensinina.

Cuando la fuerza sea estable después de varios minutos, agregue otros 0,5 microlitros de solución madre de Neoliensinina para aumentar la concentración a dos micromolares. Agregue un microlitro de la solución madre cada vez para aumentar la concentración a cuatro, seis, ocho y 10 micromolares para generar la curva de respuesta a la dosis. Durante el procedimiento de normalización, el recipiente se estiró varias veces hasta alcanzar el valor de IC-100 y cada ciclo de estiramiento incluyó una contracción robusta, una relajación rápida y un mantenimiento de la fuerza en 60 segundos.

La contracción del músculo liso vascular inducida por una solución de potasio con alto contenido suele mostrar dos fases, una fase robusta y una fase sostenida. Describimos un método para medir la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón utilizando un sistema de miógrafo multihilo. Este método se puede utilizar para evaluar las funciones del músculo liso vascular y para detectar relajantes del músculo liso.

La principal diferencia entre este método y otros está en los pasos de montaje. Este paso utilizado aquí es fácil de realizar y no daña el tejido ni el dispositivo. Siguiendo este procedimiento, también se pueden utilizar otros estimuladores como el EP y la Angiotensina II para estimular la contracción del músculo liso con el fin de encontrar algunos fármacos novedosos que sean sensibles a este agonista.