Fijación pulmonar bajo presión constante para la evaluación del enfisema en ratones
26 de septiembre de 2019
Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.
La presión constante dentro del dispositivo de fijación mantiene los pulmones en un estado razonablemente inflado generando una muestra pulmonar histológica adecuada para evaluar el enfisema inducido por el humo de cigarrillo leve. La principal ventaja de este modelo es que puede arreglar muchos pulmones al mismo tiempo utilizando la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación. Demostrando el procedimiento será Naoko Arano una estudiante graduada de mi laboratorio.
Después de confirmar una falta de respuesta al movimiento reflejo hacer una incisión en la piel y el tejido muscular a lo largo de la línea medial del ratón, apuntando a la región cefálica, y cortar lateralmente para crear un espacio de trabajo más amplio. Después de exponer la capa del diafragma, perfore el tejido con fórceps y abra el espacio torácico. Corte el área esternal permitiendo visualizar los pulmones y el corazón.
Y corta la aurícula izquierda y el ventrículo derecho. Inserte una cánula de calibre 24 conectada a una bomba de perfusión en el área del ventrículo derecho y dirija la cánula a la zona cefálica hasta que llegue a la arteria pulmonar. Luego, encienda la bomba y perfunda el tejido con aproximadamente 200 mililitros de PBS durante una hora hasta que todo el tejido pulmonar haya cambiado a un color blanco.
Al final de la perfusión cortar el tejido conectivo que rodea la tráquea, los pulmones y el corazón, y utilizar una sutura para atar el bronquio principal derecho. A continuación, cosecha todos los lóbulos individuales del pulmón derecho y coloca el corazón y los lóbulos del pulmón izquierdo en jeringas individuales de 10 mililitros que contengan un fijador adecuado. Retirar el émbolo creando un vacío en la jeringa para inflar los pulmones y extraer el pulmón de la jeringa.
Inserte una cánula de calibre 20 en la tráquea y use una sutura para asegurar la cánula en su lugar. Conecte una jeringa de un mililitro llena de fijador a la cánula y llene el pulmón con un fijador adicional para comprobar si hay fugas. Asegúrese de que el sitio de inserción esté asegurado para evitar que la muestra pulmonar se desprenda de la placa pulmonar durante la fijación.
Luego transfiera el tejido al equipo de presión de fijación pulmonar, extrayendo la muestra y atando la tráquea con un nudo al final del período de fijación. El componente inferior del equipo de presión de fijación pulmonar en el que se inserta la muestra pulmonar se conecta a través de la cánula de calibre 20 a la punta del flujo de formol con una llave de tres vías. La presión se genera a partir de los diferentes niveles de superficie del fijador entre los compartimentos inferior y superior.
La diferencia de presión es de 25 centímetros de agua, pero la perilla de ajuste de altura se puede utilizar para ajustar la presión a entre 25 y 30 centímetros de agua. Una bomba conecta los contenedores inferior y superior, conservando una diferencia de 25 centímetros en la altura de la superficie fijadora, y dirige el flujo del agente. Después de 48 horas de fijación, los pulmones de los ratones noqueadores SMP30 expuestos al aire ambiente no presentan un marcado agrandamiento del espacio aéreo.
Sin embargo, se observa un importante agrandamiento del espacio aéreo y destrucción de la pared alveolar en ratones knockout SMP30 expuestos al humo crónico del cigarrillo. Además, la intercepción lineal media y el índice destructivo de los especímenes pulmonares son significativamente mayores en los ratones knockout SMP30 expuestos al humo que en los animales expuestos al aire. Nuestro laboratorio utiliza 10% de formalina, pero los investigadores pueden utilizar otros agentes de fijación de acuerdo con sus necesidades experimentales.
Como hemos informado utilizando el sistema de fijación demostrado muestras pulmonares se pueden cosechar de varios modelos de enfisema de ratón para su evaluación morfométrica. Como los agentes de fijación pueden ser peligrosos, siempre use el equipo de protección del personal adecuado y trabaje en una habitación bien ventilada.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para la fijación pulmonar que garantiza condiciones estables para la evaluación histológica de muestras pulmonares provenientes de un modelo murino de enfisema. La técnica permite la fijación simultánea de múltiples pulmones sin colapso ni desinflado.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Histología
Antecedentes
- El enfisema es una afección pulmonar que a menudo es inducida por el humo del cigarrillo.
- La evaluación histológica es fundamental para comprender la patología pulmonar.
- Mantener la inflación pulmonar durante la fijación es esencial para una evaluación precisa.
- Este protocolo aborda los desafíos en las técnicas de fijación pulmonar.
Objetivo del estudio
- Presentar un método confiable para la fijación pulmonar.
- Facilitar la evaluación de muestras pulmonares en la investigación.
- Mejorar la consistencia en el análisis histológico de modelos de enfisema.
Métodos Utilizados
- Uso de un dispositivo de fijación que mantiene una presión constante.
- Incisión a lo largo de la línea media del ratón para acceder a la cavidad torácica.
- Punción del diafragma para abrir el espacio torácico.
- Visualización de los pulmones y el corazón para la recolección de muestras.
Resultados principales
- Mantenimiento exitoso de la inflación pulmonar durante la fijación.
- Capacidad para fijar múltiples pulmones simultáneamente.
- Espécimenes histológicos estables adecuados para evaluación.
- Realización del procedimiento por un estudiante de posgrado.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para la fijación pulmonar.
- Mejora la calidad de las evaluaciones histológicas en la investigación.
- Esta técnica puede aplicarse a diversos estudios que involucran patología pulmonar.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La fijación pulmonar constante bajo presión controlada aborda un desafío crítico en modelos preclínicos de enfermedades respiratorias al permitir una evaluación histológica reproducible del enfisema en ratones. Este método facilita un análisis morfométrico confiable, reduce la variabilidad y mejora la confianza predictiva en la validación temprana de dianas para la investigación de la EPOC. La capacidad de procesar múltiples especímenes simultáneamente agiliza los estudios comparativos y apoya decisiones sólidas de selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación morfométrica estandarizada de la gravedad del enfisema en modelos de ratón.
- Apoya la validación funcional de dianas candidatas al proporcionar una arquitectura tisular reproducible.
- Facilita la reducción del riesgo biológico al minimizar los artefactos inducidos por la fijación.
- Mejora la confianza predictiva al vincular puntos finales histológicos con hipótesis mecanicistas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara especímenes de pulmón validados para ensayos histológicos cuantitativos posteriores.
- Asegura la reproducibilidad y comparabilidad entre cohortes experimentales.
- Permite el procesamiento escalable de múltiples muestras en condiciones idénticas.
- Posibilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre la estructura pulmonar en campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea modelos preclínicos de patología pulmonar con puntos finales relevantes para la enfermedad en estudios traslacionales.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la estandarización de la preparación de tejidos.
- Reduce el riesgo de hallazgos artifactualos que podrían confundir las evaluaciones de biomarcadores o eficacia.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos histológicos robustos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de fijación a presión constante se integra en la continuidad del descubrimiento temprano y la validación preclínica, apoyando tanto la validación de dianas como la identificación de compuestos líderes en modelos de enfermedades respiratorias.
- Biología del descubrimiento: Proporciona una arquitectura tisular confiable para pruebas de hipótesis y análisis de vías en modelos de enfisema.
- Selección: Brinda resultados histológicos cuantitativos y reproducibles para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite mediciones morfométricas como el intercepto lineal medio y el índice de destrucción para análisis comparativo.
- Investigación traslacional: Facilita la correlación entre hallazgos preclínicos y la patología clínica del enfisema cuando es pertinente.
- Reutilización empresarial: Ofrece una capacidad estandarizada de fijación adaptable a diversos modelos de enfermedades pulmonares en ratones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva y la validación de objetivos al minimizar la variabilidad en la fijación.
- Valor operativo: Aumenta el rendimiento y la estandarización al permitir la fijación simultánea de múltiples especímenes.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al respaldar puntos finales histológicos robustos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de programas para enfermedades respiratorias basada en datos tisulares confiables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en procedimientos quirúrgicos en ratones y manejo de tejido pulmonar.
- Necesita equipo de fijación especializado capaz de mantener una presión constante.
- Exige la estandarización entre equipos de los parámetros de fijación para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diferentes fijadores según los requisitos experimentales.
- Debe abordar los protocolos de seguridad para el manejo de agentes de fijación peligrosos.
