Síntesis, caracterización y aplicación de nanosondas de óxido de hierro superparamagnético sin empleo para la detección de tuberculosis extrapulmonar

A nivel mundial, el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar a menudo se retrasa, ya que requiere una intervención quirúrgica para la confirmación debido a una presentación clínica no específica y un bajo rendimiento en las pruebas diagnósticas. Para mejorar las pruebas diagnósticas serológicas de los antígenos De Mycobacterium tuberculosis, hemos desarrollado nanosondas de óxido de hierro superparamagnéticas para detectar tuberculosis extrapulmonar. Las nano sondas TB-SPIO pueden proporcionar imágenes precisas de resonancia magnética a bajas concentraciones debido a sus propiedades paramagnéticas sin inducir ninguna respuesta autoinmune.

Las nanosondas TB-SPIO permiten la focalización y detección de la infección por Mycobacterium tuberculosis. También se pueden aplicar como agente de contraste de RMN para la detección de otras enfermedades. Asegúrese de estudiar el protocolo cuidadosamente antes de intentar el protocolo, ya que cada parte del experimento utiliza una tecnología de núcleo específica.

La demostración visual del método puede ayudar a los alumnos a entender cómo implementar el proceso, especialmente para algunos de los experimentos más complicados. Para preparar nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubierto de dextrano, combine vigorosamente cinco mililitros de dextrano T40 con 45 miligramos de cloruro férrico acuoso hexahidrato y 32 miligramos de soluciones tetrahidratos de cloruro ferroso a temperatura ambiente. Agregue rápidamente 10 mililitros de hidróxido de amonio y utilice una barra de agitación para agitar la suspensión negra resultante durante una hora a temperatura ambiente.

Al final de la incubación de agitación, centrifugar la solución y retirar los agregados. Para separar los productos SPIO finales del dextrano T40 sin ataduras, cargue toda la mezcla de reacción de cinco mililitros en una columna de cromatografía de filtración de gel de 2,5 por 33 centímetros y eluda el dextrán con 0,1 molar de acetato de sodio y 0,15 molares de solución tampón de cloruro sódico. A continuación, recoja las nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubiertas de dextrano purificadas en el volumen vacío y ensaye la columna para hierro y dextrán a 330 y 490 nanómetros de acuerdo con los protocolos estándar.

Para crear anticuerpos superficiales conjugados con SPIO Mycobacterium tuberculosis, primero sintetice el anhídrido succínico SPIO-EDBE mezclando 10 mililitros de una solución alcalina de SPIO-EBDE con un gramo de anhídrido succínico durante 24 horas a temperatura ambiente. Al día siguiente, utilice un tubo de membrana porosa molecular de 12.000 a 4.000 peso molecular para marcar la solución con cambios de 26 horas de dos litros de agua destilada por cambio. Después del último cambio, añadir 100 microlitros de la solución resultante a 400 microlitros de 4,5 miligramos por mililitrofers TB anticuerpo de superficie, seguido de la adición de 1-hidroxibenzotriazol y benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinophosphonium hefluorxaophosphate as catalysts at room temperature for 24 hours with stirring.

Separe las soluciones del anticuerpo no enlazado a través de la cromatografía de filtración de gel utilizando PBS como tampón. Para determinar el tamaño medio de partícula, la morfología y la distribución del tamaño, suelte la dispersión compuesta en una rejilla de cobre de 200 mallas y seque la muestra al aire a temperatura ambiente antes de cargarla en un microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes a 100 kilovoltas. Para medir los valores de tiempo de relajación de las nano sondas, utilice un relajanteómetro de resonancia magnética nuclear a 20 megahercios y 37 grados Centígrados más o menos un grado.

Para las imágenes celulares pulsadas por nanosondas, primero cultive monocitos humanos de THP-1 de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular. Cuando las células han alcanzado la etapa apropiada de activación, preincubate una vez 10 a los siete monocitos con una por 10 a las sextas unidades formadoras de colonias de Mycobacterium bovis BCG durante una hora. Al final de la incubación, transfiera las células a tubos de microcentrífuga de un mililitro y agregue dos mililitros de nanosondas conjugadas con anticuerpos conjugados con anticuerpos de superficie SPIO Mycobacterium tuberculosis a cada tubo para una incubación de una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets en 200 microlitros de medio fresco. A continuación, escanee las muestras utilizando una secuencia de pulsos de eco de gradiente rápido a través de imágenes de resonancia magnética de 3.0-T para determinar la especificidad y sensibilidad de las nanosondas. Para inocular animales experimentales con M.bovis BCG, primero reconstituya la vacuna liofilizada o el stock bacteriano en el medio de Sauton y diluya la solución reconstituida con solución salina.

A continuación, cargue 100 microlitros de la solución en una jeringa de un mililitro por animal e inyecte todo el volumen de bacterias intradérmicamente en la piel escapulosa dorsal izquierda o derecha de cada ratón. Para la resonancia magnética in vivo de animales vivos inyectados con nanosaldades, adquiera imágenes basales de eco de giro rápido ponderadas en T2 de cada animal experimental anestesiado antes de inyectar dos nanomolares de sondas de anticuerpos SPIO-TB suspendidas en 200 microlitros de solución salina en la vena de la cola de cada ratón. A continuación, vuelva a hacer la imagen de los animales inmediatamente después de la inyección y cada cinco minutos durante los siguientes 30 minutos.

Al final de la sesión de imágenes, analice cuantitativamente todas las imágenes de resonancia magnética utilizando la intensidad de la señal como medida de las regiones definidas de interés en lugares comparables de un centro de granuloma M.tuberculosis y el músculo posterior adyacente a un área de granulomatis. A continuación, utilice la fórmula para calcular las mejoras relativas de la señal utilizando la medición de intensidad de la señal antes y de cero a tres horas después de la inyección de los agentes de contraste. Un mes después de la inoculación, recoger el tejido del sitio de inoculación intradérmica de cada animal y manchar las muestras de tejido de cinco a 10 micras de espesor incrustadas en formalina con hematoxilina y eosina, manchas de Ziehl-Neelsen para bacterias ácidas y rápidas, y azul de Berlín para hierro férrico.

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de nanosondas de anticuerpos superficiales SPIO-TB revelan que las nanosondas presentan un aspecto bien disperso con un tamaño promedio de 3,8 más o menos 0,4 nanómetros por núcleo. M.bovis BCG y la cepa bacteriana ácida rápida se pueden detectar a través de la tinción de Ziehl-Neelsen. Después del aislamiento y el cultivo con sondas que contienen hierro férrico, las bacterias se pueden identificar a través de la tinción azul de Berlín.

El grado de focalización de la tuberculosis de las nano sondas de anticuerpos superficiales SPIO-TB se puede determinar mediante imágenes de resonancia magnética ponderadas por T2, tal como se indica mediante una disminución de la intensidad de la señal en presencia de las nanosondas que se producen de manera dependiente de la concentración. En los animales con inyección de nanosonda, la mejora ponderada por T2 de la reducción de la señal en las zonas de M.tuberculosis granulomatis es aproximadamente 14 veces mayor que la de los sitios de control. Un mes después de la infección, se puede observar un granuloma subcutáneo organizado en ratones C57 negros C57 con nueva vascularización sanguínea y agregados de macrófagos linfocitos y epiteloides observados dentro de estas lesiones.

La expresión positiva de M.tuberculosis también se observa en las áreas granulomatosas con tinción de bacilos ácido-rápido positiva positiva en el sitio de la lesión. El azul berlineso, una mancha positiva de hierro férrico, también se puede utilizar para determinar la sensibilidad de las sondas a la tuberculosis. Para la resonancia magnética in vivo de la vida, los animales inyectados con nanopiro adquieren la imagen basal de eco de giro rápido ponderada en T2 de cada animal experimental anestesiado antes de inyectar las sondas de anticuerpos SPIO-TB. Ahora que hemos establecido la técnica SOP para detectar la tuberculosis extrapulmonar, estos anticuerpos se pueden utilizar para diagnosticar específicamente la tuberculosis extrapulmonar.