Name: Transdérmica de medición de la tasa de filtración Glomerular en los ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a medir la tasa de filtración glomerular transdérmica en ratones conscientes usando el monitor tGFR con FITC-sinistrin. Este método minimamente invasivo permite evaluar la función renal con alta precisión sin anestesia.

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Este trabajo fue apoyado por el centro de Vanderbilt de la enfermedad de riñón (VCKD) y fue financiado en parte por las subvenciones siguientes: DOD PR161028 y R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Reconocemos el apoyo a LS, PM y BW por el MRC, EPSRC y financiado por el BBSRC Reino Unido regenerativa medicina plataforma "Seguridad y eficacia, en el centro de tecnologías de la proyección de imagen" (Señor/K026739/1).

Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas locales en el Reino Unido y Estados Unidos. Experimentos llevados a cabo en la Universidad de Liverpool se realizaron bajo una licencia concedida en virtud de la ley de animales (procedimientos científicos) de Reino Unido de 1986 y fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Liverpool. Los experimentos animales en Vanderbilt University Medical Center fueron aprobados por la Comisión de uso y de Vanderbilt institucional Animal Care.
1. preparación de la FITC-sinistrin
<ol><li>Preparar el FITC-sinistrin de 40 mg/mL en tampón fosfato salino (PBS). Nota: Alícuotas pueden almacenarse a-20 ° C durante varios meses con ninguna disminución notable en la calidad; sin embargo deben evitarse múltiples ciclos de hielo-deshielo. FITC-sinistrin es sensible a la luz, mantenga el tubo protegido de la luz.</li>
	<li>Calcular el volumen de FITC-sinistrin necesario para cada ratón:<ol>
<li>Peso de cada ratón en cada día de medición.</li>
		<li>La dosis recomendada es de 0.15 mg FITC-sinistrin por gramo de peso corporal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ratón preparación
<ol><li>Preparar jaulas separadas para los ratones mientras que las mediciones de la tasa de filtración glomerular. Proveer toallas de papel absorbente y unas bolitas de comida.</li>
</ol>3. quitar el pelo de ratón (1-2 días antes de la medición de la tasa de filtración glomerular)
<ol><li>Anestesiar el ratón con isoflurano 3% y una vez que el ratón está dormido, mantener la anestesia con isoflurano de 1.5 – 2%, dependiendo de la tasa de respiración de ratón. Coloque el ratón propensos en una almohadilla de calor.</li>
	<li>Use una afeitadora eléctrica, ir en contra de la dirección de la piel, para eliminar la mayor parte de la piel de un lado de la parte trasera del ratón. Afeitado al ras de la parte superior de las patas traseras hasta el cuello y a través de las costillas.</li>
	<li>Aplique una capa delgada de crema de depilación en la zona depilada con un bastoncillo de algodón (figura 1A). Mueva el bastoncillo contra la dirección de la piel para asegurar que la crema se aplica a la piel como sea posible.</li>
	<li>Retirar la crema después de 1 a 3 minutos por lavar con torundas de algodón y agua tibia. No realizar la medición Si la piel aparece muy roja e irritada después de la medida y no repetir la depilación dentro de 72 h para evitar dañar la piel.</li>
</ol>4. preparar al Monitor GFR transdérmica
<ol><li>Utilice uno de los dos tamaños de parches que están disponibles. La primera es de 2.5 x 3 cm2 en tamaño y puede ser utilizada para mediciones en ratones directamente. Los otros parches son 6 x 3 cm2 en tamaño y están destinados a ser utilizados en las ratas o animales más grandes pero se pueden cortar a un tamaño más pequeño para el uso en ratones.</li>
	<li>Despegue el revestimiento de un lado del parche y pegar el dispositivo de la GFR en el lado adhesivo, colocación de los LEDs exactamente por encima de la ventana.</li>
	<li>Corte el parche adhesivo sobrante para ajustarse al tamaño de la batería y pegar un lado del parche a la batería.</li>
</ol>5. colocar al Monitor GFR transdérmica
<ol><li>Anestesiar el ratón con isoflurano como se describe en el paso 3.1 y coloque el ratón propensos en una almohadilla de calor. Anestesiar ratones sólo para colocación del monitor GFR transdérmica y la inyección de FITC-sinistrin; permite recuperar de la anestesia para la medida del decaimiento FITC.</li>
	<li>Limpiar la piel previamente afeitada con etanol al 70%. Coloque aproximadamente 12 cm de cinta de seda hipoalergénico bajo el ratón (figura 1B; el ancho de la cinta debe reducirse a 1,5 – 2 cm, por lo que no es demasiado ancha para el ratón).</li>
	<li>Coloque la cinta de modo que es sólo aproximadamente 2 cm lado derecho del ratón, y el resto está a la izquierda. Doblar el borde sobre uno del lado derecho de la cinta de fácil colocación y el retiro después de la medición. Las instrucciones de izquierda a derecha para pasos 5.3 y 5.6 para colocación de dispositivo en el lado derecho del animal y pueden ser intercambiadas para la colocación del dispositivo en el lado izquierdo del animal, si es necesario.</li>
	<li>Conecte la batería al dispositivo, retire el papel protector de la batería y colóquela firmemente en la parte superior del dispositivo. El dispositivo está listo para su uso y adquisición de datos comienza cuando el azul diodos electroluminosos (LED) empiezan a parpadear.</li>
	<li>Retire la parte posterior del dispositivo y coloque sobre la piel afeitada. Coloque el dispositivo tal que la ventana exponiendo los LEDs es sobre las costillas – no lo tienen demasiado cerca a la columna vertebral o las extremidades (figura 1).</li>
	<li>Fije el aparato con la cinta blanca. Garantizar la derecha primero (figura 1), envolver firmemente alrededor de los bordes del dispositivo, luego envolver el lado izquierdo en el ratón y el dispositivo (Figura 1E). Idealmente, el lado izquierdo de la cinta sólo cubre el dispositivo y la derecha termina en abdomen del ratón.</li>
	<li>Coloque la cinta presionando junto a la circunferencia del cuerpo del ratón. La cinta debe colocarse firmemente, pero no. Si es demasiado flojo y el dispositivo se moverá alrededor de demasiado y causar artefactos de movimiento. Sin embargo, no debe ser tan fuerte que restringe la respiración o movimiento o ejerce demasiada presión sobre la piel.</li>
	<li>Dejar el dispositivo sin tocar durante 3 minutos antes de la inyección de FITC-sinistrin para permitir un fondo constante de lectura para ser tomado. En este tiempo, caliente la cola con una almohadilla de calor o un guante lleno de agua tibia para preparar para la inyección de la vena de la cola (si está usando esta ruta).</li>
</ol>6. FITC-sinistrin inyección
<ol><li>Preparar una jeringa de insulina con la cantidad calculada de FITC-sinistrin necesaria para la inyección (esto puede ser redondeado a la más cercana 10 μL).</li>
	<li>Administrar FITC-sinistrin por la vena de la cola o por inyección retro-orbitales. FITC-sinistrin debe ser administrada en un bolo suave pero rápido, para evitar múltiples picos en la curva de separación. Es mejor administrar sólo una dosis parcial que to múltiples intentos de administrar la FITC-sinistrin.</li>
</ol>7. medición de la TFG
<ol><li>Coloque el ratón en una jaula por su cuenta para recuperar de la anestesia isoflurano y durante el período de medición.</li>
	<li>Observar el ratón en la jaula durante 1,5 h y retire el dispositivo. Quitar el dispositivo de ratón consciente es rápido, eficaz y generalmente bien tolerados por el ratón, pero los nuevos usuarios pueden preferir a anestesiar el ratón para este paso.<ol>
<li>Como opción, anestesiar el ratón con isoflurano.</li>
		<li>Como la otra opción, coloque el ratón sobre la rejilla encima de la jaula, lo que permite el ratón para agarrar las barras de metal mientras el dispositivo se quita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tire de la cinta de yeso blanco de debajo del vientre en un movimiento rápido, suave y retire el dispositivo y yeso negro de la piel. Tenga cuidado de que la batería no desconecte el dispositivo aún.</li>
	<li>Volver el ratón a su jaula casera.</li>
</ol>8. lectura y evaluación de los datos
<ol><li>Con cuidado desconectar la batería del dispositivo</li>
	<li>Conecte el dispositivo al cable USB y luego conectar el cable a la computadora</li>
	<li>Abra el software de lectura (Sensor_ctrl_app.exe)</li>
	<li>En orden, haga clic en "conectar", "leer", "cambiar nombre" y luego "guardar", cerrar el programa</li>
	<li>Procesar y evaluar los datos en el software de análisis como se describe en el manual respectivo</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (5), F783-F788 (2012).</li>
<li>MediBeacon. Related Publications. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.medibeacon.com/preclinical/publications/">http://www.medibeacon.com/preclinical/publications/</a> (2018).</li>
<li>Friedemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+kinetic+model+for+the+transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+experimental+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Improved kinetic model for the transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in experimental animals.</a> Kidney International. 90 (6), 1377-1385 (2016).</li>
<li>Schock-Kusch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+various+strains+of+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of transcutaneous measurement of renal function in various strains of conscious mice.</a> PLoS One. 8 (8), e71519(2013).</li>
<li>Schock-Kusch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li>
<li>Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+Assessment+of+Renal+Function+in+Conscious+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53767(2016).</li>
<li>Cowley, A. W. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+glomerular+filtration+rate+reduction+determined+in+conscious+Dahl+salt-sensitive+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats.</a> Hypertension. 62 (1), 85-90 (2013).</li>
<li>Scarfe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+kidney+function+by+minimally+invasive+techniques+correlate+with+histological+glomerular+damage+in+SCID+mice+with+adriamycin-induced+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Measures of kidney function by minimally invasive techniques correlate with histological glomerular damage in SCID mice with adriamycin-induced nephropathy.</a> Scientific Reports. 5, 13601(2015).</li>
<li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344(2018).</li>
<li>Street, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adenosine+1a+receptor+signaling+on+GFR+early+after+the+induction+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of adenosine 1a receptor signaling on GFR early after the induction of sepsis.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 314 (5), F788-F797 (2018).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxemic+acute+renal+failure+is+attenuated+in+caspase-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endotoxemic acute renal failure is attenuated in caspase-1-deficient mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 288 (5), F997-F1004 (2005).</li>
<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
<li>Bankir, L., Yang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+urea+and+glucose+handling+by+the+kidney%2C+and+the+urine+concentrating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism.</a> Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).</li>
<li>Peters, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+basis+of+glomerular+filtration+rate+measurement+and+new+concepts+of+indexation+to+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">The kinetic basis of glomerular filtration rate measurement and new concepts of indexation to body size.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 31 (1), 137-149 (2004).</li>
<li>Chapman, M. E., Hu, L., Plato, C. F., Kohan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioimpedance+spectroscopy+for+the+estimation+of+body+fluid+volumes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bioimpedance spectroscopy for the estimation of body fluid volumes in mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 299 (1), F280-F283 (2010).</li>
</ol>

D S-K, JF y YS son empleados directamente en MediBeacon GmbH el fabricante y distribuidor del monitor GFR transdérmica. D S-K y JF son inventores patentes y solicitudes de patente para la tecnología actual.

Este manuscrito y el acompañamiento vídeo de entrenamiento proporcionan directrices prácticas para el uso de transdérmica monitores GFR en ratones. Los pasos más críticos en el procedimiento son la correcta fijación del dispositivo en la espalda del animal y bien envolviendo la cinta alrededor del abdomen. La mejor posición es ligeramente izquierda o derecha de la línea media, sobre la caja torácica. El parche y el dispositivo necesitan para fijarse firmemente a la piel, pero no debe ser tan fuerte que restringen la respiración, movimiento, o afectan la circulación de la sangre de la piel debajo del dispositivo, como esto llevaría mediciones defectuosas/inexactas. Además, puesto que el control se produce en ratones conscientes después de que se han recuperado de la anestesia, correcta colocación del dispositivo por parte del cuerpo con menor interferencia de resultados de movimiento en las mediciones de transdérmica con pequeños artefactos de movimiento. Por esta razón, es importante que el dispositivo no esté muy próxima a la parte superior de miembros para que los ratones pueden mover libremente sus hombros.
Es importante depilar los ratones uno o dos días antes de la medición de la TFG, como depilación afecta a la medición de la separación de FITC-sinistrin, con datos preliminares indicando que depilación inmediatamente antes de la medición de transdérmica GFR aumenta la vida media aparente de FITC-sinistrin. Se desconoce el mecanismo para ello. Por lo tanto, para obtener mediciones fiables sobre varios puntos del tiempo y entre experimentos, es recomendable depilarse los ratones con antelación, para permitir que la piel a recuperarse de este proceso antes de proceder con las mediciones de la tasa de filtración glomerular. Crema de depilación no debe aplicarse a la misma área de piel dentro de las 72 h de una solicitud previa, para evitar daño químico a la piel. En muchos casos, el piel re-crecimiento tarda varios días o hasta una semana, y así se puede evitar fácilmente reaplicación de depilación crema dentro de las 72 h.
Porque hasta un 50% de suero creatinina es excretada por sección tubular en ratones13, y porque hay mayor reabsorción de urea de los túbulos renales cuando los ratones son deshidratados14, creatinina sérica y BUN son pobres marcadores de la función renal. Sin embargo, debido a su comodidad, estos ensayos continúan ser utilizado como la principal medida de la función renal en estudios preclínicos de CKD y AKI en ratones. Sin embargo, de acuerdo con la importante contribución de secreción tubular a excreción de creatinina en ratones con normal o cerca de la función renal normal13, creatinina del suero demostró poca correlación con la separación de FITC-sinistrin a precios de liquidación alta (baja Vida media FITC-sinistrin), indicando que la creatinina es una medida insensible de la función renal en ratones con lesión renal leve. En contraste, mientras que el bollo se correlaciona bien con la separación de FITC-sinistrin en ratones con insuficiencia renal leve, existe pobre correlación entre BUN y FITC-sinistrin despacho en ratones con lesión renal más severa (alta FITC-sinistrin Half-Life). Esto es probablemente causado por efectos de la reabsorción de urea asociado con deshidratación en animales enfermos con lesión renal grave.
Una ventaja importante de la medición de GFR transdérmica, comparada con cualquier otro despacho de bolo o técnicas de infusión constante para la medición de la TFG, es que no requiere colecciones cuidadosamente cronometrados de sangre u orina. Estos pueden ser particularmente difíciles en ratones ya que tienen volúmenes de sangre total bajo y salida urinaria en comparación con las ratas. Además, ratones necesitan ser manipulados sólo para fijar el dispositivo y la inyección, pero no para venipunctures múltiples, como se requiere para bolo clásico espacio experimentos15. Además, la duración de la anestesia es corta, y como tal es posible realizar mediciones repetidas en los ratones con el tiempo. La frecuencia en que las mediciones se pueden realizar principalmente depende del estado de salud de los ratones, la aptitud del investigador para inyecciones intravenosas y las regulaciones institucionales locales en las sesiones de anestesia repetida. En ratones sanos, ileso, transdérmica GFR las mediciones pueden realizarse diariamente, con efectos mínimos o no perjudiciales en el ratón. Sin embargo, ratones heridos sufren de AKI o CKD no toleran anestesia repetidas sesiones así como los ratones sanos, y por lo tanto debe reducirse la frecuencia de las mediciones.
La principal limitación de la medida de GFR transdérmica, en comparación con los métodos de separación de bolo para medir la tasa de filtración glomerular en los ratones es que la cinética de excreción se miden sólo como cambio en la intensidad de fluorescencia relativa en el tiempo y no como las concentraciones de indicador absoluto. Debido a esto, sólo es posible medir la constante de la tarifa del decaimiento exponencial solo de la excreción de cinético, que es una estimación muy cercana del GFR normalizado el volumen extracelular16. Para expresar la tasa de filtración glomerular en mL/min, el volumen extracelular de los animales tiene que ser estimado utilizando un factor de conversión que se estableció en estudios anteriores en que fueron medidas simultáneas de las concentraciones plasmáticas de FITC-sinistrin realizado1. Sin embargo, este factor de conversión puede no correctamente calcular volúmenes de líquidos extracelulares igualmente bien en todos los ratones, ya que el volumen de líquido puede verse afectado por una variedad de extraños factores incluyendo la edad, sexo, estado de hidratación (que puede ser afectado por quirúrgico intervenciones, así como la lesión renal) y17. Sin embargo, a diferencia del bolo dosificación método para evaluar la tasa de filtración glomerular en los ratones, medición transcutánea de GFR está sujeta a menos variabilidad operador dependiente ya que no es afectado por errores de dosificación o por errores en la sincronización de colecciones de sangre.
Otra limitación de la técnica de medición transcutánea de GFR es que cambios de señal de línea de base pueden ocurrir durante el transcurso de la medición debido al blanqueamiento de piel fluoróforos y la anestesia necesaria para la inyección de dispositivo accesorio y palpador. Esta limitación fue abordada por Friedemann y sus colegas mediante la implementación de un algoritmo de corrección3. La implementación de este algoritmo condujo a una mejora en la precisión de la técnica transdérmica comparable a una técnica de infusión constante de evaluación de la tasa de filtración glomerular.
Una pregunta más frecuentes es si la pigmentación de la piel en cepas de ratón diferente afecta la transdérmica FITC-sinistrin despacho. Pigmentación de la piel reduce la intensidad de la señal de FITC-sinistrin ya que los pigmentos oscuros absorbe la excitación azul y la verde emisión señales de FITC-sinistrin mediciones. Sin embargo, la tasa de excreción de FITC-sinistrin es independiente de la general intensidad de la señal. Además, mientras que la señal medida es más baja, la señal de fondo también es menor en los ratones pigmentados. Porque la señal de fondo es una mezcla de Autofluorescencia de piel fluoróforos y reflexión de la luz de excitación, hemos encontrado que el cociente de la señal de fondo al máximo es comparable o incluso mejor, en los animales pigmentados. Además, los artefactos de movimiento, que son causadas por la exposición de la piel circundante a luz reflejada, se reduce en ratones pigmentados ya que la luz reflejada también se absorbe por piel pigmentada.
En conclusión, la técnica que hemos presentado permite la medida exacta de GFR en consciente, libremente mover ratones de todo tipo de piel. Como la técnica es independiente de la muestra de sangre, puede ser utilizado varias veces en el mismo animal para observaciones longitudinales en modelos de ERC, así como para la medición de los rápidos cambios de la tasa de filtración glomerular que ocurre después de la inducción de AKI.

El uso de transcutánea GFR monitores en ratones primero fue divulgado por Schreiber y sus colegas en 2012 y se validó comparando medidas de FG obtenidas mediante esta técnica, con resultados obtenidos por medición directa de FITC-sinistrin bolo entre muestras de sangre serie1. Hasta la fecha, ha habido 35 publicaciones peer-review en el que se han utilizado monitores transcutáneos de la tasa de filtración glomerular en ratas y ratones (una lista actualizada de artículos de revistas y resúmenes de congresos en que se utilizó el monitor preclínico de GFR puede encontrarse en el MediBeacon sitio Web2). Mediciones de GFR transdérmica en ratas y ratones se ha descrito en un número de publicaciones1,3,4,5, y un video tutorial que demuestra su uso en ratas ha publicado6. Sin embargo, la medición en ratones presenta desafíos técnicos adicionales. Presentamos a la primera guía práctica detallada para el uso de monitores GFR transdérmica en ratones.
Hay una variedad de razones por qué los investigadores están comenzando a favorecer el uso de monitores GFR transdérmica para evaluar la función renal en modelos de roedores. Medición de transdérmica de FITC-sinistrin despacho ha demostrado para proporcionar una medida más sensible y exacta de la función renal en comparación con los parámetros tradicionales de la función renal como suero creatinina y sangre urea nitrógeno (BUN)7, 8. Mediante la implementación de un algoritmo de evaluación mejorada, Friedemann y colegas demostraron que el sistema alcanza precisión comparable al patrón oro, la técnica de infusión constante de la tasa de filtración glomerular medida3. Estudios recientes han demostrado también que el análisis secuencial con los monitores transcutáneos de GFR puede utilizarse para estudiar cambios tempranos en la función renal así como la recuperación funcional después de la inducción de la lesión renal aguda (AKI) sin interferir con la sangre de los animales volumen o hemodinámica, ya que el ensayo no requiere alternativamente sangre muestreo9,10. La capacidad de medir la tasa de filtración glomerular de alta precisión y sensibilidad repetidas veces en el mismo animal hace esta técnica atractiva para una variedad de disciplinas de investigación. Monitores GFR transdérmica han utilizado por las compañías farmacéuticas para evaluar la toxicidad de compuestos novedosos, así como en las universidades para la investigación básica y traslacional.

<table><tbody><tr><td>Monitor transdérmico de TFG (viene con 1 dispositivo, 2 baterías y 1 cargador)</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>TDM-MH001</td><td>Software de lectura: MPD Lab; Software de análisis: MPD Studio</td></tr><tr><td>Baterías adicionales</td><td>MediBeacon GmBH</td><td>PWR-BT0001</td><td></td></tr><tr><td>Parches de fijación</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>pequeño: PTC-SM001; grande: PTC-LG001</td><td></td></tr><tr><td>FITC-sinistrin</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>FTC-FS001</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de seda hipoalergénica</td> p<td>. ej. Durapore (1538-2), o Kendall (7138C), o Leukosilk (01032-00)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de anestesia, isoflurano, oxígeno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla</td><td></td><td></td><td></td>térmica</tr><tr><td>Afeitadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eléctrica Depilatoria (depilación) Crema</td><td>p. ej. Veet o Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td> Bastoncillos <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td>algodón</tr><tr><td>Temporizador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escalas 70</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% toallitas</td><td></td><td></td><td></td> de etanol</tr></tbody></table>

transdérmica de medición de la tasa de filtración glomerular en los ratones

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdérmico análisis de tasa de filtración glomerular (GFR) es una técnica establecida que se utiliza para evaluar la función renal en modelos de ratón y rata de la lesión renal aguda y enfermedad renal crónica. El sistema de medición consta de un detector de fluorescencia miniaturizados que se une directamente a la piel en la parte posterior de los animales conscientes y libremente móviles y mide la cinética de la excreción del trazador exógena de GFR, isotiocianato de fluoresceína (FITC) sinistrin conjugado (una análogo de la inulina). Este sistema se ha descrito en detalle en las ratas. Sin embargo, debido a su tamaño más pequeño, medición de la TFG transcutánea en ratones presenta desafíos técnicos adicionales. En este trabajo por lo tanto ofrecemos a la primera guía práctica detallada para el uso de los monitores GFR transdérmica en ratones basados en la experiencia combinada de tres investigadores diferentes que han estado llevando a cabo este ensayo en ratones durante varios años.

En esta sección presentamos resultados representativos del uso del monitor GFR transdérmica. El monitor de transdérmica se ha utilizado en una variedad de cepas de ratón y modelos de AKI y CKD2.
La figura 2 muestra curvas de remoción de FITC-sinistrin representante en ratones BALB/c machos antes y después de lesión de la reperfusión de la isquemia (IRI) con nefrectomía contralateral simultánea. FITC-sinistrin se elimina rápidamente de la circulación de ratones sanos (figura 2A), pero la separación se retrasa dramáticamente en ratones con AKI (figura 2B, C). En ratones con AKI muy severa, no puede haber ningún cambio en la fluorescencia FITC-sinistrin durante el período de medición de 90 minutos, lo que indica una ausencia completa de filtrado glomerular (figura 2).
Transdérmico GFR medida es mínimamente invasivo y puede utilizarse para monitorizar los cambios en la función del riñón en los ratones de la misma en varios puntos del tiempo. Figura 3 muestra los cambios en la tasa de filtración glomerular determinada por mediciones de separación secuencial transdérmica FITC-sinistrin basales y 1, 2 y 4 días después de inducir IRI (isquemia unilateral con nefrectomía contralateral simultánea). Datos incluyen FITC-sinistrin período de separación (Figura 3A), y tasa de filtración glomerular (figura 3B) calculada a partir de la medida FITC-sinistrin despacho Half-Life, como descrito por Schreiber et al1.
En la figura 4, la enfermedad renal crónica (ERC) fue inducida en ratones BALB/c machos realizando IRI unilateral prolongada seguida por nefrectomía contralateral retardada, como describe11. GFR se evaluó por separación transdérmica FITC-sinistrin el día 26 después del IRI inicial. El aumento de FITC-sinistrin período (Figura 4A) y por lo tanto la disminución de la GFR (Figura 4B), indican una función renal deteriorada en estos ratones. Estos datos demuestran que la medición transcutánea de GFR puede utilizarse para medir los cambios en la función renal en ratones con CKD.
Figura 5A muestra que FITC-sinistrin período se correlaciona estrechamente con gravamen histológico semicuantitativo de lesión tubular sobre las mediciones de rango completo de GFR en ratones ileso y en ratones con diferentes severidades de AKI IRI-inducida. Por el contrario, suero creatinina y sangre urea nitrógeno (BUN) mostró una positiva pero débil correlación con la separación de FITC-sinistrin (figura 5B, C), que indica que mediciones de GFR transcutáneas proporcionan una medida más confiable de renal lesiones (cuentas de lesión tubular) después AKI IRI-inducida que tanto la creatinina sérica o BUN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig1.jpg"> Figura 1: colocar el monitor GFR transdérmica. Fotografías del retiro del pelo (A), colocación de la cinta bajo el ratón (B), colocación del dispositivo sobre la piel (C) de ratón y asegurar el dispositivo envolviendo la cinta alrededor del ratón y el dispositivo (D-E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig1large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para Vea una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig2.jpg"> Figura 2: curvas de remoción de ejemplo FITC-sinistrin en ratones BALB/c machos antes y después de lesión de la reperfusión de la isquemia (IRI) con nefrectomía contralateral simultánea. Curvas de separación al inicio (A) y un día después de cirugía de la IRI (B) en el mismo ratón, indicando deterioro función renal en este ratón. (C) separación de la curva de un ratón más gravemente herido un día después de la cirugía IRI. No había ninguna separación de FITC-sinistrin durante el período de medición, que indica insuficiencia renal. Puntos negro datos representan datos en bruto, líneas azules representan el ajuste de 3 compartimientos y las líneas verdes representan intervalos de confianza del 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig3.jpg"> Figura 3: ratones machos BALB/c, 8-10 semanas de edad sufrió isquemia unilateral con nefrectomía contralateral simultánea (n = 5). GFR fue evaluada al inicio y durante los días 1, 2 y 4 después de la cirugía y en comparación con ratones control operado por el impostor (n = 5). FITC-sinistrin período en (A) se utilizó, junto con el peso corporal de los ratones, para calcular GFR (B). Puntos de datos representan animales individuales, y barras de error representan la media y error estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig4.jpg"> Figura 4: edad de ratones machos BALB/c 8-10 semanas experimentaron isquemia unilateral con nefrectomía contralateral retardada al día 8 (n = 5). GFR se evaluó por el día 26 y se comparó con ratones de edad comparable del control sano (n = 5). FITC-sinistrin período en (A) se utilizó, junto con el peso corporal de los ratones, para calcular GFR (B). Puntos de datos representan animales individuales, y barras de error representan la media y desviación estándar. Lesión tubular lo marcó 0-50 basado en el grado de formación de necrosis y fundido por un observador ciego (L.R.) sobre secciones de ácido peryódico-Schiff-manchadas del riñón. Este método fue adaptado de Wang y sus colegas12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig5.jpg"> Figura 5: correlación de tres medidas de la función renal, daño (evaluación histológica de lesión tubular (n = 39), creatinina del suero (n = 30) y sangre de nitrógeno ureico (BUN) (n = 30)) con la separación de FITC-sinistrin (vida media). Ratones BALB/c machos experimentaron períodos variables de pedículo renal unilateral de sujeción (25 – 45 minutos) o cirugía simulada, con nefrectomía contralateral simultánea para inducir la diferente gravedad de AKI, y la histopatología y los parámetros de la función renal se evaluaron en el día 4 después de IRI. La puntuación de la lesión tubular demostró una fuerte correlación positiva con la separación de FITC-sinistrin (A; R2 = 0.88), mientras que (B) de la creatinina sérica y BUN (C) ambos resultaron positivos pero más débil correlación con la separación de FITC-sinistrin (R2 = 0,64 y 0,52, respectivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se describe un protocolo para medir la tasa de filtración glomerular (GFR) en consciente, libremente mover ratones utilizando a un monitor GFR transdérmica.

Transdérmica de medición de la tasa de filtración Glomerular en los ratones

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Hoy, vamos a demostrar la técnica de medición transdérmica de filtración glomerular o tGFR en ratones. Hay una serie de características de este método que creo que vale la pena mencionar. En primer lugar, actualmente tGFR es la forma más precisa de evaluar la función renal en ratones.En segundo lugar, el tGFR se realiza en ratones conscientes y en movimiento libre para evitar las complicaciones de la anestesia. En tercer lugar, una vez que haya dominado la técnica, es razonable poder realizar mediciones de 30 a 40 tGFR en un solo día. Por último, las mediciones de tGFR se pueden realizar repetidamente en ratones in vitro.Lo que esto significa es que podemos realizar mediciones en serie de la función renal en entornos de enfermedades agudas y crónicas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores medir la tasa de filtración glomerular o GFR en ratones conscientes y en movimiento libre con alta precisión y sensibilidad. De uno a dos días antes de la medición tGFR, después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, coloque un ratón anestesiado en la posición propensa en una almohadilla de calor.Usando una afeitadora eléctrica, recorta contra la dirección del crecimiento para eliminar la mayor parte del pelaje de un lado de la parte posterior del ratón desde la parte superior de las patas traseras hasta el cuello y a través de las costillas. Usa un bastoncillo de algodón para aplicar una fina capa de crema de depilación a la piel expuesta en la dirección del crecimiento para asegurar que la crema se aplique lo más cerca posible de la piel y retire la crema después de uno a tres minutos con hisopos de algodón limpio y agua tibia. El día del procedimiento, recorte un parche adhesivo de seis por tres centímetros al tamaño del dispositivo GFR antes de despegar la parte posterior del parche y pegar el dispositivo en el lado adhesivo del parche con los diodos emisores de luz colocados inmediatamente por encima de la ventana transparente.A continuación, pegue una pequeña parte del parche en la batería. Para fijar el monitor, con el ratón anestesiado en la posición propensa, limpie la piel preafeitada con 70% de etanol y ajuste el ancho de una cinta de aproximadamente 12 centímetros rasgándola longitudinalmente. Coloque la cinta debajo del ratón con dos centímetros en un lado del animal doblando sobre un borde del lado derecho de la cinta para facilitar la colocación y extracción después de la medición.A continuación, conecte la batería al dispositivo, quitando el respaldo de la batería y colocando de forma segura la batería en el dispositivo. El dispositivo está listo para usar y la adquisición de datos comienza cuando los LED azules comienzan a parpadear. Retire el respaldo del parche en el dispositivo y coloque el dispositivo en la piel afeitada de modo que la ventana que expone los LED esté sobre las costillas asegurando el lado derecho del dispositivo con cinta adhesiva.Es importante garantizar una fijación segura del dispositivo sin restringir la movilidad del ratón ni ejercer demasiada presión sobre la piel. A continuación, envuelva firmemente el lado izquierdo de la cinta alrededor del ratón y el dispositivo. Permita que el dispositivo grabe una lectura de fondo constante durante tres minutos.Mientras tanto, caliente la cola con una almohadilla para la cabeza y cargue una jeringa de insulina con el volumen experimental adecuado de FITC-sinistrin para la inyección redondeada a los 10 microlitros más cercanos. Administrar la FITC-sinistrina por vía intravenosa en un bolo suave pero rápido. Es importante que el usuario se sienta cómodo con inyecciones intravenosas, ya que es necesario administrar con éxito la FITC-sinistrin en un bolo en lugar de varios intentos que dará lugar a múltiples picos en la curva de aclaramiento.Para medir el tGFR, coloque el ratón en su propia jaula con monitoreo hasta la recumbencia completa y permita que el aclaramiento FITC-sinistrin se registre durante 1,5 horas. Al final del período de medición, coloque el ratón en el estante de alambre en la parte superior de la jaula y permitiendo que el ratón agarre las barras metálicas, tire de la cinta desde debajo del vientre en un movimiento suave y rápido. A continuación, retire cualquier cinta del dispositivo y el parche de la piel, teniendo cuidado de que la batería no se desconecte del dispositivo y devuelva el ratón a su jaula.Para evaluar los datos, desconecte cuidadosamente la batería y utilice un cable USB para conectar el dispositivo al ordenador. Abra el software de lectura y haga clic en Conectar, Leer, Cambiar nombre y Guardar. A continuación, cierre el programa y procese y evalúe los datos en el software de análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Mientras que FITC-sinistrin se elimina rápidamente de la circulación en ratones sanos, este aclaramiento se retrasa dramáticamente en ratones con lesión renal aguda. En ratones con lesión renal aguda muy grave, puede haber muy poco o ningún aclaramiento de la fluorescencia FITC-sinistrin durante todo el período de medición de 90 minutos, lo que indica una ausencia completa de filtración glomerular. La medición transdérmica de GFR es mínimamente invasiva y, por lo tanto, se puede utilizar para controlar los cambios en la función renal en animales individuales en varios puntos de tiempo.De hecho, en este experimento representativo, las mediciones secuenciales demostraron cambios en la función renal a cero, uno, dos y cuatro días después de la lesión por reperfusión de isquemia. En este modelo de enfermedad renal crónica de ratón, la relación inversa de la vida media FITC-sinistrina con la GFR se puede correlacionar directamente con la función renal deteriorada observada en estos animales. De hecho, la vida media FITC-sinistrin se correlaciona estrechamente con la evaluación histológica semicuantitativa de la lesión tubular en toda la gama de mediciones de GFR en ratones no lesionados y en ratones con diferentes severidades de lesión aguda inducida por lesión por reperfusión de isquemia.Por el contrario, la creatinina sérica y el nitrógeno de la urea en sangre demuestran una correlación positiva pero más débil con el aclaramiento de FITC-sinistrin, lo que indica que las mediciones transcutáneas de GFR proporcionan una medida más fiable de la lesión renal que la creatinina sérica o el nitrógeno de urea en sangre. La medición transdérmica de GFR es una medida más sensible de la función renal que los biomarcadores tradicionales como la creatinina y el BUN. Esto proporciona una evaluación más precisa de la eficacia de nuevas terapias para la enfermedad renal en la investigación preclínica.Los pasos más críticos en este método son la fijación adecuada del dispositivo a la espalda del ratón y la administración IV exitosa de FITC-sinistrin. Estos pasos son esenciales para obtener una evaluación precisa de GFR en ratones.

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Investigación

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Medicine

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