Name: Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Aprende a cuantificar proteínas en regiones cerebrales de roedores mediante inmunohistoquímica con fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución. Este método permite analizar vías de señalización molecular y marcadores cognitivos de forma eficiente.

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La investigación en este informe fue financiada por una subvención de Target de los NIGMS (1P20GM103653) otorgada a DK.

El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Delaware. Las ratas macho de Sprague Dawley, de aproximadamente 55 a 75 días de edad, se utilizaron para este protocolo.
1. extracción del cerebro y preparación de tejido
<ol><li>Anestesiar rata con isoflurano en la cámara de inducción de anestesia hasta que la rata ya no exhibe una respuesta al pellizco del pie.</li>
	<li>Sacrificar ratas a través de una rápida decapitación usando una guillotina.</li>
	<li>Corte la piel en el cráneo posterior a la anterior y despejada de la parte superior del cráneo.</li>
	<li>Usa los roedores para remover cuidadosamente la parte posterior del cráneo, y luego usando pequeñas tijeras diseccionantes cortadas hacia abajo de la línea media del cráneo, empujando hacia arriba contra la parte superior del cráneo en todo momento para evitar dañar el tejido cerebral.</li>
	<li>Usa los roedores para quitar la mitad derecha e izquierda del cráneo para exponer el cerebro.</li>
	<li>Utilice una pequeña espátula para recoger bajo el cerebro y cortar los nervios, elevar cuidadosamente el cerebro y congelar los cerebros en isopentano refrigerado en hielo seco (al menos-20 ° c). Después de esto, almacenar los cerebros en un congelador-80 ° c hasta rebanar.</li>
	<li>Rebanar cerebros en regiones de interés a 30 – 50 μm en un criostato mantenido entre-9 ° c y-12 ° c. Monte directamente las rodajas sobre los portaobjetos de vidrio y guárdela en un congelador de-80 ° c hasta el momento del ensayo de inmunocitoquímica. Nota: En este protocolo, las regiones cerebrales de interés eran el hipocampo y la amígdala.</li>
</ol>2. reacción inmunohistoquímica única
Nota: Para la reacción inmunohistoquímica doble, el protocolo es el mismo que la reacción inmunohistoquímica única, excepto que esta reacción tiene dos anticuerpos primarios de diferentes hospedadores (por ejemplo, conejo y ratón) y dos anticuerpos secundarios para el correspondiente primarias deben ser de un solo huésped (p. ej., anticonejo de cabra y antiratón de cabra). Los anticuerpos secundarios también tienen que ser de dos espectros diferentes que están disponibles en escáneres de alta resolución. Por ejemplo, un anticuerpo secundario con un pico del espectro de emisión a 680 nm y un anticuerpo secundario 800CW (pico del espectro de emisión a 780 nm).
<ol><li>Retire los portaobjetos de vidrio del congelador y deje que se equilibren a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Bajo una campana de humo, fijar el tejido cerebral en 4% paraformaldehído en 0,1 M fosfato amortiguado salina (PBS) para 1 − 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas en 0,1 M Tris con solución salina tamponada (TBS) tres veces durante 10 min cada una. Permeabilizar las membranas celulares incubando diapositivas en un detergente suave (por ejemplo, 0,01% detergente) durante 30 − 60 min.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas en TBS tres veces durante 15 min cada una.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo primario para la proteína de interés en PBS en la concentración correcta. Por ejemplo, para detectar el gen temprano inmediato c-Fos, preparar un anticuerpo primario anti c-Fos de conejo en una concentración de 1:500.</li>
	<li>Pipetear la solución de anticuerpos primarios directamente sobre el tejido cerebral (aproximadamente 200 μL por diapositiva de 3 pulgadas x 1 pulgada).</li>
	<li>Utilice cubreobjetos para incubar el tejido cerebral sobre láminas de vidrio en la dilución de anticuerpos primarios para 1 − 2 h a temperatura ambiente o durante la noche (~ 17 h) a 4 ° c.</li>
	<li>Retire los cubreobjetos y lave las diapositivas en TBS que le hayan añadido una pequeña cantidad de detergente (p. ej., 0,01% de detergente, "TBS-T") cuatro veces durante 15 min cada una.</li>
	<li>Utilice cubreobjetos para incubar las secciones cerebrales en un anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 2 h. Nota: El anticuerpo secundario debe ser a la dilución correcta y en un diluyente que contenga TBS, detergente y 1,5% del suero huésped. Por ejemplo, un anticuerpo secundario de cabra en una dilución de 1:2000 contendrá un 1,5% de suero de cabra y un 0,05% de detergente.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas en TBS-T cuatro veces durante 20 min cada una, y luego en TBS cuatro veces por 20 min cada una.</li>
	<li>Seque los toboganes a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. Cuando las diapositivas están secas, están listas para la toma de imágenes.</li>
</ol>3. imágenes
<ol><li>Coloque las diapositivas sobre la interfaz de escaneo infrarrojo cercano con el tejido hacia abajo. Cualquiera de las imágenes una diapositiva de cristal o varias diapositivas a la vez utilizando una herramienta de selección.</li>
	<li>Diapositivas de imagen utilizando el ajuste de la más alta calidad con un desplazamiento de 0 nm y una resolución de 21 μm. El escaneo típicamente tomará de 13 − 19 h dependiendo del equipo de escaneo utilizado.</li>
	<li>Importar imágenes en el software de análisis de imagen (por ejemplo, ImageStudio) para ver y marcar para análisis de proteínas semi-cuantitativos.</li>
</ol>4. Análisis de expresión proteica
<ol><li>Abra el software de análisis de imagen y seleccione el área de trabajo en la que se escaneó la imagen.</li>
	<li>Abra la imagen escaneada en el software de análisis de imágenes para ver el escaneo, y ajuste las longitudes de onda visualizadas, así como el contraste, brillo y magnificación mostrados sin alterar la imagen cruda o la emisión total cuantificada.</li>
	<li>Identifique las regiones clave para la cuantificación y seleccione la pestaña análisis a lo largo de la parte superior de la página, luego seleccione dibujar rectángulo (o dibujar elipse/dibujar mano alzada) para dibujar un rectángulo sobre el área que se cuantificarán.</li>
	<li>Para ver el tamaño del rectángulo, seleccione formas a lo largo de la parte inferior izquierda de la pantalla y, a continuación, seleccione columnas a lo largo de la parte inferior derecha. Agregue columnas height y width para identificar el tamaño de la forma. Nota: Es importante controlar el tamaño de la forma al comparar la cuantificación. Se recomienda utilizar formas idénticas colocadas dentro de la ubicación de cuantificación deseada, con el fin de obtener un muestreo preciso de las emisiones para esa región.</li>
	<li>Luego nombra la forma y repite. Una vez que se muestrean todas las regiones, los datos disponibles en la pestaña columnas se pueden agregar y analizar.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los resultados presentados en este artículo muestran que la inmunocitoquímica del infrarrojo cercano en combinación con la exploración de alta resolución se puede utilizar para obtener medidas semicuantitativas de la expresión de la proteína en el tejido cerebral. También se puede utilizar para etiquetar dos proteínas simultáneamente en la misma región del cerebro. Hemos utilizado previamente inmunohistoquímica de infrarrojo cercano para medir la expresión génica temprana inmediata en múltiples regiones cerebrales<sup cl...

El estudio de la neurociencia se refiere a una investigación de cómo las células en el cerebro median funciones específicas1. Estos pueden ser de naturaleza celular como cómo las células de la glia confieren inmunidad en el sistema nervioso central o pueden implicar experimentos que tienen como objetivo explicar cómo la actividad de las neuronas en el hipocampo dorsal conduce a la navegación espacial. En un sentido amplio, la función celular está determinada por las proteínas que se expresan en una célula y la actividad de estas proteínas2. Como resultado, medir la expresión y/o actividad de las proteínas en las células cerebrales es fundamental para el estudio de la neurociencia.
Hay una serie de técnicas disponibles para medir la expresión de proteínas en el cerebro. Estos incluyen métodos in vivo como la topografía de emisión de positrones para densidades de receptores3 y micro-diálisis para péptidos pequeños4. Más comúnmente, los métodos ex vivo se utilizan para examinar la función y expresión de las proteínas. Estos incluyen las técnicas de espectrometría de masas5, Western Blot y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)6e inmunocitoquímica7. La inmunocitoquímica es ampliamente utilizada en el campo de la neurociencia. Esta técnica implica el uso de un anticuerpo primario para detectar una proteína (o antígeno) de interés (p. ej., c-Fos) y un anticuerpo secundario conjugada para detectar el complejo proteico-primario de anticuerpos (figura 1). Para permitir la detección del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico, los anticuerpo secundarios tienen agentes oxidantes como la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugados con ellos. Esto permite la formación de precipitados en las células que se pueden detectar mediante microscopía ligera7. Los anticuerpos secundarios también pueden tener compuestos químicos fluorescencia conjugados a ellos (es decir, fluoróforos). Cuando se estimulan estos productos químicos emiten luz, que se puede utilizar para detectar proteína-anticuerpo primario-complejos de anticuerpos secundarios7. Por último, a veces los anticuerpos primarios tienen agentes reductores y sustancias químicas de fluorescencia que se unen a ellos negando directamente la necesidad de anticuerpos secundarios7 (figura 1).
Curiosamente, muchos métodos de inmunocitoquímica permiten la visualización de proteínas en las células cerebrales, pero no la capacidad de cuantificar la cantidad de proteína en una región específica de la célula o el cerebro. El uso de microscopía de luz para detectar precipitados de las reacciones de reducción permite la visualización de las neuronas y la glia, pero este método no se puede utilizar para cuantificar la expresión proteica en las células o en una región cerebral específica. En teoría, la microscopía de fluorescencia se puede utilizar para esto, porque la luz emitida por el anticuerpo secundario fluorescente es una medida del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico. Sin embargo, la autofluorescencia en el tejido cerebral puede dificultar el uso de la microscopía de fluorescencia para cuantificar la expresión proteica en el tejido cerebral8. Como resultado, la luz emitida por imágenes fluorescentes de tejido cerebral raramente se utiliza para cuantificar la expresión proteica en el cerebro.
Muchos de estos problemas se pueden abordar utilizando inmunocitoquímica de infrarrojo cercano junto con el escaneo de alta resolución9,10. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica junto con los fluoróforos en los espectros de emisión de infrarrojo cercano se pueden combinar con el escaneo de alta resolución (por ejemplo, 10 – 21 μm) para obtener imágenes nítidas que permiten la semicuantificación de proteínas en distintas regiones cerebrales.

<table><tbody>Cámara <tr><td>de inducción de anestesia</td> para extracción <td></td><td></td> cerebral Kent Scientific VetFlo-0530SM <td></td></tr><tr><td>Guillotina Kleine</td><td>Aparato de Harvard</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>16000-14</td><td>utilizadas para quitar la parte posterior del cráneo Tijeras de</td></tr><tr><td></td> disección delicadas Fischer Scientific 08-951-5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>se utiliza para cortar hacia arriba a lo largo de la línea media del cráneo</td></tr><tr><td>Micro espátula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td><td>se utiliza para extraer el cerebro</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>Reacción</td><td></td><td></td><td></td> inmunohistoquímica</tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Se utiliza como detergente suave para permeabilizar las células después de la fijación en paraformaldehído, también se utiliza como detergente suave en combinación con suero huésped y anticuerpo secundario&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>Se utiliza como una pequeña cantidad de detergente que se agrega a TBS para proteger TBS-T después de cubrir portaobjetos con anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Escáner Licor Odyssey</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estudio de imagen</td><td>: Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

La neurociencia es el estudio de cómo las células en el cerebro median diversas funciones. La medición de la expresión proteica en las neuronas y la glia es fundamental para el estudio de la neurociencia, ya que la función celular está determinada por la composición y la actividad de las proteínas celulares. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica se puede combinar con el escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano para proporcionar una medida semi-cuantitativa de la expresión proteica en regiones cerebrales distintas. Esta técnica se puede utilizar para expresión de proteína simple o doble en la misma región del cerebro. La medición de proteínas de esta manera se puede utilizar para obtener un cambio relativo en la expresión de proteínas con una manipulación experimental, la firma molecular del aprendizaje y la memoria, la actividad en vías moleculares y la actividad neuronal en múltiples regiones cerebrales. Utilizando las proteínas correctas y el análisis estadístico, la conectividad funcional entre las regiones cerebrales también se puede determinar. Dada la facilidad de implementación de la inmunocitoquímica en un laboratorio, el uso de inmunocitoquímica con escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano puede expandir la capacidad del neurocientífico para examinar los procesos neurobiológicos a nivel de sistemas.

Antes de usar la exploración de alta resolución para la inmunohistoquímica, uno debe verificar que el protocolo funciona. Esto se puede lograr usando un ensayo de validación donde las secciones cerebrales del mismo animal son incubadas con anticuerpos primarios y secundarios, anticuerpo secundario solo, o ningún anticuerpo primario ni secundario. Los resultados de este ensayo de validación se muestran en la figura 2. En esta reacción detectamos el gen tempran...

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza colorantes de infrarrojo cercano junto con inmunohistoquímica y escaneo de alta resolución para analizar las proteínas en las regiones cerebrales.

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Este protocolo es significativo porque permite cuantificar dos proteínas en la misma región cerebral. Esto permite al experimentador examinar la actividad en las vías de señalización molecular en las regiones cerebrales mediante el ensayo de pan y fosfoproteínas. También se puede utilizar para ensayar proteínas que son marcadores de diferentes fenómenos cognitivos.Estamos utilizando una técnica relativamente simple, como la inmunohistoquímica, para responder preguntas que normalmente requieren técnicas más involucradas. Incluyendo el examen de la actividad de las vías de señalización molecular, examinar la relación AMPA/NMDA. Usando un criostato mantenido entre menos 9 grados Celsius y menos 12 grados Celsius, corte el cerebro de rata previamente aislado y congelado en regiones de interés a 30-50 micrómetros.Montar directamente las rodajas en los portaobjetos de vidrio y almacenar a menos 80 grados Celsius hasta la inmunocitoquímica. Retire los portaobjetos de vidrio del congelador y dérelos equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Trabajando bajo una campana de humo, coloque los portaobjetos en 4%paraformaldehído en 0.1 MOLar PBS durante una a dos horas a temperatura ambiente para la fijación del tejido.A continuación, enjuague los portaobjetos en 0,1 TBS molar tres veces durante 10 minutos cada uno. Para permeabilizar las membranas celulares, incubar los portaobjetos en un detergente suave durante 30-60 minutos. Y enjuague de nuevo en TBS tres veces durante 15 minutos cada uno.Diluir el anticuerpo primario para proteínas de interés en PBS en la concentración correcta como se describe en el manuscrito. Pipeta solución de anticuerpos primarios directamente sobre el tejido cerebral. Coloque los resbalones de la cubierta en los portaobjetos e incubar el tejido cerebral en la dilución primaria de anticuerpos durante 1-2 horas a temperatura ambiente.Después de la incubación, retire los resbalones de la cubierta y lave los portaobjetos en TBS que tenga una pequeña cantidad de detergente añadido, cuatro veces durante 15 minutos cada uno. Diluir el anticuerpo secundario en un diluyente que contenga TBS, detergente y 1,5% de suero huésped. Añadir anticuerpo secundario a los portaobjetos, cubrir con resbalones de cubierta e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en TBS-T cuatro veces durante 20 minutos cada uno y luego en TBS cuatro veces durante 20 minutos cada uno. Seque los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad, durante la noche. Coloque las diapositivas en la interfaz de escaneo casi infrarrojo con el tejido mirando hacia abajo.Imagine varias diapositivas a la vez con la herramienta de selección. I imagen de las diapositivas utilizando el ajuste de la más alta calidad con una resolución de 21 micrómetros. En un desplazamiento de cero nanómetros, importe imágenes en un software de análisis de imágenes para ver y marcar el análisis de proteínas semicuaritativas.Después de abrir el software de análisis de imágenes, seleccione el área de trabajo en la que se escaneó la imagen. A continuación, abra la imagen escaneada en el software de análisis de imágenes para ver el escaneo y ajustar las longitudes de onda, el contraste, el brillo y la ampliación que se muestran sin alterar la imagen en bruto ni la emisión cuantificada total. Después de identificar las regiones clave para la cuantificación, seleccione la pestaña de análisis a lo largo de la parte superior de la página y, a continuación, seleccione dibujar rectángulo para dibujar un rectángulo sobre el área que se cuantificará.Para ver el tamaño del rectángulo, seleccione formas a lo largo de la parte inferior izquierda de la pantalla. A continuación, seleccione columnas a lo largo de la parte inferior derecha. A continuación, agregue columnas de alto y ancho para identificar el tamaño de la forma.Por último, asigne un nombre a la forma y repita. Una vez muestreadas todas las regiones, continúe con la combinación y el análisis de los datos disponibles en la pestaña de columnas. Para verificar que este protocolo funciona, las secciones cerebrales se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios, anticuerpos secundarios solos o ni anticuerpos primarios ni secundarios.La expresión inmediata temprana del gen c-jun se detectó en el hipocampo dorsal y la amígdala sólo cuando se aplicaron anticuerpos primarios y secundarios al tejido cerebral. La subunidad GluR1 del receptor AMPA y la subunidad NR2A del receptor NMDA se formaron en la detección de proteínas de heces en núcleos de amígdala. Esto permitió examinar la relación de receptores NMDA AMPA en subnúclees de la amígdala que es una firma neurobiológica de aprendizaje y memoria.Las medidas medias y normalizadas de la expresión proteica se obtuvieron a partir de exploraciones de alta resolución en el hipocampo ventral. Usando el software de análisis de imágenes, se coloca un rectángulo en la región de interés y la intensidad media de la luz de la forma se utilizó como una medida de la expresión de fluoróforo, que es una medida de la expresión de proteínas. Para obtener la curva normalizada, se colocó una forma a través de una región que expresa señal alta y señal baja en el área debajo de la curva se utilizó como medida de expresión de proteínas.La mayor dificultad con este procedimiento es encontrar un anticuerpo y asegurarse de que funciona. La aplicación es simple. Mi consejo sería primero intentar un procedimiento inmunohistoquímico regular, luego probar esta técnica.Siempre realizando primero un ensayo de validación. Lo más importante a recordar es comprobar la dilución de los anticuerpos y asegurarse de que se aplica correctamente. Sin estos pasos, se producirá un error en el procedimiento.

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Aquí se describe un método rápido y sencillo a las células de la imagen marcados con fluorescencia en rodajas de cerebro semi-espesa. Mediante la fijación, corte, limpieza y ópticamente el tejido cerebral se describe la forma de imagen estándar de epifluorescencia y confocal se puede utilizar para visualizar las células individuales y las redes neuronales en el tejido nervioso intacto.

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

Este video muestra la tinción de inmunofluorescencia de un corte de cerebro de ratón para cuantificar la distribución de una proteína presináptica específica. El proceso consiste en el bloqueo de sitios inespecíficos, la aplicación de anticuerpos primarios para la proteína diana y un marcador de referencia, seguido de un marcaje de anticuerpos secundarios y una contratinción nuclear. El marcador de referencia garantiza una cuantificación precisa al proporcionar una línea de base consistente, y...

Cuantificación de la distribución de una proteína presináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteínas en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2019) Este video demuestra un método de escaneo de alta resolución y fluorescencia de infrarrojo cercano para medir la expresión de proteínas en el cerebro de los roedores.

Medición de la expresión de proteínas en el cerebro de roedores mediante fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución 

Fuente: Lacin, E., et al. Construcción de reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células (CNiFER) para la detección óptica de neurotransmisores in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra una técnica para obtener imágenes de la liberación de neurotransmisores in vivo utilizando reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células (CNiFER), células reporteras especializadas preinyectadas en la corteza del ratón. Colocado bajo un...

Obtención de imágenes de liberación de neurotransmisores mediante reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células

El objetivo de este protocolo es utilizar la técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar tipos específicos de células neuronales para su posterior análisis de la expresión génica específica del tipo de célula, marcadores epigenéticos y/o expresión de proteínas.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

La síntesis de proteínas es un proceso biológico crítico para las células. En el cerebro, es necesario para los cambios adaptativos. La medición de las tasas de síntesis de proteínas en el cerebro intacto requiere consideraciones metodológicas cuidadosas. Aquí presentamos el método autoradiográfico cuantitativo L-[1-14C]-leucina para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in vivo.

Método autoradiográfico cuantitativo para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in Vivo

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Aprende a cuantificar proteínas en regiones cerebrales de roedores mediante inmunohistoquímica con fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución. Este método permite analizar vías de señalización molecular y marcadores cognitivos de forma eficiente.

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores (Video) | JoVE Journal

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

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