Luminescence Lifetime Imaging of O₂ con un sistema de cámara basado en dominio de frecuencia

Describimos el uso de una novedosa cámara de duración de luminiscencia de dominio de frecuencia para mapear distribuciones 2D O₂ con láminas de sensor óptico. El sistema de cámaras y los procedimientos de análisis de imágenes se describen junto con la preparación, calibración y aplicación de láminas de sensores para visualizar el microambiente O₂ en la rizoesfera de plantas acuáticas.

Como el mejor aceptador de electrones, el oxígeno juega un papel crucial en los sistemas biológicos. Con este protocolo, puede crear imágenes de la distribución de oxígeno en 2D utilizando un optode. Además de su alta resolución espacial y temporal, este método no requiere un tinte de referencia adicional, es extremadamente robusto y permite la adquisición de imagen estructural.

Este método se puede aplicar a varias áreas de investigación en las que el oxígeno juega un papel clave, incluyendo la ecología, la investigación médica, la bioimpresión y la impresión sensible a la presión. La fabricación de optode puede ser difícil, ya que la cantidad de cóctel añadido a la lámina de soporte y la velocidad de arrastre del dispositivo de recubrimiento de cuchillo puede requerir optimización y práctica. Con esta aportación de vídeo, queremos que esta poderosa técnica sea accesible a investigadores de otros campos de estudio.

Para preparar un optode de oxígeno plano, primero utilice una película de agua o 70%etanol para fijar una lámina PET limpia y libre de polvo en una placa de vidrio limpia. Coloque un dispositivo limpio de recubrimiento de cuchillo de 120 micrómetros en la lámina y utilice una pipeta de vidrio para aplicar una línea de cóctel sensor delante del dispositivo. A continuación, arrastre el dispositivo de recubrimiento del cuchillo lenta y uniformemente sobre la lámina PET para esparcir el cóctel uniformemente.

A continuación, seque el optode plano sensible al oxígeno terminado en el aire ambiente durante una hora antes de secarse durante la noche en un armario calentado a 50 a 60 grados centígrados. A la mañana siguiente, se habrá obtenido una capa de aproximadamente 12 micrómetros de espesor. Almacene el optode protegido de la luz hasta su uso posterior.

Para preparar una cámara de rizo-sándwich, utilice adhesivo instantáneo a base de acrílico curable ligero para pegar diapositivas de microscopio a lo largo de los bordes de una placa de vidrio dejando un borde largo abierto. Corte el optode plano en la forma y el tamaño requeridos para caber en el espacio entre los portaobjetos del microscopio pegado y coloque el optode en el interior de la placa de vidrio frontal con el lado recubierto hacia arriba. Pegue un borde de la lámina de optode a la placa de vidrio y agregue agua del grifo entre la placa de vidrio y la lámina de optode.

Baje lentamente la lámina sobre las gotas de agua permitiendo que el optode se enderece en la superficie de vidrio y utilice un tejido blando para eliminar cuidadosamente las burbujas de aire atrapadas entre el optode y la placa. A continuación, seque la placa de vidrio y pegue los bordes restantes de la lámina en la placa. A continuación, utilice una placa de vidrio plana para distribuir sedimentos de tamiz de 0,5 milímetros uniformemente a través de la placa al mismo grosor que los espaciadores de diapositivas del microscopio.

Limpie cuidadosamente la superficie superior de la corredera del microscopio para asegurarse de que la segunda placa de vidrio sella la cámara correctamente y aplique grasa de silicona a la superficie del portaobjetos del microscopio. A continuación, cubra el sedimento con una fina película de agua evitando cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Antes de colocar una muestra sobre el sedimento, lave cuidadosamente un solo brote de Litoralella uniflora y coloque el brote en un sedimento con las hojas sobresaliendo desde la parte superior abierta.

Cuando la muestra esté en su lugar, coloque la placa de vidrio con el optode sobre el sedimento y aplique una presión suave para poner el optode en estrecho contacto con las raíces de la planta y el sedimento circundante. Utilice abrazaderas para sujetar las placas y secar los bordes exteriores con papel tisú. Añadir repetidamente unas gotas de agua a las hojas para mantener la planta hidratada durante todo el montaje del rizo-sándwich y utilizar cinta eléctrica de vinilo para apretar la cámara de rizo-sándwich.

A continuación, selle los bordes con arcilla de modelado y cinta eléctrica adicional. Para preparar la toma de imágenes, retire la lámina de recubrimiento de la zona del optode después de la incubación y coloque la cámara de rizo-sándwich con la pared de vidrio con el optode vertical contra la pared del acuario. Utilice un espaciador para presionar la cámara de rizo-sándwich contra la pared.

Coloque la cámara de frecuencia de vida luminiscencia basada en dominio equipada con un objetivo delante del acuario y el área de interés. Conecte un filtro de emisión adecuado para obtener imágenes del tinte indicador al objetivo de la cámara y fije la guía de luz en la fuente de excitación LED. A continuación, coloque la guía de modo que ilumine uniformemente la lámina de optode plana que cubre el área de interés.

En el software de imágenes, seleccione la cámara y seleccione el LED en el software de control LED. Ajuste la intensidad del LED según sea necesario y marque analógico y sincronice para confirmar que el LED es activado por la lógica transistor-transistor externo. Enfoque manualmente la cámara y ajuste la apertura del objetivo y establezca la fuente de modulación interna, la onda sinusoidal para la forma de onda de salida, el muestreo de fase adicional, las muestras de ocho fases, el orden de fase opuesto, la lectura de A B y la frecuencia de modulación de cinco kilohercios.

Ajuste el tiempo de exposición hasta que la lectura de estadísticas de la región de interés para la imagen de intensidad de luminiscencia normalizada esté en el rango de 0,68 a 0,72. A continuación, haga clic en La referencia de captura para iniciar la adquisición de una serie de medición de referencia. Para calibrar el optode, utilice un dispositivo de mezcla de gas para lavar el agua en un acuario de calibración con una mezcla de gas nitrógeno de aire ambiente con una concentración de oxígeno conocida que monitorea la concentración de oxígeno con una sonda externa con un sensor de oxígeno.

A continuación, adquiera una serie de imágenes a diferentes concentraciones de oxígeno en la cámara de calibración para obtener un ajuste adecuado de la curva a los datos de calibración adquiridos. Cuando el sistema haya sido calibrado, apague las luces aplicando irradiación a la planta y a todas las demás fuentes de luz y ajuste el tiempo de adquisición en función de la intensidad de la imagen para asegurarse de que la señal no está sobresaturada ni demasiado débil para una buena relación señal-ruido en la determinación de la vida útil. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes de la vida útil del oxígeno, vuelva a encender las luces para obtener una imagen estructural y obtener una imagen con una regla en el campo de visión para permitir el escalado posterior de las imágenes adquiridas.

Antes de tomar imágenes de la muestra, el optode debe calibrarse. Después de una descomposición cuasi exponencial, la vida útil de la luminiscencia medida disminuye a medida que aumenta la concentración de oxígeno. Esta relación también se puede describir mediante el modelo simplificado de dos sitios.

Una vez calibrado el optode, es posible determinar la concentración de oxígeno mediante imágenes de la vida útil de la luminiscencia como se observa en estas imágenes en las que se probó la distribución de la concentración de oxígeno en la rizosfera de Litoella uniflora después de la exposición a la luz a 500 fotones de micromóculas por metro cuadrado por segundo durante 12 horas y después de 12 horas en la oscuridad. Además de las imágenes de por vida, las imágenes estructurales también se pueden adquirir bajo iluminación externa, manteniendo la geometría de imagen fija para permitir que las imágenes de oxígeno se correlacionen con precisión con la imagen estructural. Los perfiles de concentración de oxígeno a través de una sola raíz, por ejemplo, se pueden extraer de las imágenes adquiridas en la oscuridad y la luz.

Es fundamental tener un buen contacto entre la matriz de muestra y la optoda para evitar artefactos innecesarios. Si tienes dudas, rehace el sándwich. La adquisición instantánea de una imagen de una manera no destructiva permite la supervisión del entorno de oxígeno.

El método también podría combinarse con otros optodes para el pH u otros analitos. Asegúrese de realizar la fabricación de optode en una campana de humos, ya que el cóctel del sensor contiene cloroformo. Las optodas planas se pueden utilizar para identificar comunidades microbianas en el sedimento.

Y después de la toma de imágenes, el sándwich se puede abrir para tomar muestras de estos puntos calientes para el análisis de la comunidad microbiana.