Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Este flujo de trabajo proteómico permite la identificación imparcial y el mapeo de interacciones proteína-proteína endógenas con resolución subcelular. Esta técnica es particularmente ventajosa al investigar proteínas de cebo que son sensibles a la dosis, baja abundancia, o tienen múltiples localizaciones subcelulares. Este método podría aplicarse a la asignación de interacciones de proteínas endógenas suponiendo que hay un reactivo de afinidad adecuado disponible.

Esto es particularmente importante para muchas de las miles de proteínas que tienen una función desconocida, muchas de las cuales se han relacionado con enfermedades humanas. Este método se puede adaptar a cualquier línea celular o tejido susceptible a fraccionamiento subcelular. Cualquier proteína con un reactivo de afinidad adecuado podría ser dirigida.

Un resultado común para los experimentos de purificación de afinidad a menudo no es ningún resultado. Realmente buenos reactivos, la recopilación de datos de control de calidad en todo el lugar, y la limitación del manejo de muestras son realmente importantes. Sepa que tiene una muestra.

Para comenzar, descongelar los gránulos celulares preparados durante 15 minutos en volumen de pellets 1X de tampón frío A con inhibidores de la proteasa o inhibidores de la fosfatasa. Coloque el tubo que contiene el pellet celular en un encientedor a cuatro grados celsius para ayudar en la resuspensión durante 30 minutos. A continuación, coloque el tubo en una centrífuga a 2.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos hasta el pellet.

Decantar el sobrenadante y resuspender las células con 5 veces el volumen de celda empaquetado con buffer A.Incubar sobre hielo durante 20 minutos. A continuación, pelet de nuevo a 2.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Decantar el tampón y resuspend con 2X tampón de volumen celular envasado original A con inhibidores de la proteasa o inhibidores de la fosfatasa.

Dounce unas siete veces con el pestillo suelto A.Centrifuge el lisato durante 10 minutos a 2.000 veces g y cuatro grados Celsius. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo y congele el flash con nitrógeno líquido. Almacene el principio a menos 80 grados centígrados.

Resuspender el pellet con volumen de pellets 0.9X de tampón B con inhibidores de la proteasa o inhibidores de la fosfatasa y mezclar en un nutator durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Para lince los núcleos, dounce 20 veces con el pestillo del título B.Mezclar el lisato nuclear en un nutator durante 30 minutos a cuatro grados celsius para que sea homogéneo. Luego centrifugar el lysate nuclear durante 30 minutos a 21.000 veces g a cuatro grados centígrados.

Pipetear del sobrenadante y ahorrar como extracto de proteína nuclear soluble. Para dializar el extracto nuclear soluble, primero corte una longitud apropiada de tubo de diálisis de 24 milímetros de ancho con un corte de peso molecular de ocho kilodalton. Sujete un lado del tubo y cargue el nucleoplasmo en el tubo.

Después de cargar el lisosato, sujete el otro extremo y sumérgelo en un recipiente de vidrio limpio que contenga tampón C con inhibidores de la proteasa. Dialyze durante tres horas a cuatro grados centígrados. Después de eso, transfiera el nucleoplasma de extracto nuclear dializado a un tubo y centrifugar a 21.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Transfiera tres alícuotas de 20 microlitros del extracto nuclear a nuevos tubos de microcentrífuga para la validación de fraccionamiento por mancha occidental. Usando puntas de pipeta que se hayan cortado en la punta, prepare una mezcla de cuentas A/G de proteína para cada réplica combinando el volumen de 12,5 microlitros de cuentas de Proteína A Sepharose con 12,5 microlitros de Protein G Sepharose en tubos de microcentrífugo. Lave la mezcla de cuentas de proteína A/G dos veces con 300 microlitros de Tampón IP I.Spin las cuentas a 1, 500 veces g a cuatro grados Celsius durante un minuto y decantar el tampón.

A continuación, prepare las cuentas A/G de la proteína de anticuerpos. Para unir el anticuerpo a las perlas, añada al tubo 300 microlitros del búfer IP I y 10 microgramos del anticuerpo deseado. Deje que la mezcla de perlas-anticuerpo se mece sobre un atornillador a cuatro grados Celsius durante la noche.

Ahora aliquot volúmenes apropiados de los lysates nucleares en tubos de microcentrífuga de baja retención para un miligramo de entrada de proteína por réplica. Gire el izado a 16.000 veces g durante 30 minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Añadir un microlitro de Benzonase a 250 unidades por microlitro por cada miligramo de un anate nuclear y mece sobre un nutator a cuatro grados centígrados durante 10 a 15 minutos.

Para preparar perlas para la eliminación previa del ésato, agregue 12,5 microlitros de cada proteína A y las cuentas de proteína G a tubos de baja retención de 1,5 mililitros. Lavar dos veces con tampón de lavado IP I con inhibidores de la proteasa. Decantar el tampón y añadir un miligramo del izado nuclear preparado a las cuentas.

Incubar mientras se balancea en un nutator durante una hora a cuatro grados centígrados. Centrifugar los lysates pre-despejados a 1.500 veces g y cuatro grados Celsius durante un minuto. A continuación, lave las cuentas de proteína de anticuerpos A o G dos veces con el tampón IP I con inhibidores de la proteasa.

Después de centrifugar a 1.500 veces g y cuatro grados Celsius durante un minuto, decantar el buffer. Ahora transfiera el izado nuclear pre-despejado a las cuentas de proteína de anticuerpos A o G. Incubar mientras se balancea en un nutator a cuatro grados centígrados durante cuatro horas.

Después de la incubación, centrifugar a 1.500 veces g y cuatro grados celsius durante un minuto. Transfiera el sobrenadante en tubos etiquetados como el flujo a través de cada réplica. Lave las cuentas de proteína de anticuerpos A o G cuatro veces con un mililitro de Tampón IP II con inhibidores de la proteasa.

A continuación, lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón IP I con inhibidores de la proteasa. Asegúrese de que todo el búfer se elimina después del último lavado. Eluir la proteína de las cuentas mediante la incubación con 20 microlitros de 0,1 molar glicina a pH 2,75 cada uno durante 30 minutos en un nutator.

A continuación, gire a 750 veces g y cuatro grados Celsius durante un minuto y pipetee el sobrenadante. Repita esta incubación con el búfer de elución una segunda vez. Después de preparar el pellet proteico, resuspenderlo con 30 microlitros de tampón de alquilación SDS.

Incubar la muestra en un bloque de calor de 95 grados Celsius durante cinco minutos. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir 300 mililitros de solución UA y 30 microlitros de 100 TCEP milimolar a cada muestra.

Cargue la solución en un filtro centrífugo de 30K. Después de girar el filtro centrífugo a 21.000 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos, mantenga el flujo a través en caso de que haya un problema con el filtro. Después de lavar el filtro según el manuscrito, añadir tres microlitros de un microgramo por microlitro de lyse C resuspendido en 0,1 molar Tris pH 8.5.

Llene los filtros hasta la marca de 100 microlitros con 0,1 molar Tris pH 8.5. Deje que digiere durante una hora a 37 grados Celsius mientras se balancea en un nutator. A continuación, agregue un microlitro de un microgramo por microlitros de grado de MS trippsina.

Mezclar suavemente y dejar que la tripina se incuba con la muestra durante la noche a 37 grados Celsius mientras se balancea en un nutator. Por la mañana, centrifuga varias veces a las 21.000 veces g durante 20 minutos para eluir los péptidos del filtro en un tubo limpio de microcentrífuga de baja retención. Después de desalar los péptidos usando columnas de espín C18, resuspendir los péptidos liofilizados en siete microlitros de 0.1%TFA en 5%acetonitrilo.

Sonicar la muestra durante tres minutos para asegurarse de que los péptidos se han resuspendido, a continuación, girar hacia abajo a 14.000 veces g durante 10 minutos. Cargue de 15 a 30% de la muestra en el sistema de espectrometría de masas de cromatografía líquida para su análisis. En este estudio, las inmunoprecipitaciones triplicadas se analizaron a partir de cinco miligramos de extracto nuclear de HeLa utilizando un control de solo perlas.

El cebo DYRK1A clasificado entre las tres proteínas enriquecidas superiores al control, lo que indica que el experimento IP-MS realizado era fiable. Se mostró una clara separación entre los interactores de alta confianza y más del 95% de las proteínas copuradas que se identificaron como no específicas. Para el conjunto de datos DYRK1A de ejemplo, los socios de interacción IREF presentaron valores FC-A tan bajos como 0,45 que representan un enriquecimiento muy bajo sobre el control.

En consecuencia, muchas de estas interacciones notificadas anteriormente son falsos negativos dentro de este conjunto de datos al caer por debajo del umbral FC-A de tres. El número de copia absoluta calculado de cada interacción IREF no mostró ninguna correlación con los niveles de detección de un socio de interacción por IP-MS. El uso combinado de FC-A mayor que tres y santo mayor que 0.9 redujo la lista de interactores de alta confianza a seis proteínas.

Sin embargo, al aplicar un límite FC-A de más de tres en aislamiento, se agregaron ocho proteínas adicionales a la red. La parte más crucial de este protocolo es la selección de reactivos de anticuerpos para inmunoprecipitación. Se recomienda la validación de selectividad de Western blot o Coomassie antes de completar este flujo de trabajo.

Se pueden tener pruebas de apoyo de interacciones proteína-proteína a partir de la hinchazón occidental de co-IP de los interactores identificados. La reticulación química proteica, aunque más compleja, puede revelar dominios de interacción de los interactores. Usando este método, mi grupo de investigación ha descubierto nuevas funciones para DYRK1A, una proteína quinasa necesaria para el desarrollo cerebral de mamíferos y vinculada con la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer.