Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

El CRAC cinético se puede utilizar para estudiar las asociaciones temporales entre el ARN y las proteínas de unión al ARN en una escala de tiempo corta sin precedentes. Cuando se combina con nuestro reticulante, el CRAC cinético es capaz de reticular células vivas en cuestión de segundos. Esto reduce las respuestas al daño de los rayos UV y facilita el estudio de las respuestas al estrés con una resolución a escala mínima.

Kinetic CRAC es un protocolo muy largo que puede ser un desafío para los nuevos usuarios. Además, trabajar con ARN plantea sus propios desafíos. Para evitar la degradación del ARN, se debe filtrar, esterilizar todas las soluciones y asegurarse de que las pipetas y el banco de laboratorio se mantengan limpios.

La demostración visual de este método es fundamental porque algunos de los pasos no son muy intuitivos. Esto incluye la reticulación UV y la recolección de células, así como la extracción de ARN reticulados del gel. Para realizar la reticulación UV en microorganismos en solución, inocule 3,5 litros del medio deseado con levadura hasta un OD inicial de 600 de 0,05 y cultive el cultivo durante la noche a 30 grados Celsius con agitación continua a 180 rpm.

Una vez que las células alcancen el diámetro exterior deseado, vierta 500 mililitros del cultivo directamente en el reticulante Vari-X-linker e irradie con 250 milijulios de UV de 254 nanómetros. Después de la reticulación, use un dispositivo de filtración al vacío para filtrar las celdas. Enrolle la membrana con las células filtradas y colóquela en un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como T0. Filtre las células restantes en seis filtros diferentes y deje caer las membranas en tres litros de medio inductor de estrés precalentado, mezclándolas vigorosamente con una pipeta durante 50 segundos. Continúe reticulando las celdas en volúmenes de 500 mililitros en los puntos de tiempo deseados y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius.

Para reticular las células adherentes, transfiera la placa de cultivo de cuarzo con las células a la bandeja especializada e irradie con 300 milijulios de 254 nanómetros UV. Coloque inmediatamente el plato sobre hielo. Retire el medio de crecimiento del plato y agregue 10 mililitros de PBS helado. Recoja las células raspándolas y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, pegue las células por centrifugación a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de lavar las celdas con PBS, retire el PBS y congele el pellet de la celda en hielo seco. Almacene la muestra a menos 80 grados centígrados según sea necesario.

Ajuste la centrífuga a cuatro grados centígrados y prepare dos filas de tubos de 1,5 mililitros por muestra para la elución. Gire rápidamente las columnas con las perlas de níquel para deshacerse del volumen vacío. A continuación, coloque las columnas en la primera fila de tubos de elución y llénelas con 200 microlitros de tampón de elución.

Después de dos minutos, gire rápidamente las columnas y transfiéralas a la segunda fila de tubos. A continuación, repita la elución como se ha demostrado anteriormente. Cuando termine, combine todos los eluidos en un tubo de cinco mililitros y agregue dos microlitros de 20 miligramos por mililitro de glucógeno.

A continuación, añada 100 microlitros de ácido tricloroacético a la muestra y póngala en vórtice durante 30 segundos. Después de lavar la muestra con acetona, vuelva a suspenderla en 30 microlitros de tampón de carga de proteínas. A continuación, compruebe la radiactividad con el contador Geiger.

Calentar la muestra durante 10 minutos a 65 grados centígrados y cargarla en un milímetro de gel Bis-Tris prefabricado de cuatro a 12%. Haga funcionar el gel durante 90 minutos a 125 voltios en el tampón MOPS. Cuando termines, envuelve el gel en film transparente y asegúralo al interior de un casete ligero y apretado con cinta adhesiva.

Después de exponer el gel a la película radiográfica automática, revele la película cortando la envoltura adhesiva que cubre el gel, asegurándose de no mover el gel y desplazar la imagen. Coloque la película sobre el gel y extirpe la banda de interés. Coloque la rodaja de gel en un tubo de dos mililitros y tritúrela con una punta de pipeta P1000.

A continuación, añada el tampón de proteinasa K y la proteinasa K. Incubar la muestra a 55 grados centígrados agitando vigorosamente. Ejecute el ADNc en un gel prefabricado al 6% TBE a 100 voltios durante una hora, utilizando una escalera adecuada para la cuantificación de fragmentos cortos de ADN. Cuando termine, coloque el gel en un recipiente hermético con suficiente TBE para cubrirlo y agregue una cantidad adecuada de tinte SYBR Safe.

Tiñe el gel durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, sustituya el tampón que contiene SYBR por un TBE nuevo. Lave el gel durante 10 minutos agitando suavemente.

Drene el TBE y coloque el gel en una carpeta transparente. Corta la carpeta a un tamaño adecuado y crea una imagen del gel con un cuanto de imagen. Extraiga los fragmentos de ADN entre 175 y 400 pares de bases, y coloque la pieza de gel en un tubo de 1,5 mililitros.

Triture el gel con una punta de pipeta P1000 y agregue 400 microlitros de agua. Luego incubarlo durante una hora a 37 grados centígrados mientras se agita. Congele la muestra en hielo seco durante 10 minutos.

Luego repita la incubación a 37 grados centígrados. Inserte dos filtros de microfibra de vidrio dentro de una columna de filtro colocada en un tubo. A continuación, utilice una punta de pipeta P1000 cortada para transferir la suspensión de gel TBE a la unidad de filtro y gírela a 17.000 g durante 30 segundos.

Este protocolo se utilizó para monitorear las interacciones de Nrd1-ARN en células de levadura sometidas a un ambiente privado de glucosa. Las muestras se reticularon antes del cambio a un medio sin glucosa, así como uno, dos, cuatro, ocho, 14 y 20 minutos después. Las autorradiografías del experimento mostraron una señal intensa con el peso molecular esperado de Nrd1, lo que representa la proteína unida a ARN cortos marcados con radio que no son susceptibles de secuenciación.

La señal por encima de esta banda, que es la proteína reticulada a fragmentos de ARN más largos, se aisló. Para modificar el protocolo CRAC cinético para células de mamíferos, se desarrolló una etapa especial para permitir la irradiación UV de placas con células adherentes. La eficiencia de esta configuración se midió a través de la reticulación y la captura de GFP RBM7 etiquetado de manera estable.

El reticulante fue capaz de recuperar complejos de ARN de proteínas de células de mamíferos utilizando irradiación UV de 254 nanómetros con eficiencias comparables a las de un dispositivo de irradiación UV ampliamente utilizado. El desarrollo de una placa de Petri de cuarzo permeable a los rayos UV durante la reticulación mejoró aún más la recuperación de complejos de ARN proteicos. Los datos de Nrd1 muestran que la proteína se une a muchas transcripciones de ARN no codificantes, lo que indica que está involucrada en la degradación de estas transcripciones.

También se demostró la unión a las transcripciones que codifican HXT6 y HXT7, las cuales están reguladas al alza durante la inanición de glucosa. El CRAC cinético permite medir las interacciones dinámicas entre los ARN de proteínas durante el desarrollo celular, las respuestas al estrés y el ensamblaje de complejos macromoleculares, como el ribosoma o el espliceosoma.