Un modelo preclínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusión y neuroinflamación

La hemorragia intraparenquimatosa y la neuroinflamación acompañada de contusión cerebral pueden desencadenar una lesión cerebral secundaria grave. Este protocolo detalla un modelo de impacto cortical controlado (CCI) en ratones, que permite a los investigadores estudiar la hemorragia, la contusión y las respuestas inmunitarias postraumáticas y explorar posibles terapias.

Este modelo se puede utilizar para estudiar las patologías asociadas con la contusión cerebral, incluyendo la hemorragia intracraneal, la toxicidad por hierro, la muerte neuronal, la lesión axonal, el déficit neurológico y la inflamación neuronal. La principal ventaja de esta técnica es que la gravedad del daño cerebral se puede controlar fácilmente mediante la manipulación de los parámetros bioquímicos como la velocidad y la muerte del impacto en el dispositivo CCI. La lesión focal por rotura cortical inducida por CCI es altamente reproducible.

La técnica estereotáctica adecuada y el procedimiento de craneotomía son los principales determinantes en la producción de una lesión cerebral inducida por ICC estable y reproducible. En general, el investigador nuevo en el procedimiento tendrá dificultades para estabilizar el ratón en el marco esterotéxico y realizar la craneotomía adecuada. La Sra. Jhih Shuan Lin, una técnica de laboratorio de mi laboratorio, demostrará el procedimiento.

Comience por confirmar la falta de reflejo de pellizco de los dedos del pie en el animal para asegurarse de que esté correctamente anestesiado. Afeita la cabeza del ratón con una maquinilla eléctrica en dirección de caudal a rostral. Pero no recortes los bigotes.

Coloque el mouse en el marco estereotáxico e inserte con cuidado las barras de la oreja en los canales auditivos, asegurándose de que la cabeza del mouse esté estabilizada por ambas barras de la oreja por igual. Mantenga la anestesia entre uno y 2% de isoflurano durante la cirugía. Aplique vaselina en ambos ojos para evitar que se seque durante la cirugía.

A continuación, utilice bastoncillos de algodón estériles para desinfectar la cabeza afeitada con betadine seguido de etanol al 70%. Administrar 100 microlitros de bupivacaína al 0,25% por vía subcutánea con una aguja de insulina de calibre 31 y masajear suavemente el lugar de la inyección para una mejor absorción. Haz una incisión longitudinal a lo largo de la línea media del cuero cabelludo con un bisturí o unas tijeras.

Luego, use un hemostático para tirar de la piel hacia el lado derecho. Deje que el cráneo expuesto se seque durante un minuto. A continuación, limpie los restos de sangre y tejidos del cráneo con un bastoncillo de algodón estéril.

Comprueba que la cabeza del animal está nivelada en el plano horizontal e identifica los puntos de referencia anatómicos, Bregma y Lambda, marcando ambos lugares con un lápiz. Asegúrese de que la cabeza del animal esté nivelada en la dirección rostral-caudal midiendo las coordenadas Z de Bregma y Lambda. Utilice el mismo procedimiento para colocar la cabeza horizontalmente.

Use una aguja de insulina de calibre 31 para identificar el sitio de la craniectomía. Establezca el origen XY en Bregma y mueva lateralmente la aguja tres milímetros hacia la derecha. Marque esta posición como el sitio de la craniectomía y dibuje un círculo de cuatro milímetros de diámetro en el cráneo con un lápiz.

Corta a lo largo del círculo delineado por el lápiz con un microtaladro de alta velocidad con la trépano para crear un agujero abierto de cuatro milímetros de diámetro. Retire el colgajo de hueso con una pinza y guárdelo en solución salina normal helada. Enjuague suavemente el orificio con solución salina antes de aplicar presión sobre la superficie del cerebro para detener el sangrado.

En el dispositivo CCI, ajuste la punta redondeada del impactador de 2,5 milímetros de diámetro en un ángulo de 22,5 grados. Ponga a cero la punta de impacto en la superficie dural y ajuste los parámetros de impacto en la caja de control a una velocidad de cuatro metros por segundo y una profundidad de deformación de dos milímetros. Retraiga la punta de metal.

Descarga el pistón para generar impactación en el cerebro. Luego, coloque un hisopo de algodón estéril en el área lesionada para detener el sangrado. Reemplace el colgajo de hueso y asegúrelo con cemento dental.

Cierre el cuero cabelludo con adhesivo para tejidos. Coloque el mouse debajo de la lámpara de calor en una jaula de recuperación limpia con ropa de cama hasta la recuperación completa. La técnica estereotáctica adecuada y el procedimiento de craniectomía son determinantes importantes en la producción de una lesión cerebral inducida por ICC estable y reproducible.

Un procedimiento ideal de craniectomía causaría una lesión histológica mínima en el cerebro operado simuladamente. Se observaron cambios en el daño cerebral y la pérdida del cuerpo calloso en los días 1, 3, 7 y 28 después de la ICC. Además, se observó atrofia cerebral unilateral en el lado de la contusión el día 28 post-ICC.

La neuroinflamación fue revelada por la microglía activada Iba1-positiva y la acumulación de macrófagos alrededor del borde del área de contusión. La hemorragia intraparenquimatosa también fue detectable por la tinción positiva para Ly76 desde el primer hasta el séptimo día después de la ICC. Se observó una mezcla de glóbulos rojos con morfología celular rota e intacta en el séptimo día después de la ICC, lo que sugiere que los glóbulos rojos se lisaron en esta etapa.

Este fenómeno fue consistente con la observación de que la deposición de hierro férrico fue detectable en la región de contusión desde los días siete hasta los 28 después de la ICC. Se observaron microglía y macrófagos activados en el cuerpo estriado lejos del sitio de la contusión desde los días tres hasta los 28 después de la ICC, lo que indica lesiones del cuerpo calloso y estriatal. Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren más a fondo la interacción neuroinflamatoria inducida por la hemorragia cerebral a través de la comprensión de la respuesta de las células inmunitarias, como la microglía, después de la contusión de la hemorragia.