Un protocolo para la inmunohistoquímica y la distribución in situ de ARN dentro del embrión temprano de Drosophila

Como organismo con un período gestacional corto, los embriones de Drosophila melanogaster son sujetos de estudio principales para investigar la distribución y localización de proteínas y sus reguladores durante el desarrollo. Sin embargo, debido a sus embriones ricos en lípidos y corion rico en quitina, su utilidad está limitada por la dificultad de montar embriones en superficies de vidrio. En este trabajo, presentamos un método práctico que mejora significativamente la unión del embrión de Drosophila en diapositivas y detallamos nuestros métodos para una histoquímica, inmunohistoquímica e hibridación in situ exitosas.

Antes de los pasos que se muestran aquí, las diapositivas deben lavarse con detergente, luego enjuagarse con agua del grifo y agua destilada antes de colocarse en el horno para que se sequen. Los portaobjetos secos deben remojarse suavemente en dicromato de potasio durante 24 horas antes de enjuagarse y secarse nuevamente, luego colocarse en etanol al 95% durante al menos dos horas. Durante este paso, puede preparar más diapositivas o la gelatina de alumbre cromado de acuerdo con nuestros métodos.

La gelatina se puede almacenar en agua de baño de 60 grados antes de su uso. Para cubrir las diapositivas, deje caer una pequeña cantidad de gelatina en un borde de la diapositiva. Luego use otra diapositiva de vidrio para arrastrar lenta y uniformemente la gelatina a través de la superficie de la diapositiva que se va a recubrir.

Esto crea una capa delgada y uniforme. Antes de ser puesto en una rejilla o aparato de secado para ser almacenado en un horno para permitir un secado completo durante otra noche o 48 horas. Los embriones se recolectan utilizando un plato de agar de jugo de uva, una vez listo, el plato de agar de jugo de uva se puede quitar.

Inunde la placa con PBS y cepille suavemente con un cepillo suave para eliminar los embriones adheridos. Retire el embrión que contiene PBS a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y deje reposar sobre hielo. Una vez que el embrión se asiente en hielo, retire suavemente el PBS sobrenadante.

Tenga cuidado de no molestar al embrión en la parte inferior del tubo. Añadir 1 ml de lejía al 50% a la muestra y agitar suavemente durante dos minutos. Retire la lejía por filtración y lave los embriones en PBS tres veces.

Preparar n-heptano. Una vez listo, lave los embriones del papel de filtro en n-heptano agitando suavemente el papel de filtro en la solución. Permita que los embriones se asienten en la parte inferior de la placa de n-heptano y recoja este n-heptano en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.

Agregue un mililitro de metanol al tubo, permita que la solución precipite y luego aspire el metanol n-heptano. Lave el embrión en PBS de tres a cinco veces para eliminar el metanol residual. Retire este PBS adicional y agregue el fijador de Bouin y deje reposar durante 30 a 60 minutos para fijar los embriones.

Retire el fijador de Bouin y lave los embriones nuevamente en PBS tres veces. Prepare 1.2% de agarosa en PBS y manténgalo caliente en un baño de agua de 60 grados y luego prepare los embriones para incrustarlos aspirando suavemente PBS adicional en el que se ha almacenado. Tenga cuidado de no molestar a los embriones en la parte inferior, y luego aspire el tapón embrionario en la parte inferior de la solución y colóquelo suavemente en un molde de tapa de botella.

Aspire cualquier PBS adicional de este molde antes de agregar gel de agarosa al 1.2%. Prepare una solución de PBS para almacenar estos tapones de agarosa. Una vez que la agarosa se ha solidificado, los enchufes individuales se pueden mover a este PBS para su almacenamiento.

Aquí estamos mostrando el proceso de deshidratación secuencial. Permitiendo 15 minutos para la incubación cada vez. Luego retire del etanol 100% y fije en una solución uno a uno de etanol y xileno durante otros 15 minutos.

Una vez retirado de esta solución uno a uno, retire en xileno puro durante un minuto. Ahora la muestra de tejido está lista para ser movida a una solución de parafina de xileno uno a uno calentada. Deje reposar durante 30 minutos antes de la incrustación final en 100% parafina.

Pasa al primero de 100% parafina y descansa durante dos horas. Repite este proceso en sus dos y tres parafinas. La muestra ahora está lista para ser trasladada a un molde y el molde lleno de cera para completar el proceso de incrustación.

Incrustación de embriones de Drosophila. Coloque las secciones de parafina preparadas de los embriones de Drosophila en un horno de 60 grados durante 15 minutos. Colóquelos en una solución 100% de xileno.

Luego comenzamos la rehidratación. Coloque las diapositivas en cada una de estas soluciones durante tres minutos cada una. Una vez que el portaobjetos esté en agua destilada, colóquelo en la solución de hematoxilina durante dos minutos.

Una vez completado, asegúrese de drenar la mayor cantidad posible de la solución de la diapositiva. Una vez que el portaobjetos se haya lavado en agua destilada, manche el portaobjetos en eosin durante un minuto. Finalmente, retire el portaobjetos de la eosina y lave en agua destilada.

Una vez que este tobogán está limpio, ahora comenzamos nuestro proceso final de deshidratación. Finalmente se coloca en 100% xileno durante cinco minutos. Este proceso se repite en dos nuevas soluciones de 100% xileno y deja caer una pequeña cantidad de goma neutra a lo largo de un borde del portaobjetos.

Tome este deslizamiento de la cubierta y colóquelo suavemente en un borde de la diapositiva. Primero desparafina las diapositivas colocando 100% xileno. Una vez que los portaobjetos se retiran del agua destilada, deben cubrirse con una solución ácida periódica al 1%.

Luego desechamos el exceso de solución y enjuagamos en agua destilada. Colocando la diapositiva directamente en una solución precalentada. Una vez que esto se haya completado, enjuagamos el portaobjetos en agua destilada y luego teñimos la solución con cloruro de oro al 0,2% durante uno o dos minutos.

A continuación, fijamos el tejido con 3% de tio sulfato de sodio durante tres minutos utilizando agua destilada. Y luego contramantención con hematoxilina. Después de la contratinción, la mancha se puede lavar con cualquiera de los tubos de agua destilada como se muestra aquí.

Luego pasamos al proceso de deshidratación. Siga esto colocando las diapositivas directamente en 100% xileno y luego aplique una pequeña cantidad de goma neutra en la esquina de la diapositiva. Cubra suavemente con un resbalón de cubierta.

Comience a preparar las diapositivas como antes desparafinando y xileno. Y luego en etanol de xileno uno a uno. Una vez que los portaobjetos están desparafinados, comenzamos a rehidratar su tejido y finalmente en PBS.

Coloque las diapositivas en peróxido de hidrógeno al 0,3% hecho en metanol durante 10 minutos. Luego, las diapositivas se cubren con 20 ml de solución de recuperación de destino. Las diapositivas se pueden colocar en la caja de tinción.

Coloque la caja de tinción en un vaporizador, asegurándose de que no se escape ninguna solución y que las diapositivas aún estén completamente cubiertas. Tenga en cuenta que la tapa de la caja de manchas no debe cerrarse por completo para que el vapor de agua pueda escapar durante el proceso de vaporización. Y luego enjuague suavemente en PBS-T tres veces.

Deseche el exceso de solución y repita el proceso, esta vez con PBS. A continuación, incubamos las diapositivas en un bloque de peróxido durante cinco a 10 minutos y luego enjuagamos varias veces nuevamente en PBS-T y luego en PBS. Prepare el anticuerpo y caiga directamente sobre el tejido.

Estos tejidos se pueden incubar o a temperatura ambiente durante cuatro horas. El anticuerpo secundario debe incubarse a temperatura ambiente durante 90 minutos, que se tiñe con 5% DAB durante dos a 10 minutos. Después de obtener el color apropiado, enjuague en agua destilada y luego contramante en hematoxilina.

Después de esta tinción de hematoxilina, los portaobjetos pueden deshidratarse secuencialmente. Coloque los toboganes en 100% xileno y deje en remojo durante tres minutos. Luego deje caer pequeñas cantidades de goma neutra en un borde del portaobjetos.

Una vez que se haya colocado una goma de mascar, tome la cubierta del portaobjetos y colóquela suavemente desde un borde de la diapositiva. Agregue un microgramo de ADN de plantilla lineal purificado a un vial de reacción estéril sin RNasa. Luego agregue suficiente agua destilada doble tratada con DEPC estéril sin RNasa para hacer un volumen de muestra total de 13 microlitros.

Luego centrifuga brevemente e incuba durante dos horas a 37 grados centígrados. Para los experimentos de protección de la RNasa, recomendamos incubar durante 15 minutos con dos microlitros de Dnase-1, sin RNasa para eliminar el ADN de la plantilla. Una vez que se complete la etapa de incubación, detenga la reacción agregando dos microlitros de EDTA molar 0.2 a pH de ocho.

Antes de los pasos que se muestran aquí, las diapositivas fueron desparafinadas y rehidratadas, de acuerdo con nuestro protocolo previamente demostrado. Después de la rehidratación, incube los portaobjetos en 0.01 mole por litro de PBS a un pH de 7.4 durante cinco minutos cada uno para eliminar la solución fijadora del tejido. Después de enjuagar en PBS, a continuación, enjuagamos con 100 milimolares por litro de solución de glicina durante cinco minutos dos veces para eliminar los grupos aldehídos libres del tejido.

Después de este paso, enjuague las diapositivas con PBS durante cinco minutos. A continuación, incube en PBS que contenga 0.3% tritón X-100 durante 15 minutos antes de enjuagar y luego incube nuevamente con un microgramo por microlitro de proteinasa K.A continuación, fije las diapositivas con 4% de paraformaldehído y PBS a un pH de 7.2 durante tres minutos. Luego, lave las diapositivas antes de incubar con un tampón de trietanolamina molar de 0.1 pH 8, que contenga anhídrido acético al 0.25%.

Puede optar por inclinar la caja en esta etapa para garantizar una cobertura completa con la solución. La caja se prepara agregando 20% de glicerol o agua DEPC al fondo de una caja de hibridación seca. A continuación, cubra las diapositivas en 20 microlitros de solución de pre hibridación.

ADN de esperma de salmón a una concentración de 100 microgramos por mililitro a cada diapositiva. Y luego incubar a 42 grados centígrados durante cuatro horas. Esto se hace en una caja humidificada preparada previamente para garantizar que la solución no se seque durante este proceso.

En la etapa posterior a la hibridación, es muy importante que la solución de hibridación se enjuague completamente a partir de sus muestras. Esto se puede hacer en enjuagues consecutivos de 15 minutos a 37 grados, utilizando cuatro veces la concentración SSC, dos veces la concentración, una vez la concentración, 0,5 veces la concentración y 0,1 veces la concentración de la solución SSC. Cada uno incubando durante 15 minutos a 37 grados centígrados.

Una vez hecho esto, lave con PBS tres veces durante cinco minutos cada una antes de agregar el tampón de lavado. El tampón de lavado debe enjuagarse durante un minuto antes de los siguientes pasos Asegúrese de que el tampón de lavado esté completamente seco de las diapositivas antes de agregar la siguiente solución. Agregue 100 mililitros de solución de bloqueo a cada diapositiva e incube la diapositiva durante 30 minutos.

Esto se hace mejor en un ambiente libre de luz para garantizar una buena tinción. A continuación, incube los portaobjetos durante 30 minutos nuevamente en 20 ml de solución de anticuerpos. Aplique la solución de anticuerpos directamente sobre los portaobjetos para obtener una cobertura completa de su tejido.

Una vez que se complete la incubación, aplique 100 mililitros de tampón de lavado. Incubar durante 15 minutos en condiciones libres de luz para eliminar los conjugados de anticuerpos no unidos. Retire el tampón de lavado.

A continuación, aplique 20 mililitros de tampón de detección y deje incubar durante aproximadamente cuatro minutos. Después de cuatro minutos, retire el búfer de detección. Seque los portaobjetos para asegurar que no haya solución adicional y agregue 10 mililitros de solución de sustrato de color recién preparada.

Esta reacción comienza en unos pocos minutos, pero se completa después de 16 horas. Así que deje incubar durante ese período de tiempo en una condición libre de luz. Una vez detectados los puntos deseados donde se detectan las bandas, lave la diapositiva con 50 mililitros de tampón TE para detener la reacción.

Y luego complete nuestro proceso de deshidratación y el proceso de montaje previamente mostrados para la goma neutra. Las figuras uno y dos demuestran el método de recubrimiento de gelatina de aluminio cromado para secciones de parafina y el método de incrustación para el perfil de expresión de FKBP12 y DmFKBP12 en embriones de Drosophila en desarrollo. La figura tres muestra la distribución proteica del anticuerpo FKBP12 detectado en las etapas del blastodermo celular sincitial.

A partir de estos resultados histoquímicos, se puede ver que la expresión de FKBP12 está menos polarizada en el blastodermo sincitial, luego comienza a localizarse dentro de la membrana basal debajo del epitelio del trofoectodermo informa el gradiente con más expresión que se encuentra en los polos anterior y posterior. La figura cuatro, que sigue las etapas de relación gaseosa temprana y tardía del embrión de Drosophila, muestra que la proteína FKBP12 se restringe a ciertos componentes arquitectónicos del tejido embrionario primitivo. Con menos distribución extracelular que la observada en estadios gastroembrionarios tempranos y tardíos.

Curiosamente, la distribución dinámica de proteínas descrita anteriormente no se acompaña de los cambios correspondientes en los niveles de RESONANCIA magnética de FKBP12 como se ve en la figura cinco. Indicando que la expresión de proteínas es el resultado de un mecanismo molecular post transcripcional aún desconocido. La señalización de calcio mediada por el receptor de rianodina es una vía fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos de animales vertebrados e invertebrados.

Se sabe que las mutaciones en este gen causan muchas alteraciones fisiológicas que conducen a la enfermedad o la muerte cardíaca temprana. Sin embargo, el papel que desempeña este gen en el desarrollo temprano de Drosophila ha sido difícil de estudiar. Como componente de tránsito del embrión, el embrión rico en lípidos y el corion rico en quitina, dificultan los estudios de expresión proteica y embrionaria en el desarrollo temprano de Drosophila.

El recubrimiento de diapositivas, la incrustación de embriones y las técnicas inmunohistoquímicas descritas en este artículo nos han permitido estudiar en detalle la distribución dinámica de la proteína receptora de rianodina y el ARNm. Compartimos estas técnicas y la esperanza de que permitan a otros estudiar otras proteínas durante las primeras etapas de desarrollo de Drosophila.