Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Este procedimiento para fundir e insertar ventanas de silicona reduce las barreras técnicas para la obtención de imágenes intravitales longitudinales. Nuestro protocolo produce ventanas robustas y fácilmente adaptables que son bien toleradas por los animales. Usando esta técnica, hemos obtenido imágenes de cáncer y células inmunes en el hígado, el páncreas y la glándula mamaria.

Con ajustes mínimos, podría adaptarse a muchas ubicaciones anatómicas y preguntas biológicas. Para aquellos que prueban esta técnica por primera vez, practique la liberación de pequeñas cantidades de pegamento de la jeringa. La aplicación de demasiado pegamento nublará el campo de imágenes y hará que el área quirúrgica sea difícil de trabajar.

Comience a fundir la ventana de silicona depositando una pequeña cantidad del polímero de silicona recién preparado, polidimetilsiloxano, de PDMS, en una superficie lisa y limpia, y ajuste la relación volumen-área para obtener el espesor deseado. Una vez que el PDMS se deposita en la superficie de fundición deseada, presione ligeramente una rejilla de acero inoxidable en la silicona para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido. Para eliminar las burbujas de aire y desgasificar el polímero de silicona, coloque la superficie recubierta en un desecador al vacío durante 45 minutos.

Cuando haya terminado, cure el polímero en un horno a 75 a 80 grados Celsius durante 45 minutos. Puntúe el polímero en los bordes del molde y use fórceps para pelar suavemente las ventanas curadas de la superficie utilizada para la fundición. Coloque el ratón en la posición del decúbito lateral izquierdo.

Prepare al ratón anestesiado para la cirugía aplicando una solución de povidona yodada al 10% volumen por volumen y al etanol al 70% en volumen tres veces consecutivas en el sitio quirúrgico afeitado. Se debe tener cuidado para mantener un campo quirúrgico estéril. A continuación, use tijeras y fórceps estériles para hacer una incisión de 10 milímetros en el flanco derecho a tres milímetros por debajo del arco costal.

Retire una sección de un centímetro cuadrado de la piel y use un segundo par de tijeras y fórceps estériles para eliminar una sección del peritoneo ligeramente más pequeña que la sección de la piel. Deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en una placa de pozo estéril y retírela con una jeringa de calibre 31 para aplicar en la superficie del hígado alrededor de los bordes del área a fotografiar, luego coloque la ventana en el área deseada y manténgala firmemente contra el hígado durante aproximadamente dos minutos hasta que el adhesivo se haya secado. Después de doblar los bordes de la ventana debajo del peritoneo depositar una pequeña cantidad del adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo del peritoneo, empujar hacia abajo el peritoneo con fórceps para asegurarlo a la ventana.

Del mismo modo, selle el peritoneo depositando una pequeña cantidad del adhesivo quirúrgico antes de empujar hacia abajo la piel, luego aplique pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que evitará que la piel vuelva a crecer sobre la ventana. Para insertar la ventana en el páncreas, coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho y haga la incisión en el flanco izquierdo antes de extraer una sección del peritoneo como se demostró anteriormente. Usando hisopos de algodón estéril empapados con solución salina estéril, tiró suavemente del bazo para visualizar el páncreas.

Reposicione el páncreas con los hisopos de algodón humedecidos para hacer que más área de superficie sea visible a través de la incisión. Una vez que se accede al páncreas, inserte y selle la ventana de imágenes en el área deseada como se explicó anteriormente. Para acceder a la glándula mamaria, coloque al ratón en posición supina y haga una incisión medial de 10 milímetros en uno de los pezones inguinales con tijeras y fórceps estériles.

Retire una sección de 0,5 centímetros cuadrados de la piel por encima de la glándula mamaria, luego separe suavemente la glándula mamaria de la piel extendiendo las tijeras estériles entre las dos superficies para interrumpir la adherencia. Use una jeringa de calibre 31 para aplicar una pequeña cantidad del adhesivo quirúrgico en la superficie de la glándula mamaria alrededor de los bordes del área a fotografiar. Coloque y sostenga la ventana firmemente contra la glándula mamaria hasta que el adhesivo se seque.

Después de doblar los bordes de la ventana debajo de la piel, deposite una pequeña cantidad de adhesivo quirúrgico en los bordes de la ventana que ahora están debajo de la piel y empuje hacia abajo la piel con fórceps para asegurar la piel a la ventana. Aplique el pegamento alrededor de los bordes de la ventana para crear un borde que evitará que la piel vuelva a crecer sobre la ventana. Antes de comenzar la sesión de imágenes, limpie la ventana de cualquier residuo limpiándola suavemente con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70%.

Cuando utilice una lente de inmersión en agua, aplique el gel de ultrasonido en la ventana evitando burbujas. Para iniciar la imagen, localice y coloque la cuadrícula en foco a través de los oculares. A continuación, determine la profundidad aproximada de las imágenes de tejido estableciendo la parte inferior de la cuadrícula en cero.

La información ayudará a localizar el plano Z correspondiente en sesiones de imágenes posteriores. Para identificar la misma ubicación en varias sesiones de imágenes, utilice los cuadrados de la cuadrícula como punto de referencia. Durante la sesión de imágenes, anote la orientación de la cuadrícula y la ubicación de cada campo de visión fotografiado dentro de la cuadrícula.

La cuadrícula se puede utilizar para navegar de regreso a áreas de cuadrícula específicas y campos de imágenes en el éxito de las sesiones de imágenes. Después de cada sesión de imágenes, elimine cualquier medio de inmersión residual de la lente y los desechos limpiando suavemente la ventana con un hisopo de algodón sumergido en etanol al 70%. La ventana de silicona permite capturar la infiltración dinámica de células inmunes a lo largo del tiempo.

El análisis representativo ilustra la infiltración de neutrófilos dentro del tejido de la glándula mamaria remodelante en los días dos y cuatro. La ventana de silicona permite visualizar los tumores en múltiples puntos de tiempo durante semanas después de la inserción de la ventana. Las ventanas fundidas con 200 miligramos de PDMS son generalmente mejores para la implantación quirúrgica, ya que exhibieron una dureza significativamente mayor que las ventanas fundidas con 150 miligramos.

Cabe destacar que las ventanas PDMS no eran tan rígidas como el vidrio estándar, representado por el módulo de Young de las ventanas de vidrio que era significativamente mayor que el PDMS. La inserción de la ventana en diferentes órganos fue bien tolerada ya que la mayoría de los ratones continuaron aumentando de peso con el tiempo. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es sellar completamente la ventana con pegamento.

Esto evita la infección, que el tejido se seque y el desplazamiento de la ventana. Después del procedimiento, las inyecciones ortotópicas se pueden realizar a través de la ventana de silicona, lo que permite a los investigadores estudiar una amplia variedad de temas, como la proliferación celular, las interacciones célula-célula y la eficacia terapéutica.