Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Este protocolo permite a los investigadores utilizar de manera competente un detector de quimioluminiscencia para la medición de metabolitos de óxido nítrico sin la guía o el gasto de emplear personal dedicado en el sitio. El ensayo basado en quimioluminiscencia es el método más sensible para detectar cambios mínimos en los niveles de óxido nítrico y sus metabolitos en cualquier muestra biológica dada. El óxido nítrico inhalado es un gas terapéutico utilizado para una amplia variedad de enfermedades.

Es crucial que la progresión y la recuperación de la enfermedad se correlacionen con precisión con los niveles de metabolitos de óxido nítrico. El óxido nítrico inhalado, un antimicrobiano, se muestra prometedor en el tratamiento de pacientes con enfermedades infecciosas de las vías respiratorias. El método de quimioluminiscencia proporciona información sobre la correlación de la dosis de óxido nítrico y sus metabolitos con los cambios microbiológicos y fisiopatológicos.

Para preparar la solución de DETA-NONOato, agregue 10 miligramos de DETA-NONOato a 610 microlitros de hidróxido de sodio 10 milimolar en PBS de pH 7.4 para generar 100 milimolares de DETA-NONOato y mantenerlo en hielo. Para continuar, conecte la línea de oxígeno al detector de quimioluminiscencia y abra el tanque de oxígeno a una presión de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas en el texto. Luego, conecte la línea de filtro dieléctrico de campo intenso al detector de quimioluminiscencia.

En la interfaz del detector de quimioluminiscencia, comience a ejecutar el programa de detección para ensayos de fase líquida, asegurándose de que el suministro de oxígeno sea adecuado y que el detector comience a muestrear, lo que indica la detección por señal en milivoltios, de lo contrario provocará una señal de diagnóstico negativa. Para preparar el recipiente de purga, cierre el recipiente de purga en los tres puertos atornillando completamente la válvula de aguja a la derecha y cerrando las llaves de parada de entrada y salida. Retire la tapa del recipiente de purga.

Agregue una cantidad suficiente del reactivo específico para el ensayo planificado a la cámara de reacción para que la aguja de la jeringa utilizada para inyectar las muestras pueda alcanzar la columna de fluido mientras se verifica la presencia de una línea de base estable y deseada. Para iniciar el flujo de gas de purga, asegúrese de que el tanque de gas inerte esté equipado con un regulador de dos etapas y conecte el tanque de gas inerte con la entrada de gas del recipiente. Luego, abra la salida del recipiente de purga y abra el gas con una presión de salida en el regulador de una a cinco libras por pulgada cuadrada.

Luego, abra la entrada del recipiente de purga y abra lentamente la válvula de aguja del recipiente de purga para permitir la entrada de gas y verificar el burbujeo dentro del recipiente de purga. Para ajustar el flujo de gas, registre la presión de la celda medida por el detector de quimioluminiscencia con la línea de filtro dieléctrico de campo intenso que muestrea el aire ambiente. Vuelva a colocar la tapa en el recipiente de purga y conecte la línea de filtro dieléctrico de campo intenso al recipiente de purga.

Use la válvula de la aguja para alcanzar la misma presión celular al nivel del detector de quimioluminiscencia que se registra en el aire ambiente. Para iniciar el programa de adquisición de señal de quimioluminiscencia, conecte el puerto serie del detector de quimioluminiscencia al puerto serie del equipo en el que se ha instalado el programa de adquisición. A continuación, ejecute el programa de análisis.

Haga clic en Adquirir, luego seleccione la carpeta para guardar el archivo de datos, escriba el nombre del archivo y haga clic en Guardar. Mientras se prepara para la inyección de muestras, ajuste la escala de voltaje en la pantalla para tener control sobre la línea de base objetivo haciendo clic en los botones mínimo y / o máximo, y luego ingresando el valor deseado. Para realizar la inyección de muestra, enjuague la jeringa al menos dos veces o más con agua desionizada y destilada antes de extraer cada muestra, y asegúrese de una eyección de agua sin obstrucciones en una toallita de tarea.

Luego, inserte la jeringa en el tubo de muestra mientras mantiene la jeringa y el tubo a una distancia cercana y tire del émbolo hasta el volumen deseado mientras se asegura de que no queden atrapadas burbujas de aire ni piezas sólidas no homogeneizadas. Limpie la punta de la jeringa con un limpiaparabrisas de tareas e inserte la jeringa en la tapa del colocador en el puerto de inyección. Después de verificar que la punta de la jeringa está dentro de la fase líquida, inyecte la muestra en la cámara de reacción.

Para marcar la inyección en el programa de software, escriba el nombre de la muestra haciendo clic en el cuadro gris debajo de Nombres de muestra, luego haga clic en Marcar inyección mientras verifica que la inyección cause un cambio hacia arriba en la señal o hacia abajo en el consumo de óxido nítrico mediante el ensayo de hemoglobina libre de células. La relación dosis-respuesta entre la hemoglobina libre de células y el consumo de óxido nítrico se midió a través de la quimioluminiscencia después del bypass cardiopulmonar. Se puede suponer que hay una alta concentración de grupos hemo en el estado oxidado que elimina el óxido nítrico.

En pacientes que reciben óxido nítrico durante el bypass cardiopulmonar, en cambio, la mayoría de los grupos hemo se reducen y no consumen óxido nítrico. Las mediciones de la concentración de hemoglobina libre de células indicaron una eliminación lenta del plasma dentro de las 12 horas posteriores al bypass cardiopulmonar. Sin embargo, el consumo de óxido nítrico alcanzó su punto máximo a los 15 minutos y no reflejó la eliminación de la hemoglobina libre de células.

Las curvas de regresión lineal del consumo de óxido nítrico por hemoglobina libre de células exhibieron una prevalencia de hemoglobina oxidada y consumidora de óxido nítrico a los 15 minutos, en comparación con una hemoglobina más reducida al inicio de 4 horas y 12 horas después del bypass cardiopulmonar. Se monitorearon los efectos de la administración de gas de óxido nítrico sobre el consumo de óxido nítrico. Cuando los pacientes fueron tratados con gas óxido nítrico intra y postoperatorio, el aumento observado de hemoglobina libre después del bypass cardiopulmonar no se combinó con ningún aumento en el consumo de óxido nítrico.

Los resultados indicaron que el óxido nítrico administrado exógenamente redujo la mayor parte de la hemoglobina libre y evitó la eliminación de óxido nítrico. El experimento es válido sólo si todas las condiciones siguen siendo las mismas. Si la altura del nivel de líquido supera la columna de reacción, debemos detenernos y realizar una nueva calibración.