Name: Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende a utilizar ensayos de quimioluminiscencia para detectar óxido nítrico y sus metabolitos en muestras biológicas con alta sensibilidad. Este método permite correlacionar niveles de metabolitos con cambios microbiológicos.

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Los protocolos reportados en este manuscrito fueron posibles gracias a las contribuciones acumuladas de becarios anteriores del laboratorio de Investigación de Anestesia en Cuidados Críticos del Dr. Warren Zapol, Departamento de Anestesia del Hospital General de Massachusetts. Reconocemos la contribución de los Dres. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli y Emanuele Rezoagli.

L.B. recibe apoyo salarial de K23 HL128882 / NHLBI NIH como investigador principal por su trabajo en hemólisis y óxido nítrico. LB recibe subvenciones de "Fast Grants for COVID-19 research" en el Mercatus Center de la Universidad George Mason y de iNO Therapeutics LLC. B.Y. cuenta con el apoyo de subvenciones de un NHLBI / #R21HL130956 y DOD / The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. recibió patentes en MGH sobre la generación eléctrica de óxido nítrico.
L.B. y B.Y. han presentado una solicitud de patente para la NO entrega en la enfermedad COVID-19 Número de solicitud PCT: PCT/US2021/036269 presentada el 7 de junio de 2021. RWC recibe apoyo salarial de Unitaid como investigador principal para el desarrollo de tecnología destinada al diagnóstico descentralizado de la tuberculosis en niños ubicados en entornos de bajos recursos.

Debido a la alta sensibilidad, los ensayos basados en quimioluminiscencia para la determinación de NO y compuestos relacionados tienen un alto riesgo de contaminación por NO2. Cada reactivo (especialmente la solución de bloqueo de NO2) y diluyente (incluido ddH2O) utilizado en el experimento debe probarse por su contenido de NO2- para corregir la señal de fondo. El nitrito es extremadamente reactivo con una vida media en sangre total alrededor d...

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - líquido</td></tr><tr><td>Emulsión Antiespumante B Sigma</td><td></td><td>A5757</td><td>250 mL - líquido</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ácido Clorhídrico 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - líquido</td></tr><tr><td>Yodo</td><td>SAFC 207772</td><td></td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de mercurio (II) Reactivo ACS> 99,5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - sólido (disuelto en agua)</td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua Mili-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo 705 RN 50 &mu; Jeringa L</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Jeringa de microlitros</td></tr><tr><td>Modelo 802 N 25 &mu; L Jeringa</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Jeringa de microlitros</td></tr><tr><td>N-etilmaleimida Sigma</td><td></td><td>4260</td><td>25 g - cristalino</td></tr><tr><td>Analizador de óxido nítrico + Bundle Software - Recipiente de purga</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>Detector de quimioluminiscencia</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>de hexacianoferrato de potasio (III) reactivo ACS&ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - polvo</td></tr><tr><td>Reactivo ACS de yoduro de potasio> 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Nitrito de potasio cryst. Para análisis EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td></td><td>105067 250 g - cristalino</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Homogeneizador mecánico</td></tr><tr><td>RV3 Bomba de paletas rotativas de dos etapas</td><td>Bomba de vacío Edwards</td><td>A65201906</td> - <td>Incluido con analizador</td></tr><tr><td>Heparina de sodio - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 unidades USP</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio anhidro Reactivo ACS &ge; 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - pellets</td></tr><tr><td>Nitrato de sodio ACS reactivo &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - polvo</td></tr><tr><td>Nitrito de sodio &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - cristalino</td></tr><tr><td>Sulfanilamida &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Cloruro de vanadio (III)</td><td>Sigma</td><td></td><td>112393 25 g - sólido - Precaución (exotérmico)</td></tr><tr><td>Whatman 1 Papel de Filtro</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

La actividad del óxido nítrico (NO) in vivo es el resultado combinado de sus efectos directos, la acción de sus derivados generados a partir de la autoxidación del NO y los efectos de los compuestos nitrosados. La medición de los metabolitos de NO es esencial para estudiar la actividad del NO tanto a nivel vascular como en otros tejidos, especialmente en los entornos experimentales donde se administra NO exógeno. Los ensayos de quimioluminiscencia a base de ozono permiten mediciones precisas de metabolitos de NO y NO tanto en fluidos (incluidos plasma, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares) como en mezclas de gases (por ejemplo, aliento exhalado). El NO reacciona con el ozono para generar dióxido de nitrógeno en un estado excitado. La consiguiente emisión de luz permite la fotodetección y la generación de una señal eléctrica que refleje el contenido de NO de la muestra. Las alícuotas de la misma muestra se pueden usar para medir metabolitos específicos de NO, como nitrato, nitrito, S-nitrosotioles y complejos hierro-nitrosil. Además, el NO consumido por la hemoglobina libre de células también se cuantifica con el análisis de quimioluminiscencia. Se proporciona una ilustración de todas estas técnicas.

El consumo de NO por el ensayo de Hb libre de células se utilizó en muestras que contenían concentraciones conocidas de oxyHb libre de células (Figura 4). Como un hemo de oxyHb libera estequiométricamente una molécula de NO en el ensayo, se utiliza oxyHb libre de células purificadas para construir la curva de calibración para el ensayo (Figura suplementaria 3).
La relación dosis-respuesta entre la Hb libre de células (medida con un ensayo colorimé...

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Este protocolo permite a los investigadores utilizar de manera competente un detector de quimioluminiscencia para la medición de metabolitos de óxido nítrico sin la guía o el gasto de emplear personal dedicado en el sitio. El ensayo basado en quimioluminiscencia es el método más sensible para detectar cambios mínimos en los niveles de óxido nítrico y sus metabolitos en cualquier muestra biológica dada. El óxido nítrico inhalado es un gas terapéutico utilizado para una amplia variedad de enfermedades.Es crucial que la progresión y la recuperación de la enfermedad se correlacionen con precisión con los niveles de metabolitos de óxido nítrico. El óxido nítrico inhalado, un antimicrobiano, se muestra prometedor en el tratamiento de pacientes con enfermedades infecciosas de las vías respiratorias. El método de quimioluminiscencia proporciona información sobre la correlación de la dosis de óxido nítrico y sus metabolitos con los cambios microbiológicos y fisiopatológicos.Para preparar la solución de DETA-NONOato, agregue 10 miligramos de DETA-NONOato a 610 microlitros de hidróxido de sodio 10 milimolar en PBS de pH 7.4 para generar 100 milimolares de DETA-NONOato y mantenerlo en hielo. P

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Medicine

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Aquí proponemos métodos sencillos para probar y evaluar la presencia de especies reactivas del oxígeno en las células.

Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.

Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

La NADPH oxidasa es la mayor fuente de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los fagocitos. Debido a la naturaleza efímera de ROS, es difícil de medir y controlar los niveles de ROS en los animales vivos. Un procedimiento mínimamente invasivo para la cuantificación de serie de ROS en ratones vivos se describe.

Bioluminiscencia de imágenes de la actividad NADPH oxidasa en diferentes modelos animales

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Este protocolo describe una nueva técnica de imagen intraoperatoria que utiliza un complejo de rutenio como fuente de emisión de luz quimioluminiscente, produciendo así altas relaciones señal-ruido durante la obtención de imágenes in vivo. Las imágenes intraoperatorias son un campo en expansión que podría revolucionar la forma en que se realizan los procedimientos quirúrgicos.

Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico

&lt; clase p = 'jove_content'&gt;El óxido nítrico (NO) es una molécula de señalización importante en la homeostasis vascular. La producción de NO in vivo es demasiado baja para la medición directa. La quimioluminiscencia proporciona información útil sobre el ciclo del NO a través de la medición de sus precursores y productos de oxidación, nitrito y nitrato. Se explica la determinación de nitrito/nitrato en tejidos y fluidos corporales.

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Este manuscrito presenta protocolos para la aplicación de nuevas sondas de óxido nítrico (NOps) codificadas genéticamente para monitorear las fluctuaciones de NO• de una sola célula en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia. La formación de NO• desencadenada por Ca2+ a nivel de células endoteliales individuales se visualizó combinando geNOps con un sensor químico de Ca2+.

Aplicación de la codificados genéticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Probes, los geNOps, para imágenes en tiempo real de NO • Las señales en las células individuales

Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

La captura de los cambios dinámicos en la activación proteica de los glóbulos rojos enucleados plantea desafíos metodológicos, como la preservación de los cambios dinámicos en los estímulos agudos para su posterior evaluación. El protocolo presentado describe las técnicas de preparación y tinción de muestras que permiten la preservación y el análisis de los cambios proteicos relevantes y su posterior detección.

Detección de alteraciones dinámicas en las proteínas de los glóbulos rojos basada en inmunotinción

Este protocolo describe un método para cuantificar la producción de óxido nítrico (NO) en cultivos epiteliales de las vías respiratorias diferenciados en la interfaz aire-líquido (ALI) midiendo nitrito en secreciones apicales mediante un ensayo de quimioluminiscencia basado en triioduros.

Medición de la producción de óxido nítrico en cultivos celulares epiteliales traqueales de ratón diferenciados en la interfaz aire-líquido

Aprende a utilizar ensayos de quimioluminiscencia para detectar óxido nítrico y sus metabolitos en muestras biológicas con alta sensibilidad. Este método permite correlacionar niveles de metabolitos con cambios microbiológicos.

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados (Video) | JoVE Journal

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

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