Name: Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende a utilizar ensayos de quimioluminiscencia para detectar óxido nítrico y sus metabolitos en muestras biológicas con alta sensibilidad. Este método permite correlacionar niveles de metabolitos con cambios microbiológicos.

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Los protocolos reportados en este manuscrito fueron posibles gracias a las contribuciones acumuladas de becarios anteriores del laboratorio de Investigación de Anestesia en Cuidados Críticos del Dr. Warren Zapol, Departamento de Anestesia del Hospital General de Massachusetts. Reconocemos la contribución de los Dres. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli y Emanuele Rezoagli.

L.B. recibe apoyo salarial de K23 HL128882 / NHLBI NIH como investigador principal por su trabajo en hemólisis y óxido nítrico. LB recibe subvenciones de "Fast Grants for COVID-19 research" en el Mercatus Center de la Universidad George Mason y de iNO Therapeutics LLC. B.Y. cuenta con el apoyo de subvenciones de un NHLBI / #R21HL130956 y DOD / The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. recibió patentes en MGH sobre la generación eléctrica de óxido nítrico.
L.B. y B.Y. han presentado una solicitud de patente para la NO entrega en la enfermedad COVID-19 Número de solicitud PCT: PCT/US2021/036269 presentada el 7 de junio de 2021. RWC recibe apoyo salarial de Unitaid como investigador principal para el desarrollo de tecnología destinada al diagnóstico descentralizado de la tuberculosis en niños ubicados en entornos de bajos recursos.

Debido a la alta sensibilidad, los ensayos basados en quimioluminiscencia para la determinación de NO y compuestos relacionados tienen un alto riesgo de contaminación por NO2. Cada reactivo (especialmente la solución de bloqueo de NO2) y diluyente (incluido ddH2O) utilizado en el experimento debe probarse por su contenido de NO2- para corregir la señal de fondo. El nitrito es extremadamente reactivo con una vida media en sangre total alrededor d...

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - líquido</td></tr><tr><td>Emulsión Antiespumante B Sigma</td><td></td><td>A5757</td><td>250 mL - líquido</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ácido Clorhídrico 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - líquido</td></tr><tr><td>Yodo</td><td>SAFC 207772</td><td></td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de mercurio (II) Reactivo ACS> 99,5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - sólido (disuelto en agua)</td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua Mili-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo 705 RN 50 &mu; Jeringa L</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Jeringa de microlitros</td></tr><tr><td>Modelo 802 N 25 &mu; L Jeringa</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Jeringa de microlitros</td></tr><tr><td>N-etilmaleimida Sigma</td><td></td><td>4260</td><td>25 g - cristalino</td></tr><tr><td>Analizador de óxido nítrico + Bundle Software - Recipiente de purga</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>Detector de quimioluminiscencia</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>de hexacianoferrato de potasio (III) reactivo ACS&ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - polvo</td></tr><tr><td>Reactivo ACS de yoduro de potasio> 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Nitrito de potasio cryst. Para análisis EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td></td><td>105067 250 g - cristalino</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Homogeneizador mecánico</td></tr><tr><td>RV3 Bomba de paletas rotativas de dos etapas</td><td>Bomba de vacío Edwards</td><td>A65201906</td> - <td>Incluido con analizador</td></tr><tr><td>Heparina de sodio - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 unidades USP</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio anhidro Reactivo ACS &ge; 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - pellets</td></tr><tr><td>Nitrato de sodio ACS reactivo &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - polvo</td></tr><tr><td>Nitrito de sodio &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - cristalino</td></tr><tr><td>Sulfanilamida &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Cloruro de vanadio (III)</td><td>Sigma</td><td></td><td>112393 25 g - sólido - Precaución (exotérmico)</td></tr><tr><td>Whatman 1 Papel de Filtro</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

La actividad del óxido nítrico (NO) in vivo es el resultado combinado de sus efectos directos, la acción de sus derivados generados a partir de la autoxidación del NO y los efectos de los compuestos nitrosados. La medición de los metabolitos de NO es esencial para estudiar la actividad del NO tanto a nivel vascular como en otros tejidos, especialmente en los entornos experimentales donde se administra NO exógeno. Los ensayos de quimioluminiscencia a base de ozono permiten mediciones precisas de metabolitos de NO y NO tanto en fluidos (incluidos plasma, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares) como en mezclas de gases (por ejemplo, aliento exhalado). El NO reacciona con el ozono para generar dióxido de nitrógeno en un estado excitado. La consiguiente emisión de luz permite la fotodetección y la generación de una señal eléctrica que refleje el contenido de NO de la muestra. Las alícuotas de la misma muestra se pueden usar para medir metabolitos específicos de NO, como nitrato, nitrito, S-nitrosotioles y complejos hierro-nitrosil. Además, el NO consumido por la hemoglobina libre de células también se cuantifica con el análisis de quimioluminiscencia. Se proporciona una ilustración de todas estas técnicas.

El consumo de NO por el ensayo de Hb libre de células se utilizó en muestras que contenían concentraciones conocidas de oxyHb libre de células (Figura 4). Como un hemo de oxyHb libera estequiométricamente una molécula de NO en el ensayo, se utiliza oxyHb libre de células purificadas para construir la curva de calibración para el ensayo (Figura suplementaria 3).
La relación dosis-respuesta entre la Hb libre de células (medida con un ensayo colorimé...

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Este protocolo permite a los investigadores utilizar de manera competente un detector de quimioluminiscencia para la medición de metabolitos de óxido nítrico sin la guía o el gasto de emplear personal dedicado en el sitio. El ensayo basado en quimioluminiscencia es el método más sensible para detectar cambios mínimos en los niveles de óxido nítrico y sus metabolitos en cualquier muestra biológica dada. El óxido nítrico inhalado es un gas terapéutico utilizado para una amplia variedad de enfermedades.Es crucial que la progresión y la recuperación de la enfermedad se correlacionen con precisión con los niveles de metabolitos de óxido nítrico. El óxido nítrico inhalado, un antimicrobiano, se muestra prometedor en el tratamiento de pacientes con enfermedades infecciosas de las vías respiratorias. El método de quimioluminiscencia proporciona información sobre la correlación de la dosis de óxido nítrico y sus metabolitos con los cambios microbiológicos y fisiopatológicos.Para preparar la solución de DETA-NONOato, agregue 10 miligramos de DETA-NONOato a 610 microlitros de hidróxido de sodio 10 milimolar en PBS de pH 7.4 para generar 100 milimolares de DETA-NONOato y mantenerlo en hielo. Para continuar, conecte la línea de oxígeno al detector de quimioluminiscencia y abra el tanque de oxígeno a una presión de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas en el texto. Luego, conecte la línea de filtro dieléctrico de campo intenso al detector de quimioluminiscencia.En la interfaz del detector de quimioluminiscencia, comience a ejecutar el programa de detección para ensayos de fase líquida, asegurándose de que el suministro de oxígeno sea adecuado y que el detector comience a muestrear, lo que indica la detección por señal en milivoltios, de lo contrario provocará una señal de diagnóstico negativa. Para preparar el recipiente de purga, cierre el recipiente de purga en los tres puertos atornillando completamente la válvula de aguja a la derecha y cerrando las llaves de parada de entrada y salida. Retire la tapa del recipiente de purga.Agregue una cantidad suficiente del reactivo específico para el ensayo planificado a la cámara de reacción para que la aguja de la jeringa utilizada para inyectar las muestras pueda alcanzar la columna de fluido mientras se verifica la presencia de una línea de base estable y deseada. Para iniciar el flujo de gas de purga, asegúrese de que el tanque de gas inerte esté equipado con un regulador de dos etapas y conecte el tanque de gas inerte con la entrada de gas del recipiente. Luego, abra la salida del recipiente de purga y abra el gas con una presión de salida en el regulador de una a cinco libras por pulgada cuadrada.Luego, abra la entrada del recipiente de purga y abra lentamente la válvula de aguja del recipiente de purga para permitir la entrada de gas y verificar el burbujeo dentro del recipiente de purga. Para ajustar el flujo de gas, registre la presión de la celda medida por el detector de quimioluminiscencia con la línea de filtro dieléctrico de campo intenso que muestrea el aire ambiente. Vuelva a colocar la tapa en el recipiente de purga y conecte la línea de filtro dieléctrico de campo intenso al recipiente de purga.Use la válvula de la aguja para alcanzar la misma presión celular al nivel del detector de quimioluminiscencia que se registra en el aire ambiente. Para iniciar el programa de adquisición de señal de quimioluminiscencia, conecte el puerto serie del detector de quimioluminiscencia al puerto serie del equipo en el que se ha instalado el programa de adquisición. A continuación, ejecute el programa de análisis.Haga clic en Adquirir, luego seleccione la carpeta para guardar el archivo de datos, escriba el nombre del archivo y haga clic en Guardar. Mientras se prepara para la inyección de muestras, ajuste la escala de voltaje en la pantalla para tener control sobre la línea de base objetivo haciendo clic en los botones mínimo y / o máximo, y luego ingresando el valor deseado. Para realizar la inyección de muestra, enjuague la jeringa al menos dos veces o más con agua desionizada y destilada antes de extraer cada muestra, y asegúrese de una eyección de agua sin obstrucciones en una toallita de tarea.Luego, inserte la jeringa en el tubo de muestra mientras mantiene la jeringa y el tubo a una distancia cercana y tire del émbolo hasta el volumen deseado mientras se asegura de que no queden atrapadas burbujas de aire ni piezas sólidas no homogeneizadas. Limpie la punta de la jeringa con un limpiaparabrisas de tareas e inserte la jeringa en la tapa del colocador en el puerto de inyección. Después de verificar que la punta de la jeringa está dentro de la fase líquida, inyecte la muestra en la cámara de reacción.Para marcar la inyección en el programa de software, escriba el nombre de la muestra haciendo clic en el cuadro gris debajo de Nombres de muestra, luego haga clic en Marcar inyección mientras verifica que la inyección cause un cambio hacia arriba en la señal o hacia abajo en el consumo de óxido nítrico mediante el ensayo de hemoglobina libre de células. La relación dosis-respuesta entre la hemoglobina libre de células y el consumo de óxido nítrico se midió a través de la quimioluminiscencia después del bypass cardiopulmonar. Se puede suponer que hay una alta concentración de grupos hemo en el estado oxidado que elimina el óxido nítrico.En pacientes que reciben óxido nítrico durante el bypass cardiopulmonar, en cambio, la mayoría de los grupos hemo se reducen y no consumen óxido nítrico. Las mediciones de la concentración de hemoglobina libre de células indicaron una eliminación lenta del plasma dentro de las 12 horas posteriores al bypass cardiopulmonar. Sin embargo, el consumo de óxido nítrico alcanzó su punto máximo a los 15 minutos y no reflejó la eliminación de la hemoglobina libre de células.Las curvas de regresión lineal del consumo de óxido nítrico por hemoglobina libre de células exhibieron una prevalencia de hemoglobina oxidada y consumidora de óxido nítrico a los 15 minutos, en comparación con una hemoglobina más reducida al inicio de 4 horas y 12 horas después del bypass cardiopulmonar. Se monitorearon los efectos de la administración de gas de óxido nítrico sobre el consumo de óxido nítrico. Cuando los pacientes fueron tratados con gas óxido nítrico intra y postoperatorio, el aumento observado de hemoglobina libre después del bypass cardiopulmonar no se combinó con ningún aumento en el consumo de óxido nítrico.Los resultados indicaron que el óxido nítrico administrado exógenamente redujo la mayor parte de la hemoglobina libre y evitó la eliminación de óxido nítrico. El experimento es válido sólo si todas las condiciones siguen siendo las mismas. Si la altura del nivel de líquido supera la columna de reacción, debemos detenernos y realizar una nueva calibración.

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Aquí proponemos métodos sencillos para probar y evaluar la presencia de especies reactivas del oxígeno en las células.

Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.

Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

La NADPH oxidasa es la mayor fuente de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los fagocitos. Debido a la naturaleza efímera de ROS, es difícil de medir y controlar los niveles de ROS en los animales vivos. Un procedimiento mínimamente invasivo para la cuantificación de serie de ROS en ratones vivos se describe.

Bioluminiscencia de imágenes de la actividad NADPH oxidasa en diferentes modelos animales

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Este protocolo describe una nueva técnica de imagen intraoperatoria que utiliza un complejo de rutenio como fuente de emisión de luz quimioluminiscente, produciendo así altas relaciones señal-ruido durante la obtención de imágenes in vivo. Las imágenes intraoperatorias son un campo en expansión que podría revolucionar la forma en que se realizan los procedimientos quirúrgicos.

Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico

&lt; clase p = 'jove_content'&gt;El óxido nítrico (NO) es una molécula de señalización importante en la homeostasis vascular. La producción de NO in vivo es demasiado baja para la medición directa. La quimioluminiscencia proporciona información útil sobre el ciclo del NO a través de la medición de sus precursores y productos de oxidación, nitrito y nitrato. Se explica la determinación de nitrito/nitrato en tejidos y fluidos corporales.

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Este manuscrito presenta protocolos para la aplicación de nuevas sondas de óxido nítrico (NOps) codificadas genéticamente para monitorear las fluctuaciones de NO• de una sola célula en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia. La formación de NO• desencadenada por Ca2+ a nivel de células endoteliales individuales se visualizó combinando geNOps con un sensor químico de Ca2+.

Aplicación de la codificados genéticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Probes, los geNOps, para imágenes en tiempo real de NO • Las señales en las células individuales

Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

La captura de los cambios dinámicos en la activación proteica de los glóbulos rojos enucleados plantea desafíos metodológicos, como la preservación de los cambios dinámicos en los estímulos agudos para su posterior evaluación. El protocolo presentado describe las técnicas de preparación y tinción de muestras que permiten la preservación y el análisis de los cambios proteicos relevantes y su posterior detección.

Detección de alteraciones dinámicas en las proteínas de los glóbulos rojos basada en inmunotinción

Este protocolo describe un método para cuantificar la producción de óxido nítrico (NO) en cultivos epiteliales de las vías respiratorias diferenciados en la interfaz aire-líquido (ALI) midiendo nitrito en secreciones apicales mediante un ensayo de quimioluminiscencia basado en triioduros.

Medición de la producción de óxido nítrico en cultivos celulares epiteliales traqueales de ratón diferenciados en la interfaz aire-líquido

Aprende a utilizar ensayos de quimioluminiscencia para detectar óxido nítrico y sus metabolitos en muestras biológicas con alta sensibilidad. Este método permite correlacionar niveles de metabolitos con cambios microbiológicos.

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Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

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