Name: Edición génica de células B primarias de macaco Rhesus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende a editar genes en células B primarias de macaco Rhesus usando CRISPR/Cas9 y rAAV6. Este protocolo eficiente facilita la investigación preclínica de terapias celulares inmunológicas.

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Nos gustaría agradecer a Harry B. Gristick y Pamela Bjorkman por proporcionar el antígeno RC1 y a todos los laboratorios de Nussenzweig y Martin para una discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por la subvención INV-002777 de la Fundación Bill y Melinda Gates (a M.C.N.) y el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud. (R.G. y M.A.M). M.C.N. es un investigador del HHMI.

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<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
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<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
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<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12, 686(2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+neutralizing+macaque+monoclonal+antibody+against+the+HIV-1+V3-Glycan+patch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch.</a> eLife. 9, 61991(2020).</li>
<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
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<li>Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+increases+efficiency+of+genome+editing+at+two+non-coding+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci.</a> PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).</li>
</ol>

No se declaran intereses en conflicto.

Los protocolos presentados aquí proporcionan un método rápido y eficiente para generar altos rendimientos y títulos de rAAV6 como HDRT y métodos novedosos para editar genéticamente de manera eficiente las células B primarias del macaco rhesus in vitro.
El protocolo de producción rAAV6 es comparativamente simple y rápido, permitiendo la producción y prueba de muchas construcciones diferentes simultáneamente sin mano de obra excesiva. Si se desea, rAAV6 se puede purificar aún más utilizando protocolos establecidos como la ultracentrifugación de gradiente de iodixanol34 o la partición acuosa de dos fases35 antes del intercambio y concentración de tampón.
Aunque redujo el rendimiento general, optamos por usar solo medio de cultivo celular reducido en suero para la purificación de rAAV6 en lugar de purificación del pellet celular, ya que la mayoría de rAAV6 se libera en el medio36, y la purificación del pellet celular agrega más costo y mano de obra. El uso del ayudante adenoviral autoinactivador aumentó los rendimientos 30-40 veces en promedio, permitiendo la prueba de construcciones empaquetadas en AAV6 en un solo plato de 15 cm. Aunque nuestro método de purificación es básico, usando este método, obtenemos relativamente poca variación de lote a lote en la eficiencia de edición de genes o la viabilidad celular después de la transducción utilizando varias líneas celulares u otras células primarias (datos no mostrados).
Desarrollamos un protocolo de purificación de células B de macaco rhesus para obtener células B primarias intactas utilizando el agotamiento negativo de poblaciones no deseadas. Aunque no es necesario para la edición de genes de estas células, proporciona una forma de obtener una población relativamente pura de células B de macaco rhesus primario para esta u otras aplicaciones en caso de que otros tipos de células interfieran con los objetivos experimentales. Sin embargo, la pureza tiene el costo de reducir los rendimientos generales de células B. En particular, tanto para los cultivos de células B enriquecidos como para los no enriquecidos, la fracción de células B en las preparaciones iniciales de PBMC o esplenocitos es crucial. Para las PBMC en particular, recomendamos el cribado de diferentes macacos para individuos con un alto porcentaje de células B en sangre periférica para obtener un alto número de células B para experimentos, ya que este valor puede diferir dramáticamente entre individuos27. Las PBMC pueden obtenerse por sangrado regular o leucoféresis42.
El protocolo de edición de genes conduce a una edición genética eficiente, típicamente entre el 60% -80% de knock-out y el 5% -20% de las células B knock-in, aunque hemos logrado hasta un 90% de BCR knock-out y 40% de BCR knock-in B (Figura 5 y Figura 6).
Los principales parámetros para la edición eficiente de las células B de macaco rhesus son la eficiencia de corte del sgRNA, los parámetros de electroporación, el MOI y la calidad de la preparación rAAV6. Las eficiencias de corte de los sgRNAs candidatos deben determinarse empíricamente para permitir una edición y diseño óptimos del HDRT. Los parámetros de electroporación presentados aquí equilibran la eficiencia con la viabilidad para obtener el número total máximo de células B editadas en lugar del porcentaje más alto de células B editadas. Si se requiere un mayor porcentaje de celdas editadas, se recomiendan mayores voltajes (hasta 1.750 V) o longitudes de pulso alteradas (10-30 ms), aunque se puede observar más muerte celular. También observamos eficiencias de edición ligeramente más altas en las células B esplénicas en comparación con las células B de PBMC del mismo individuo (Figura 5); Sin embargo, la razón subyacente de esto es actualmente desconocida.
Encontramos que la adición de DMSO al 1% después de la electroporación aumentó significativamente la eficiencia de edición de genes en ~ 40% en células B de macaco rhesus sin afectar la viabilidad celular (Figura 6A-C), en línea con los informes en otras células43. Sin embargo, se debe evitar el cultivo prolongado en DMSO al 1% y puede afectar la viabilidad celular. DMSO puede omitirse por completo si se desea.
El cultivo de las células en un pequeño volumen después de la electroporación durante varias horas junto con el rAAV6 conduce a mayores eficiencias de edición, probablemente debido a la mejor transducción de HDRT por el rAAV6 y, por lo tanto, la mayor concentración intracelular de HDRT en el momento relevante cuando Cas9 está activo. Encontramos que cultivar las células de esta manera hasta 8 h no afectó la viabilidad celular, pero las eficiencias de edición no aumentaron dramáticamente más allá de 5 h (Figura 6). Si solo se requiere knock-out en lugar de knock-in, este paso puede omitirse.
En conclusión, presentamos protocolos integrales para la edición génica de células B de macaco rhesus in vitro y la producción de rAAV6 HDRT necesaria para el knock-in eficiente de las construcciones deseadas. Estos protocolos permiten la prueba rápida y rentable de muchas construcciones empaquetadas como rAAV6 y permiten la prueba preclínica de la viabilidad y escalabilidad de las terapias de células B en un modelo de primates no humanos más relevante.

Las células B son la base de la inmunidad humoral. Tras la activación por antígeno afín y señales secundarias, las células B ingenuas dan lugar a células B del centro germinal, células B de memoria y células plasmáticas1. Este último es la fuente de los anticuerpos secretados que median las funciones protectoras de la mayoría de las vacunas actualmente disponibles2. Las células plasmáticas se han descrito como fábricas de anticuerpos, ya que secretan grandes cantidades de anticuerpos en el suero, aproximadamente 2 ng / día / célula3, que ascienden a 7-16 g / L de suero, lo que hace que los anticuerpos sean una de las tres proteínas más abundantes en el suero4. Las células B son abundantes en la sangre y, por lo tanto, pueden obtenerse fácilmente e infundirse de nuevo en un individuo.
Estos rasgos han hecho de las células B un objetivo de los esfuerzos de terapia celular para editar genéticamente el receptor de células B (BCR) y expresar anticuerpos ampliamente neutralizantes (bNAbs) contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y otras proteínas 16, 17,18,19,20,21. Tales enfoques han mostrado potencial en numerosos estudios con ratones in vivo 7,8,10,11,16,22. Sin embargo, aún deben superarse varios obstáculos para la traducción clínica 9,15,23, entre ellos la seguridad, la duración y la magnitud de la eficacia terapéutica, así como la escala a animales más grandes, como los primates no humanos (NHP). De hecho, los PNH, y en particular los macacos rhesus, que tienen una larga historia en la investigación de anticuerpos y VIH24,25, son el modelo más adecuado para probar estos parámetros.
Aquí, desarrollamos protocolos que permiten abordar estos problemas. Hasta la fecha, pocos estudios han intentado cultivar células B de macaco rhesus ex vivo, y solo se ha reportado una selección positiva usando CD20 para la purificación de células B de macaco rhesus26,27,28. Hemos establecido un protocolo para el aislamiento de células B de macaco rhesus intactas por el agotamiento negativo de otros tipos de células. Además, se definen las condiciones de cultivo para la edición génica dirigida de las células B del macaco rhesus. Este protocolo describe el uso de ribonucleoproteínas (RNP) CRISPR / Cas9 y virus adenoasociado recombinante serotipo 6 (rAAV6) como plantilla de reparación dirigida por homología (HDRT) para editar genes cultivados de células B de macaco rhesus. Usando este protocolo, se lograron eficiencias de edición de hasta el 40% con inserciones grandes (~ 1.5 kb). También presentamos un método rápido y rentable para producir rAAV6 utilizando un ayudante adenoviral autosilenciante habilitado para tetraciclina29 para permitir la prueba rápida de HDRT en este formato. Combinados, estos protocolos describen un flujo de trabajo eficiente para la edición génica de células B de macaco rhesus (Figura 1), lo que permite la evaluación de terapias de células B en un modelo NHP.
Para comenzar los experimentos, el material del donante puede solicitarse de fuentes comerciales u obtenerse mediante flebotomías o esplenectomías. En este estudio, las flebotomías y las colecciones de sangre se realizaron como se describió anteriormente30 utilizando el anticoagulante EDTA. Para obtener células B esplénicas, primarias de macaco rhesus, se realizaron esplenectomias parciales (25%-50%) o totales, utilizando técnicas reportadas anteriormente31. Los animales fueron ayunados durante la noche antes de la cirugía. Brevemente, durante la cirugía, el abdomen fue recortado y preparado con exfoliantes alternos de clorhexidina y alcohol isopropílico al 70% tres veces. Se realizó una incisión (5-10 cm) en el abdomen para identificar y aislar el bazo. La vasculatura del bazo se ligó con suturas o pinzas vasculares. La incisión se cerró en dos capas con 4-0 suturas de polidioxanona PDS. La esplenectomía se realizó una sola vez para un animal individual. Las suspensiones unicelulares se prepararon a partir de bazos de macaco por maceración a través de filtros celulares. Las células mononucleares de la sangre y las suspensiones de células esplénicas se prepararon mediante centrifugación por gradiente de densidad y se almacenaron en nitrógeno líquido.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL estéril, libre de Dnasa, Rnasa y</td><td>purógeno Stellar Scientific</td><td>T17-125</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 10 mL, poliestireno, estéril, no pirógeno, libre de ADNasa/ARNasa y libre de ADN humano</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>o similar</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 15 cm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Polipropileno de 15 mL tybe cónico</td><td>Falcon 352097</td><td></td><td>o similar</td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 25 mL, poliestireno, estéril, no pirogénica, libre de DNasa/RNasa y sin ADN humano</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>o similar</td></tr><tr><td>250 mL de polipropileno tipo cónico</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Línea celular 293AAV</td><td>Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-mercapto-etanol, 55mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo de tejidos de 48 pocillos placa</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 5 mL, poliestireno, estéril, no pirogénica, libre de DNasa/RNasa y sin ADN humano</td><td>Jeringas Corning</td><td>4487</td><td>o similares</td></tr><tr><td>de 5 mL con punta Luer-Lok BD</td><td></td><td>309646</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Tybe cónico de polipropileno de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 50 mL, poliestireno, estéril, no pirogénica, libre de DNasa/RNasa y sin ADN humano</td><td>Placa de</td> cultivo de tejidos Corning <td>4490</td><td>o similar</td></tr> de <tr><td>6 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Sistema de empaquetado AAV-6 (plásmidos)</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 Materiales de referencia (cápsidas completas)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S Controlador de pipeta</td><td>Marca</td><td>26350</td><td>o similar controlador de pipeta</td></tr><tr><td>Antibiótico/Antimicótico 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD14 antihumana</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>CD16 antihumano AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD16 antihumana</td><td>BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PECy7 antihumana</td><td>Biolegend</td><td>302312</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD3 antihumana</td><td>Thermo Fisher</td><td>APS0309</td> CD3 PE BD Biosciences 552127 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotina CD33 antihumana</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD64 antihumana BioLegend</td><td></td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>biotina CD66 antihumana</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD89 antihumana</td><td>BioLegend</td><td>354112</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD8a antihumana</td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR BV605</td><td>Biolegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>cadena ligera Ig antihumana lambda APC</td><td>Biolegend</td><td>316610</td><td></td></tr><tr><td>antihumano IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>antihumano Cadena ligera Kappa FITC</td><td>Autoclave Fisher Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 de cultivo celular</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>o cualquier otra centrífuga de cubo oscilante refrigerable con insertos para placas de 96 pocillos, tubos de 15, 50 y 250 mL</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Alta Glucosa</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (sin RNasa)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Kit de electroporación (Sistema de transfección de neón 10 y micro; L)</td> <td>Fisher Scientific MPK1096</td><td></td><td>u otros tamaños o kit de transfección de 100 uL MPK 10096</td></tr><tr><td>Sistema de electroporación (Sistema de transfección de neón)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03 *</td><td></td></tr> <tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td> <td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Campana extractora</td><td>Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Glutamina 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro Graduado 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>o similar</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético de placa caliente</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Human BAFF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>Humano BD Fc Bloque</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-10</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-2</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa de polietersulfona hidrófilos, (membrana Supor), estériles - 0,2 y micro; m, 25 mm&nbsp;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferina-Selenio, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITR cebador adelante: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td> cebador ITR personalizado <td></td></tr><tr><td>reverso: CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad de flujo laminar</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Columna de agotamiento magnético (LD)</td><td>grande Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Separador Magentic (separador MidiMACS y multistand)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Perlas de estreptavidina magnéticas (Streptavidin MicroBeads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxiprep</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Botellas de medios 2L con tapón</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>o similar</td></tr><tr><td>MegaCD40L</td><td>Enzo</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Placa de reacción de 384 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Película adhesiva óptica Fisher</td><td>4311971</td><td></td> <td>Scientific</td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5424</td><td>R Eppendorf</td><td></td><td>5404000014 o cualquier otra centrífuga de sobremesa para tubos de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Horno microondas</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Nikon TMS Microscopio de contraste de fase invertida</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>o cualquier otro Microscopio de contraste de fase invertida para cultivo celular</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tampón dúplex sin nucleasas</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr>Medidor de pH <td>Qiagen</td><td>129115</td><td></td>de<td>agua sin nucleasas</td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipetas Kit, P2, P20, P200, P1000 y puntas</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>o similar juego de pipetas y puntas</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 10 %</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, Lineal, MW 25000, Grado de Transfección (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME4001TE</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Filtros de preseparación (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de vidrio Pyrex 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>o similar</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de vidrio Pyrex 250 mL</td><td>Millipore Sigma CLS1000250</td><td></td><td>o similar</td></tr><tr><td>qPCR Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>4485691</td><td>o</td></tr><tr><td>antígeno RC1 similar biotinilado aleatoriamente</td><td>Bjorkman lab, CalTech</td><td>en casa</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Tecnologías</td> de <td>ADN integrado</td> de nucleasa <td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 Baño de agua</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>o cualquier baño de agua configurado a&nbsp; 37 &nbsp; C</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro desechables estériles con membranas de PES</td><td>Thermo&nbsp; Nalgene Científico&nbsp;</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Vector adenoviral autosilenciante habilitado para tetraciclina RepCap6&nbsp;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Solución Azul de Tripano, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua</td><td>Millipore Sigma ZEQ7000TR</td><td></td><td>o similar</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td></td></tr></tbody></table>

edición génica de células b primarias de macaco rhesus

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

Las células B y su progenie son las fuentes de anticuerpos altamente expresados. Sus altas capacidades de expresión de proteínas junto con su abundancia, fácil acceso a través de sangre periférica y facilidad para transferencias adoptivas simples los han convertido en un objetivo atractivo para los enfoques de edición de genes para expresar anticuerpos recombinantes u otras proteínas terapéuticas. La edición de genes de células B primarias de ratón y humano es eficiente, y los modelos de ratón para estudios in vivo han demostrado ser prometedores, pero hasta ahora no se ha demostrado la viabilidad y escalabilidad para modelos animales más grandes. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo para editar las células B primarias del macaco rhesus in vitro para permitir tales estudios. Informamos las condiciones para el cultivo in vitro y la edición génica de células B primarias de macaco rhesus a partir de células mononucleares de sangre periférica o esplenocitos utilizando CRISPR / Cas9. Para lograr la integración específica de casetes grandes (<4,5 kb), se incluyó un protocolo rápido y eficiente para preparar el serotipo 6 del virus adenoasociado recombinante como plantilla de reparación dirigida por homología utilizando un vector auxiliar adenoviral autosilenciador habilitado para tetraciclina. Estos protocolos permiten el estudio de posibles terapias de células B en macacos rhesus.

Presentamos un método para el cultivo y edición génica de células B primarias de macaco rhesus utilizando CRISPR/Cas9 y virus adenoasociados recombinantes serotipo 6 para el estudio de terapias de células B.

Edición génica de células B primarias de macaco Rhesus

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

El método es relativamente simple y permite la edición eficiente de genes de células B de macaco rhesus. El método permite la prueba de células B editadas genéticamente con fines terapéuticos en macacos rhesus. También es adecuado para la investigación preclínica de terapia de células B.El método general puede adaptarse para otros tipos de células. Si el procedimiento se sigue correctamente, uno no debe esperar luchas. Sin embargo, como la eficiencia de corte de ARNg y un lote de buena calidad de plantilla recombinante que proporciona AAV6 son críticos.Para comenzar, precaliente los medios de cultivo de células B en un baño de agua de 37 grados centígrados. Descongele los estimulantes de células B en hielo. Prepare un tubo del tamaño adecuado que contenga un medio de descongelación precalentado.Descongele uno o dos viales de esplenocitos de macaco rhesus primario o PBMC en un baño de agua de 37 grados centígrados. Decantar los esplenocitos en el tubo preparado que contiene un medio de descongelación precalentado. Enjuague los criotubos para recoger todas las células.Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 10 mililitros de medio de descongelación para el lavado. Repita las centrifugaciones tres veces para eliminar el medio de congelación.Después de la última centrifugación, resuspender las células a un estimado de cinco veces 10 a seis células por mililitro en un medio de cultivo de células B. Combine 10 microlitros de suspensión celular con 10 microlitros de azul de tripano al 0,4% y cuente las células en un hemocitómetro. Ajustar la concentración celular a tres veces 10 a seis células por mililitro con medio de cultivo de células B de acuerdo con el recuento de células.Luego, agregue los estimulantes de células B a sus concentraciones finales y mezcle. Transfiera las células a una placa de cultivo celular e incubarlas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Después de asentarse, las células deben formar una monocapa densa y pequeños grupos de células pueden ser ya visibles.Después de aproximadamente dos días, las células deben estar sanas, irregulares y haber formado grupos visiblemente más grandes. Después de activar las células B, prepare los reactivos para la electroporación y la transducción. Precaliente el tampón dúplex libre de nucleasa DMSO, el tampón T y el tampón E o E2 del kit de electroporación a temperatura ambiente.Descongele la plantilla de reparación dirigida por homología rAAV6, o HDRT, y los estimulantes de células B en hielo. Resuspender el ARN de guía única CRISPR Cas9, o sgRNA, a 100 micromolares en tampón dúplex. Reconstituir durante 10 minutos a temperatura ambiente y mezclar mediante vórtice y movimiento.Coloque el sgRNA reconstituido en hielo hasta su uso. Para la electroporación de 10 microlitros, prepare 550 microlitros de medio de cultivo de células B con estimulantes y DMSO al 1%. Agregue 50 microlitros de este medio con o sin antibióticos en una placa de cultivo celular de 48 pocillos.Luego, agregue rAAV6 HDRT al medio en los pozos, hasta el 20% del volumen del pozo. Precaliente el plato preparado y el medio restante en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. A continuación, para la electroporación de 10 microlitros, prepare 1,15 microlitros de ribonucleoproteína, o RNP, mezclando 0,4 microlitros de Cas9 61 micromolares con 0,75 microlitros de ARNg de 100 micromolares en tampón dúplex.Incubar el RNP durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de mezclarlo con las células. Después de la incubación, se pueden combinar múltiples RNP si se va a dirigir simultáneamente más de un locus. A continuación, prepare las células para la electroporación.Deje las celdas a temperatura ambiente para evitar choques de temperatura. Después de la incubación, cosecha las células en un recipiente apropiado. Enjuague el plato con DPBS para recoger el número máximo de células.Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en DPBS aproximadamente dos veces 10 a seis células por mililitro, según el número de células puestas en el cultivo. Combine volúmenes iguales de suspensión celular y azul de tripano al 0,4% y cuente con un hemocitómetro.Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, resuspender las células en tampón T precalentado a 5,55 veces 10 a siete células por mililitro, según el recuento de células. Configure el sistema de transfección encendiendo la máquina y ajustándola a 1, 350 voltios, 15 milisegundos y un pulso. Coloque la estación de pipetas dentro de la campana de flujo laminar.Para cada serie de 10 electroporaciones, prepare un tubo de transfección con tres mililitros de tampón E. Inserte el tubo en la estación de pipetas. Combinar 1,15 microlitros de RNP con nueve microlitros de células por electroporación. Preparar al menos un 20% más para evitar burbujas e incubar a temperatura ambiente durante un minuto antes de la electroporación.Aspirar 10 microlitros de RNP y mezcla celular en la punta de electroporación en una pipeta de electroporación. Inserte la pipeta cargada en la estación de pipetas e inicie la electroporación. Asegúrese de que las puntas estén completamente libres de burbujas de aire para evitar la formación de arcos.Expulse inmediatamente las células electroporadas en el pequeño volumen de medio precalentado preparado, con o sin rAAV6, dentro del pocillo 48. Añadir muestras de control sin transfección a los pocillos de cultivo. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante cuatro a seis horas.Al final de la incubación, agregue 450 microlitros de medio de cultivo de células B precalentado que contenga estimulantes, DMSO y con o sin antibióticos en la placa. Realizar análisis de ADN genómico después de 24 horas. Cuantifique la eficiencia de edición con la reacción en cadena de la polimerasa de gotas digitales, o PCR, utilizando un cebador fuera del brazo de homología y un cebador dentro del inserto.Realice PCR para amplificar el sitio de inserción y secuenciación de Sanger para verificar la edición correcta. Para analizar los niveles de proteína, cultive las células durante 40 a 48 horas después de la electroporación para permitir cambios en la expresión de proteínas y realice un análisis por citometría de flujo. La producción de rAAV6 utilizando un ayudante adenoviral autosilenciante habilitado para tetraciclina resultó en la producción de cuatro veces 10 a 10 GC por mililitro de medio de cultivo celular, superando la producción utilizando una transfección triple sin ayuda de 30 a 40 veces.La purificación opcional resultó en la eliminación de la mayoría de las células T CD3 + y las células mieloides CD14 + y CD16 +, con purezas de 80 a 95% de células CD20 + B que se obtienen de forma rutinaria. La edición genética de las células B primarias del macaco rhesus se muestra aquí. Este estudio mantuvo una alta viabilidad celular, al tiempo que eliminó la expresión de la cadena ligera en células B al 80%.La mayoría de las células B todavía expresaban isotipo IgM. La adición de rAAV6 que codifica el anticuerpo 1485 HDRT dio como resultado la edición de genes y la expresión de la superficie del anticuerpo 1485 en 16 a 21% de las células B, aunque a una intensidad de fluorescencia más baja para las cadenas de anticuerpos que en las células B no editadas. La adición de 1% DMSO e incubaciones concentradas extendidas con el HDRT rAAV6 generalmente aumentaron la eficiencia de edición.Usando este método, generalmente se logró una eficiencia de edición del cinco al 20% y hasta el 40%, dependiendo del macaco rhesus individual y la calidad del lote rAAV6 HDRT. Mientras realiza la electroporación, asegúrese de tener suficiente mezcla para la transfección y que no haya burbujas en la punta. Las células se pueden analizar por cualquier método deseado o se puede realizar una transferencia autóloga al macaco rhesus donante.

gene-editing-of-primary-rhesus-macaque-b-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Demostrar la utilidad de la citometría de flujo multicolor para la caracterización detallada fenotípica y funcional de la total, así como la memoria subconjuntos de células CD4 + y CD8 + T en macacos rhesus, el modelo ideal para estudios de vacunas contra el VIH / SIDA.

Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

Se describe un método para modificar genéticamente las células T humanas primarias con un transgén mediante el no...

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

A continuación, presentamos un protocolo optimizado para enumerar y caracterizar las células T CD8 + macaco rhesus contra el virus del SIDA. Este artículo es útil no sólo para el campo de la inmunología del VIH, sino que también a otras áreas de la investigación biomédica donde se sabe que las respuestas de células T CD8 + para afectar el resultado de la enfermedad.

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica + Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

El objetivo de este protocolo es aislar a primates no humanos CD34 de las células+ de cebada la médula ósea, estas células con vectores lentivirales de modificar genes y para preparar un producto para infusión en el huésped autólogo. La longitud del protocolo total es aproximadamente de 48 h.

Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

Aquí se presenta un protocolo para la edición eficiente de genes mediados por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células de mamíferos mediante electroporación de tubos.

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Delineamos un protocolo de 9 días para la transducción y expansión de células mononucleares de sangre periférica de rhesus macaque que produce células con excelente coexpresión de los genes de interés en número suficiente para estudios de infusión de eficacia celular.

Transducción y expansión de células T primarias en nueve días con mantenimiento del fenotipo de memoria central

Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para la ingeniería genómica basada en CRISPR/Cas9 de células B humanas primarias para el knockout genético (KO) y el knock-in (KI) para estudiar las funciones biológicas de los genes en las células B y el desarrollo de la terapia de células B.

Ingeniería genómica de células B humanas primarias usando CRISPR/Cas9

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Este protocolo describe el procedimiento para la edición del genoma en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón utilizando complejos de ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA ensamblados in vitro y administrados por electroporación.

Disrupción génica de alta eficiencia en macrófagos primarios derivados de la médula ósea mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

Aprende a editar genes en células B primarias de macaco Rhesus usando CRISPR/Cas9 y rAAV6. Este protocolo eficiente facilita la investigación preclínica de terapias celulares inmunológicas.

Edición génica de células B primarias de macaco Rhesus

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