Name: Aislamiento e identificación de células de nicho limbal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprende el aislamiento e identificación de células de nicho limbal humanas mediante secuenciación de célula única. Este protocolo avanza la medicina regenerativa para tratar la deficiencia de células madre limbales.

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Gracias a Wei Wang, Lingjuan Xu y Rong Liu por la orientación en este trabajo, a Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You y Li Guigang por proporcionar parte del material, a Guanyu Su por escribir el manuscrito, a Xiao Zhou, Yihong Xiong y Huatao Xie por corregir el manuscrito, y a Guigang Li por su orientación completa. Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82070936, 81470606, 81570819), el proyecto de investigación científica de salud y planificación familiar de la provincia de Hubei (No. WJ2017M073), Los diez mejores proyectos de investigación médica traslacional del Hospital Tongji (No.2016ZHYX20), Proyecto de capacitación de jóvenes pioneros médicos en la ciudad de Wuhan (No.2015whzqnyxggrc10), Programa de reclutamiento de talentos globales (G2022154028L), Proyecto de la Comisión Nacional de Salud de la provincia de Hubei en 2022 (WJ2021ZH0005) y Fundación de Construcción de Sujetos del Departamento de Finanzas de Hubei en 2022 (42000022815T000000102)

El tejido del limbo de donantes de entre 50 y 60 años se obtuvo del Banco de Ojos de la Cruz Roja del Hospital Tongji (Wuhan, China). El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Tongji y se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki.
1. Aislamiento
<ol><li>Obtenga tejido del limbo a partir de un medio de almacenamiento corneal a mediano plazo y opere en condiciones asépticas en un banco de trabajo ultralimpio.</li>
	<li>Raspe y extraiga el iris y el endotelio alrededor de la córnea con una cuchilla redonda quirúrgica estéril.</li>
	<li>Corte el tejido del limbo en doce trozos del mismo tamaño con una cuchilla quirúrgica con 1 mm a ambos lados de la córnea y la esclerótica.</li>
	<li>Transfiera los tejidos del limbo a una placa de cultivo de 3,5 cm, agregue 1 mL de colagenasa A (2 mg/mL, en medio DF-12), para sumergir todos los tejidos para la digestión.</li>
	<li>Coloque la placa en la incubadora celular a 37 °C, digiera los tejidos limbales durante 18 h. NOTA: Los procedimientos de seguimiento generalmente se realizan al segundo día.</li>
	<li>Prepare una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal (Matrigel) al 5%.<ol><li>Cubrir al 5% la matriz de membrana basal (disuelta en MESCM [Tabla 1]) en el fondo del pozo.</li>
		<li>Prepare puntas de 200 μL y 1 mL, un tubo centrífugo de 15 mL y una placa de 6 pocillos en una bolsa esterilizada.</li>
		<li>Coloque la bolsa esterilizada (incluidas las puntas y el tubo centrífugo) y una nueva placa de 6 pocillos a un ambiente de -20 °C o -80 °C durante 20 min. Descongelar la matriz de la membrana basal en el refrigerador a 4 °C.</li>
		<li>Saque las puntas preenfriadas, el tubo centrífugo y la placa de 6 pocillos del entorno de -20 °C u -80 °C y, a continuación, realice las siguientes operaciones en el banco de trabajo ultralimpio.</li>
		<li>Transfiera 50 μL de matriz de membrana basal al 5% a 1 mL de MESCM con una punta de 200 μL y mézclelos suave y uniformemente.</li>
		<li>Transfiera la matriz de membrana basal al 5% (disuelta en MESCM) a un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos utilizando la punta preenfriada de 1 mL.</li>
		<li>Agite la placa de 6 pocillos suave y horizontalmente, coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en la incubadora celular a 37 °C durante aproximadamente 1 h y luego realice el siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de 18 h de digestión, saque el tejido limbal digerido por la colagenasa A, solo quedarán algunos pequeños grupos visibles y tejidos esclerales no digeridos. NOTA: La microscopía de gran aumento revela un grupo compuesto por muchas células densamente empaquetadas (incluidas las LNC).</li>
	<li>Utilice una punta de pipeta de 200 μL para separar los grupos de los tejidos esclerales no digeridos bajo el microscopio estereoscópico.</li>
	<li>Transfiera los racimos a la placa de cultivo de 3,5 cm y sumérjalos en TE al 0,25%, y luego coloque la placa en la incubadora celular durante 15 minutos.</li>
	<li>Agregue 1 ml de MESCM con suero knockout al 10 % para detener la digestión celular y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender los grupos en células individuales con una punta de pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugue a 200 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado sin perturbar la precipitación celular y luego agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células.</li>
	<li>Pipetear hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces hasta que la precipitación de la célula inferior se suspenda uniformemente en el MESCM utilizando la punta de pipeta de 1 ml y tomar 20 μl de suspensión celular para el recuento de células.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal al 5 % con una punta de pipeta de 1 ml y aumente el volumen de MESCM a 2,5 ml.</li>
	<li>Agite suavemente la placa de 6 pocillos horizontalmente para distribuir uniformemente las células.</li>
	<li>Transfiera las células a la incubadora de cultivo después de haber sido fotografiadas y registradas. Observe y fotografíe las células diariamente y cambie el medio cada 3-4 días.</li>
</ol>2. Identificación de LNC
<ol><li>Tinción por inmunofluorescencia<ol><li>Digiera los LNC del fondo de la placa con 1 ml de TE al 0,25% durante 5 min en la incubadora de células a 37 °C.</li>
		<li>Finalice la digestión añadiendo 1 ml de MESCM (que contiene suero knockout), centrifugue la suspensión celular a 200 x g durante 5 min y aspire el sobrenadante con cuidado.</li>
		<li>Agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células en suspensión. Prepare una suspensión celular de 80 μL (4 × 103 celdas por portaobjetos) para 4 portaobjetos (20 μL/portaobjetos) y utilice el sistema de centrífuga para depositar las células en los portaobjetos del microscopio según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Fije las células (adheridas a los portaobjetos en el paso 3) con paraformaldehído al 4% durante unos 10 minutos y, a continuación, permeabilice las células de los portaobjetos con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 15 minutos.</li>
		<li>Bloquear las células durante 1 h con albúmina sérica bovina (BSA) al 2% antes de incubarlas con anticuerpos primarios (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) en un agitador durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, eliminar los anticuerpos primarios no unidos lavando (5 min/lavado, 3 veces) los portaobjetos con PBST (PBS + 0,1% Tween 20).</li>
		<li>Incubar los anticuerpos secundarios correspondientes (anticuerpo secundario IgG de burro anti-ratón TRITC [1:1000], IgG anti-conejo burro FITC [1:500], burro anti-ratón IgG 488 [1:300], anti-conejo burro IgG 594 [1:400]) durante 1 h con anticuerpos IgG inespecíficos IgG adecuados. Retire el anticuerpo secundario no unido con PBST (5 min/lavado, 3 veces).</li>
		<li>Contratiñir los núcleos con 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol) y sellar los portaobjetos.</li>
		<li>Realice imágenes de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (aumento: 400x; Tiempo de exposición: 50 ms).</li>
	</ol></li>
	<li>Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)<ol><li>Tome el kit de aislamiento de ARN para extraer el ARN total según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Utilice un kit de transcripción de ADNc de alta capacidad para realizar la transcripción inversa de 1-2 μg de ARN total a ADNc.</li>
		<li>Realice la transcripción inversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) y qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 ciclos) en una solución de 20 μL que contenga ADNc (100 ng), mezcla de ensayo de expresión génica TaqMan (1 μL), mezcla maestra de PCR universal (10 μL) y ddH2O (hasta 20 μL).</li>
		<li>Utilizar la técnica de TC comparativa (ΔΔCT)4,9 para examinar la expresión génica relativa.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Caracterización de la LNC
<ol><li>Recuento de células (hemocitómetro)<ol><li>Digiera los LNC desde el fondo de la placa con TE al 0,25% durante 5 min en la incubadora de células a 37 °C.</li>
		<li>Finalice la digestión añadiendo 1 ml de MESCM (que contiene suero knockout), centrifugue la suspensión celular a 200 x g durante 5 min y aspire el sobrenadante con cuidado.</li>
		<li>Agregue 1 ml de MESCM para resuspender las células, luego tome 10 μl de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 0,5 ml. Agregue un volumen igual de solución de tinción de azul de tripano al 0,4%.</li>
		<li>Coloque 10 μL de suspensión celular teñida en el área de recuento del hemocitómetro y cúbrala con un cubreobjetos para contar. NOTA: El número de celdas en las cinco áreas cuadradas centrales se define como "A"; el número de células en 1 ml se calcula como 5A × 104 × 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Examen de marcadores LNC y BMMSC con citometría de flujo15<ol><li>Detectar la expresión de SCF, CD73, CD90 y CD105 en las LNCs y BMMSCs mediante citometría de flujo 15 (2-4 ×10 6 eventos/muestra, se obtuvieron 2.000 células de cada una de las muestras, totalizando 550.000 células que fueron activadas simultáneamente).</li>
		<li>Recoja y tiña las células a 20-30 °C durante 15 min en un tampón de bloqueo (3% de BSA y 0,05% de Tween-20 en PBS) utilizando anticuerpos premarcados (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] y CD105 [1:50]) según las instrucciones del kit.</li>
		<li>Realice análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un citómetro de flujo. En este estudio se utilizaron el software FACS Diva y el software FlowJo. Para cada muestra, registre 10.000 eventos y compuerta y analice células vivas.</li>
	</ol></li>
</ol>

Un protocolo para aislar, cultivar e identificar células de nicho limbal humano

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
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<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene información financiera relevante.

La transparencia de la córnea se mantiene típicamente mediante la disposición y distribución regular de pequeñas fibras (25-30 nm de diámetro) en el estroma corneal, que es crucial para la agudeza visual normal16. Hay 253 millones de personas con discapacidad visual en todo el mundo, de las cuales 36 millonesson ciegas. La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera que la ceguera corneal es uno de los peligros más graves para la vista humana, representando el 5,1% de ...

La incidencia de la deficiencia de células madre epiteliales corneales (CESD, por sus siglas en inglés), también llamada deficiencia de células madre limbales (LSCD, por sus siglas en inglés)1, y la regeneración epitelial corneal (CES, por sus siglas en inglés) son cada vez más urgentes debido a la infección y lesión de la córnea. Si no se trata adecuadamente, el CESD puede provocar ceguera que requiere un trasplante de córnea. Como resultado, la regeneración de CES es cada vez más significativa. Existe un grupo de células de apoyo llamadas células de nicho limbal (LNC, por sus siglas en inglés) que proporcionan un apoyo esencial para la función de CES. Las células madre del estroma limbal fueron aisladas por primera vez por Polisetty et al.2 e identificadas por Xie et al.3 como LNC que se localizan en el epitelio limbal subyacente y el estroma del limbo. Las LNC son la célula madre de soporte clave del borde corneal y, con la función de las MSC derivadas de la médula ósea (BMMSC), podrían inducirse a desarrollarse en células epiteliales corneales y células estromales corneales, etc.3,4,5,6,7. Estudios previos demostraron que las cualidades de las células madre de las LNC son más primitivas que lasBMMSCs 8, que ya se utilizan ampliamente en la clínica. Los LNC pueden incluso convertirse en la próxima opción viable después de MSC, especialmente para el tratamiento de la CESD. Como células de soporte importantes para CES, las LNC también son células madre derivadas de la estructura de "nicho" del limbo. Las LNC pueden desempeñar un papel clave en la desdiferenciación de las células epiteliales corneales maduras (MCEC) a CES9. Sin embargo, los estudios sobre los LNC son todavía relativamente insuficientes y no hay consenso sobre la terminología, el aislamiento, la purificación, la identificación y las características de los LNC. Algunos investigadores han nombrado a las LNC células madre estromales derivadas de biopsias limbales 10, células madre mesenquimales limbales 11, células madre de fibroblastos limbales12 y células estromales mesenquimales limbales13. Dado que las características de crecimiento de los LNC no se han descrito en detalle, y debido a sus prometedoras aplicaciones científicas y clínicas, y pueden ser una de las herramientas clínicas más importantes en el futuro, es necesario resumir el aislamiento, la purificación, la identificación y las características de los LNC.
De acuerdo con un estudio previo14, las LNC están presentes principalmente en el epitelio limbal subyacente y en el estroma del limbo. Este protocolo incluye el tratamiento del tejido del limbo con colagenasa A, la obtención de un grupo formado por LEPC y LNCs, y su digestión en células individuales con tripsina-EDTA (TE) al 0,25%. A continuación, los LNC se cultivaron selectivamente en un medio de células madre embrionarias modificadas (MESCM) para su purificación. El protocolo reportado en este trabajo es simple y tiene una alta eficiencia en la obtención de LNCs humanos en grandes cantidades.
El procedimiento detallado de aislamiento, cultivo e identificación de LNC se grabó en el video para los científicos que están interesados en el estudio de LNC, y se puede repetir convenientemente cuando sea necesario.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindol</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu; g/mL</td></tr><tr><td>de anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1,25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-Ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-Ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90 (HT)</td></tr> <tr><td>Sistema de centrífuga</td><td>StatSpin &nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td><td></td> 12-Colagenasa</tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700-Placa</td> <td>de</td></tr> <tr><td>cultivo</td><td>virya</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) anti-conejo</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td>Tree Citómetro</td> <td>de</td></tr> <tr><td>flujo</td> estelar <td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914 50</td><td>&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>Kit de transcripción de ADNc de alta capacidad</td><td></td><td></td> Microscopio de contraste de fase invertida ThermoFisher 4374966 <td></td></tr><tr><td></td><td> UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina, transferrina, selenito de sodio)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu; g/mL de insulina, 5 &mu; g/mL de transferrina, 5 ng/mL de selenito de sodio</td></tr><tr><td>KnockOut SR Serum Reemplazo para ESCs/iPSCs</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4.00%</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR y beta;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One</td><td></td></tr> <tr><td>Plus-FGF humano recombinante básico</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/mL</td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia humana recominante (Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini RNA Isolation Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla redonda quirúrgica estéril</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>tamaño 10</td></tr><tr><td>TaqMan Mezcla de ensayo de expresión génica</td><td>Applied Biosystems 4448489</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>Azul tripano</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0.40%</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems 4304437</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

aislamiento e identificación de células de nicho limbal

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Aquí presentamos un procedimiento estándar para el aislamiento e identificación de células de nicho limbal (LNCs). Para el aislamiento de las LNC se utilizó tejido del limbo obtenido de un banco de ojos. El tejido se dividió en 12 piezas en condiciones asépticas y se digirió durante 18 h a 37 °C en la incubadora de cultivos celulares utilizando colagenasa A para obtener grupos celulares con LNCs y células progenitoras epiteliales limbales. Los grupos celulares se digierieron durante 15 minutos a 37 °C utilizando tripsina-EDTA al 0,25% para obtener células individuales y luego se cultivaron en medio de células madre embrionarias modificadas (MESCM) en una superficie plástica recubierta con Matrigel al 5%. Las células se hicieron pasar tras una confluencia del 70% y los LNC se identificaron mediante inmunofluorescencia, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y citometría de flujo. Los LNC primarios fueron aislados y pasados más de 12 veces. La actividad de proliferación de los LNC de P4 a P6 fue la más alta. Los LNC expresaron marcadores de células madre más altos que los BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR y PDGFRβ). Además, los resultados mostraron que los LNC P4 expresaron uniformemente VIM, CD90, CD105 y PDGFRβ, pero no Pan-CK, lo que podría usarse como marcador para la identificación de LNC. El análisis de citometría de flujo mostró que aproximadamente el 95%, 97%, 92% y 11% de los LNC expresaron CD73, CD90, CD105 y SCF respectivamente, mientras que en las BMMSC fueron del 68%, 99%, 20% y 3%. El proceso estándar para el aislamiento e identificación de LNC podría proporcionar una base de laboratorio confiable para el uso generalizado de LNC.

Crecimiento de LNC Los LNC se aislaron con éxito de acuerdo con el método de digestión de la colagenasa A (2 mg/mL) del tejido del borde corneoescleral, como se describió anteriormente (Figura 1). De acuerdo con un estudio previamente reportado3, después de la digestión de la colagenasa A, se visualizaron grupos similares a orugas bajo el microscopio (Figura 2). La proporción de células fusiformes aumentó gradualmente ...

Aquí, presentamos un protocolo para aislar e identificar las células del nicho limbal humano.

Aislamiento e identificación de células de nicho limbal

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Nuestros estudios se centran en la reconstrucción del nicho limbal para tratar la deficiencia de células madre limbales y restaurar la visión del paciente. Estamos tratando de responder si las células del nicho limbal son o no las células clave que apoyan la función de las células madre limbales y, de ser así, cómo funcionan. Estudios recientes informaron que el trasplante subconjuntival de células madre mesenquimales de la médula ósea previno la deficiencia de células madre limbales de los ojos quemados por álcali.Una de las tecnologías que se utilizan actualmente para avanzar en nuestra investigación es la secuenciación de células individuales, que puede analizar las actividades clave de la vía de señalización a nivel de una sola célula para la caracterización de células de nicho limbal. Aunque los LNC tienen el potencial de convertirse en una herramienta clínica importante en el futuro, sus características de crecimiento no se han explorado con mucho detalle. Teniendo en cuenta sus prometedoras aplicaciones científicas y clínicas, es necesario resumir el aislamiento, la purificación, la identificación y las características de la LNC.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se presenta una técnica para la fabricación de membranas microbolsas dentro electrohiladas en el que estudiar el comportamiento celular. Específicamente, se describe una combinación de microstereolithography y electrospinning para la producción de PLGA (poli (lactida-co-glicólido)) dispositivos de biomateriales corneales equipados con microfeatures.

Combinación de Microstereolithography y electrospinning para Fabricación de membranas Equipado con nichos para la regeneración de la córnea

En este artículo describimos los principios para diseñar y realizar un experimento de trazado de linaje multicolor utilizando ratones R26R-Confetti. Proporcionamos un protocolo específico para el seguimiento de las células epiteliales de la córnea que puede ser modificado para otros tejidos de interés.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Se presenta un ejemplo de terapia génica adenoviral en las córneas diabéticas humanas cultivadas con órganos para la normalización de la cicatrización tardía de heridas y la expresión marcadamente reducida de marcadores de células madre epiteliales en estas córneas. También se describe la optimización de este proceso en cultivos epiteliales limbales enriquecidos con células madre.

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

La superficie ocular normal expuesta consiste en córnea y conjuntiva. Las células epiteliales, las células caliciformes y las células inmunes están presentes en la conjuntiva. Aquí, se describe una técnica no invasiva de citología de impresión usando un dispositivo de citología de impresión y citometría de flujo para analizar células inmunes en la conjuntiva.

Una forma no invasiva de aislar y células fenotípicas de la conjuntiva

Este Protocolo introduce un método de dos pasos simples para diferenciar células epiteliales limbares córneas de células de vástago pluripotent humana bajo condiciones de cultivo libre de xeno - y alimentador. Los métodos de cultivo celular presentados aquí permiten la producción a gran escala, costo-eficiente de células de calidad clínica aplicables al uso de terapia celular corneal.

Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas

La glándula lagrimal (LG) tiene dos tipos de células que expresan α-actina muscular lisa (αSMA): células mioepiteliales (MECs) y pericytes. Los MECs son de origen ectodérmico, se encuentran en muchos tejidos glandulares, mientras que los pericitos son células musculares lisas vasculares de origen endodérmico. Este protocolo aísla los MECs y los pericitos de los LGS murinos.

El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento y la amplificación de las bacterias conjuntivales anaerobias aeróbicas y facultativas del ratón usando una hisopo ocular única y un paso de enriquecimiento basado en la cultura con la identificación posterior por métodos basados microbiológicos y espectrometría de masas MALDI-TOF.

Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones

Este protocolo describe un método para inducir una lesión precisa y reproducible de la córnea y el álcali limbal en un modelo de ratón. El protocolo es ventajoso, ya que permite una lesión distribuida uniformemente en la córnea y el limbo del ratón altamente curvados.

Inducción de lesiones corneales y alcalinas mediante una técnica de punzón y trefina en un modelo de ratón

Desarrollamos un modelo de rata de inflamación corneal severa a través de legrado de epitelio corneal combinado con suturas corneales. El estudio evaluó los patrones de inflamación de la córnea, la proliferación epitelial y los cambios en las células madre limbales en condiciones inflamatorias.

Establecimiento de un modelo de inflamación corneal severa en ratas basado en legrado del epitelio corneal combinado con suturas corneales

Aquí presentamos un protocolo para obtener suspensiones unicelulares de alta calidad de córneas completas de ratón mediante digestión secuencial con colagénasa A y tripsina. Este método produce células individuales viables con alta integridad de ARN, haciéndolas compatibles con aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN unicelular y el citometradory de flujo.

Un protocolo para la extracción de suspensión de célula única de córneas de ratón

Aprende el aislamiento e identificación de células de nicho limbal humanas mediante secuenciación de célula única. Este protocolo avanza la medicina regenerativa para tratar la deficiencia de células madre limbales.

Aislamiento e identificación de células de nicho limbal

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