Preparación de islotes fetales congelados de primates no humanos para la secuenciación combinada de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, y la metabolómica a granel
8 de noviembre de 2024
Este protocolo describe los procedimientos para aislar núcleos de alta calidad de islotes pancreáticos congelados de primates no humanos para su uso en la secuenciación simultánea de ARN de un solo núcleo y la secuenciación ATAC, preservando la fracción citosólica a granel para análisis metabolómicos de las mismas muestras.
Utilizamos un modelo de primates no humanos altamente traslacional para evaluar cómo la dieta materna y el consumo de medicamentos durante el embarazo influyen en el desarrollo embrionario y la función postnatal de los islotes pancreáticos en la descendencia. Los cambios programados en el desarrollo podrían alterar la susceptibilidad a la enfermedad más adelante en la vida. Un desafío cuando se trabaja con muestras difíciles de adquirir, como las de primates no humanos, es evaluar múltiples preguntas de un mismo individuo de manera eficiente.
Desafortunadamente, la extracción simultánea de información del metaboloma y del genoma puede ser difícil debido a la incompatibilidad de los reactivos de ensayo en la degradación sensible al tiempo de las moléculas que se van a cuantificar. Nuestro protocolo permite la extrapolación de la abundancia de metabolitos, la accesibilidad de la cromatina y la expresión génica diferencial a partir del mismo material de partida. Este enfoque de múltiples capas proporciona información sobre cómo el metabolismo puede alterar el genoma en los islotes pancreáticos.
Descripción general
Este protocolo describe métodos para aislar núcleos de alta calidad de islotes pancreáticos de primates no humanos congelados para realizar simultáneamente secuenciación de ARN y secuenciación ATAC. También conserva la fracción citosólica total para análisis metabolómicos, lo que permite una comprensión integral de las interacciones metabólicas y genómicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Metabolómica
Antecedentes
- Los modelos de primates no humanos son fundamentales para estudiar los mecanismos de las enfermedades humanas.
- La dieta y la medicación materna pueden influir en el desarrollo de los islotes pancreáticos de la descendencia.
- El análisis simultáneo del metaboloma y el genoma es difícil debido a la degradación de las muestras.
- Este estudio aborda la necesidad de realizar análisis eficientes de múltiples capas a partir de muestras limitadas.
Objetivo del estudio
- Evaluar el impacto de los factores maternos en el desarrollo embrionario de los islotes pancreáticos.
- Explorar cómo los cambios metabólicos pueden influir en la expresión genómica.
- Desarrollar un protocolo que permita un análisis integral a partir de la misma muestra.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de núcleos de los islotes pancreáticos.
- Secuenciación simultánea de ARN y de ATAC.
- Conservación de fracciones citosólicas para estudios metabolómicos.
- Análisis multilayer para evaluar la abundancia de metabolitos y la expresión génica.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de núcleos de alta calidad y fracciones citosólicas.
- Información sobre cómo la dieta materna afecta la función de los islotes pancreáticos.
- Se demostró la viabilidad de análisis genómicos y metabolómicos simultáneos.
- Se revelaron posibles vínculos entre el metabolismo y la expresión génica en los islotes.
Conclusiones
- Este protocolo permite un análisis exhaustivo de los islotes pancreáticos.
- Los hallazgos pueden orientar estudios futuros sobre la susceptibilidad a enfermedades.
- Destaca la importancia de las influencias maternas en la salud de la descendencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La integración de RNA-seq de núcleo individual, ATAC-seq y metabolómica masiva a partir de islotes de primates no humanos congelados aborda un cuello de botella crítico en el descubrimiento multi-ómico utilizando muestras raras o valiosas. Este enfoque permite un perfilado molecular integral a partir de material limitado, respaldando la confianza predictiva en la validación temprana de objetivos y la reducción del riesgo mecanicista. El protocolo maximiza el rendimiento de datos por muestra, informando decisiones de cartera ajustadas al riesgo en la investigación de enfermedades metabólicas y del desarrollo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos metabólicos y epigenéticos subyacentes a la identidad celular en sistemas relevantes para enfermedades.
- Apoya la validación funcional de objetivos al vincular la abundancia de metabolitos con la expresión génica y la accesibilidad de la cromatina.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante la integración de datos moleculares multilayer procedentes de la misma fuente biológica.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara fracciones nucleares y citosólicas validadas para protocolos de secuenciación de alto rendimiento y metabolómica.
- Mejora la reproducibilidad y la estandarización del ensayo al minimizar los efectos por lotes en estudios con múltiples cohortes.
- Permite obtener salidas cuantitativas multi-ómicas para la evaluación robusta de compuestos o perturbaciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona lecturas moleculares con biomarcadores metabólicos y epigenéticos relevantes para la enfermedad en modelos traslacionales.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el uso de sistemas de primates no humanos.
- Proporciona información predictiva sobre los mecanismos de programación del desarrollo y de susceptibilidad a enfermedades.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo conecta el descubrimiento inicial, la validación del blanco y la investigación traslacional al permitir el perfilado multi-ómico a partir de muestras de tejido raras.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las interacciones metabólico-epigenéticas en el desarrollo de los islotes.
- Tamizaje: Proporciona preparaciones reproducibles de núcleos y metabolitos para ensayos ómicos escalables.
- Análisis: Ofrece datos cuantitativos de expresión génica, accesibilidad de la cromatina y abundancia de metabolitos para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos moleculares con fenotipos relevantes para enfermedades en modelos de primates no humanos.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo reutilizable para maximizar la extracción de datos a partir de muestras limitadas o archivadas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en investigaciones de etapas iniciales.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras multi-ómicas y minimiza los efectos por lotes.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas de avance/no avance y un uso eficiente del capital en muestras raras.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas sobre enfermedades metabólicas y del desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento de núcleos, secuenciación de un solo núcleo y protocolos de metabolómica.
- Exige acceso a infraestructura de secuenciación de alto rendimiento y espectrometría de masas.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos para controlar los efectos de lote.
- Adaptable a otros tipos de tejidos, aunque puede requerir optimización del protocolo para diferentes matrices de muestra.
- La escasez de muestras y su sensibilidad a la degradación imponen limitaciones prácticas sobre el rendimiento y el tiempo.
