Preparación de Mycobacterium abscessus incrustado en perlas de agar para inocular ratones inmunocompetentes por vía intratraqueal

Estamos desarrollando un modelo de ratón de infección pulmonar crónica por abscesos de micobacterias para probar la eficacia de los antibióticos en estudios preclínicos. El primer desafío es superar la resistencia intrínseca de los ratones a los abscesos de micobacterias. El segundo desafío es generar un lote reproducible de bacterias incrustadas en el agar para la infección intratraqueal. Queremos compartir un protocolo detallado de preparación e infección del latido de agar que otros laboratorios pueden implementar fácilmente para probar nuevos medicamentos en ratones.

La infección con bacterias incrustadas en el agar beat en lugar de bacterias libres, supera parcialmente la capacidad de los ratones inmunocompetentes para eliminar espontáneamente la infección. Este modelo proporciona una herramienta preclínica sólida para evaluar nuevos antibióticos contra Mycobacterium abscessus, lo que facilita el descubrimiento y desarrollo de antibióticos muy necesarios contra las infecciones pulmonares.

[Instructor] Para comenzar, obtenga cultivos en suspensión de mycobacterium abscessus de crecimiento exponencial ajustados a una densidad óptica de 30. Transfiera 27 mililitros de barrena de soja tríptica fundida preequilibrada a 50 grados centígrados en un tubo que contenga tres mililitros de suspensión bacteriana. Mezclar la suspensión pipeteando. Pipetea con cuidado la mezcla de bacterias del sinfín en un matraz que contenga 60 mililitros de aceite mineral en un matraz. Coloque el matraz en un recipiente secundario e inmediatamente comience a agitar a velocidad media en un agitador magnético usando una barra de agitación magnética. Asegúrese de que se forme un vórtice visible en la mezcla de la barrena de aceite y continúe revolviendo durante seis minutos a temperatura ambiente. Coloque hielo en el recipiente secundario para permitir que la suspensión se enfríe. Luego transfiera la mezcla de lechada a tubos de centrífuga de 250 mililitros. Centrifugar la suspensión a 3.700 G durante seis minutos a cuatro grados centígrados durante los primeros cinco ciclos, y volver a suspender el gránulo del talón de barrena con DPBS. Además, ensamble un filtro de celda de embudo, un anillo conector y un tubo de 50 mililitros en una sola unidad. Después del 10º lavado, vuelva a suspender el gránulo y diluya la suspensión del cordón cuatro veces. Agregue el material de muestra diluido en el colador para filtrar la suspensión de cordones. Lentamente, tire del pistón de una jeringa de 30 mililitros conectada al anillo conector para crear succión y mejorar la filtración. A continuación, centrifugar la suspensión diluida a 1000 G durante dos minutos para concentrarla. Después de tirar de los gránulos de perlas en un tubo de 50 mililitros, guárdelos a cuatro grados centígrados hasta por una semana, pero prepare perlas nuevas para cada lote de experimentos. Para comenzar, sujete los ratones CD One sedados utilizando un soporte tridimensional e inclinado impreso diseñado a medida. Asegure el ratón por sus incisivos con una cuerda de sutura unida a la varilla central del soporte. Colocando al ratón en una postura ventral recostada con la cabeza levantada. Conecte una aguja de alimentación de animales de calibre 24 de metal a una jeringa de vidrio llena de suspensión de perlas de barrena de mycobacterium abscessus. Coloque clips o tapones de nailon en el émbolo para garantizar un volumen de inóculo controlado de 50 microlitros por ratón. Ahora, coloque la aguja de sonda de metal verticalmente sobre el mouse. Inserte con cuidado la aguja en la parte superior y deslícela más hacia abajo en la tráquea. Retire el clip o tapón de nailon y dispense lentamente 50 microlitros de suspensión de perlas de barrena de Mycobacterium abscessus en los pulmones. Deje reposar el mouse durante cinco minutos. Luego repita el procedimiento de inoculación por segunda vez para asegurar una deposición profunda y reproducible del inóculo completo en los pulmones. Las perlas de barrena que contenían mycobacterium abscessus expresaban proteína fluorescente de color rojo cereza y variaban en tamaño de aproximadamente 70 a 250 micrómetros. La carga bacteriana en seis preparaciones de perlas independientes mostró una alta reproducibilidad. El recuento bacteriano antes y después de pasar por la jeringa de vidrio no mostró una pérdida significativa de carga bacteriana. El método de inoculación intertraqueal fue reproducible en tres preparaciones de perlas independientes, como lo muestran los recuentos de UFC pulmonares a las 24 horas posteriores a la infección. Se confirmó la reproducibilidad de la infección entre tres operadores independientes, ya que los recuentos de UFC pulmonares a las 24 horas posteriores a la infección se mantuvieron constantes en todos los grupos.