Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Esta investigación se centra en materiales biológicos blandos y tiene como objetivo explorar los mecanismos físicos subyacentes que regulan la forma y la organización y los materiales inspirados en las células biológicas.

Los sistemas de modelos biológicos e in vitro son intrínsecamente complejos con muchos escollos, y la preparación de muestras es fundamental para su reproducibilidad. Este protocolo está diseñado para mejorar la reproducibilidad en estos sistemas.

Estos resultados allanan el camino para detectar, caracterizar mecanismos y comprender la función de las fuerzas físicas y los biomateriales. Esto puede ser generalizable a varios biopolímeros y orgánulos.

[Narrador] Para comenzar, prepare la muestra que se cargará agregando cinco microlitros de tampón 10XF en un tubo de microcentrífuga y agregue un volumen de agua destilada desionizada de modo que el volumen final de la muestra sea de 50 microlitros después de agregar los componentes restantes. Pipetear un microlitro de beta-mercaptoetanol al 25%, un microlitro de 225 miligramos por mililitro de glucosa, un microlitro de una mezcla de glucosa oxidasa y 85.000 unidades por mililitro de catalizador en la solución. Luego agregue un microlitro de ATP 25 milimolares y 10 microlitros de metilcelulosa al 2%, 15 centipoise y mezcle bien mediante pipeteo. Para comenzar la polimerización de la actina, mezcle actina sin marcar con actina marcada y agregue la mezcla de actina a la solución tampón F preparada. Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo para asegurar una mezcla adecuada. Deje que la actina polimerice a temperatura ambiente en el tubo de microcentrífuga. A continuación, para preparar una celda de flujo, coloque dos trozos de cinta adhesiva de doble cara paralelos entre sí a lo ancho del portaobjetos del microscopio para formar los límites del canal de la celda de flujo. Coloque el cubreobjetos sobre el canal de la cinta asegurándose de que quede perpendicular al portaobjetos del microscopio. Presione hacia abajo el área del cubreobjetos que está en contacto con la cinta de doble cara para crear un buen sellado y eliminar las bolsas de aire. Con una cuchilla de afeitar, recorte el exceso de cinta del portaobjetos del microscopio y cubra el envoltorio de modo que la única cinta visible esté dentro del canal de muestra. Para preparar una cámara de muestras cilíndrica para dos muestras de descepilladora, primero enjuague el cubreobjetos con etanol, agua y etanol. Sécalo con aire filtrado. Aplique una capa delgada de epoxi de cinco minutos para adherir el cilindro de clonación de vidrio al cubreobjetos. Agregue 3,5 microlitros de solución de tensioactivo de aceite a un tubo de microcentrífuga transparente o de color claro. Sin mezclar, pipetear cinco microlitros de la solución de actina en la parte superior de la capa de tensioactivo de aceite. Cierre el tubo. Sostenga la parte superior del tubo de microcentrífuga y mueva el borde inferior para formar una espuma inicial con emulsión visible y continúe moviendo hasta que forme microemulsiones uniformes. Antes de cargar la celda de flujo, mezcle una pequeña cantidad de epoxi de cinco minutos. Para cargar una celda de flujo, pipetee de uno a tres microlitros de solución de tensioactivo de aceite en el canal de muestra de la celda de flujo para crear un pequeño tapón que humedezca el canal. Incline la celda de flujo para eliminar cualquier espacio de aire que se forme debido al menisco surfactante de aceite que retrocede antes de agregar la muestra. Pipetee inmediatamente la suspensión de emulsión de la solución de muestra en la entrada de la celda de flujo para llenar el canal. Selle cada lado del canal de la celda de flujo con epoxi de cinco minutos. Para cargar la cámara de muestras del cilindro para muestras sin emulsión, pipetee cinco microlitros de solución de tensioactivo de aceite en el fondo de la cámara del cilindro de vidrio. Incline y gire lentamente el cubreobjetos para cubrir la superficie y el cilindro inferior con la solución tensioactiva. Elimine el exceso de solución de tensioactivo de aceite con una pipeta para obtener una capa delgada y evitar la evaporación completa del aceite. Agregue inmediatamente la solución de muestra a la cámara. Cubra la cámara con un pequeño trozo de politetrafluoroetileno o cinta de PTFE para evitar la evaporación y el flujo. Monte la muestra en la platina del microscopio. Inicie la obtención de imágenes de lapso de tiempo de actina utilizando un objetivo de 20x, 40x, 60x o 100x con inmersión en aceite o agua para garantizar una apertura numérica suficientemente alta para imágenes de alta resolución. Si polimeriza en una cámara de muestra, deje la polimerización durante aproximadamente 30 minutos o hasta que no haya alargamiento o movimiento visible del filamento. Agregue un reticulante a la muestra, luego agregue miosina como filamentos prepolimerizados pipeteando lentamente aproximadamente la mitad del volumen total en la muestra. Finalmente, inicie la imagen de lapso de tiempo. Aquí se muestra la imagen de fluorescencia confocal representativa de la red de actina entrelazada. La red de actina entrelazada se distribuye uniformemente por la superficie. Los puntos brillantes en esta imagen representan superposiciones de filamentos, mientras que las regiones oscuras indican una presencia mínima de actina. Las fluctuaciones térmicas conducen a cambios de intensidad local y a una flexión visible de los filamentos de actina. La adición de miosina II provoca la flexión y reorganización de la red de actina con acumulación visible de miosina puncta durante mucho tiempo. La contracción de la red depende de la concentración de miosina y la concentración de ATP. En las redes de actina reticuladas, la contracción inducida por miosina conduce a un movimiento coordinado en escalas de longitud más largas en comparación con las redes entrelazadas.