Name: Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T16:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprende a preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales entrelazados y reticulados para estudiar materiales biológicos blandos. Este protocolo mejora la reproducibilidad en sistemas in vitro y revela mecanismos físicos de organización celular.

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<ol><li>Marchetti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+of+soft+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Mod+Phys%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics of soft active matter.</a> Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).</li>
<li>Needleman, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+matter+at+the+interface+between+materials+science+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Active matter at the interface between materials science and cell biology.</a> Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).</li>
<li>Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+cells+into+shape%3A+the+mechanics+of+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 486-498 (2015).</li>
<li>Cáceres, R., Abou-Ghali, M., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+the+actin+cytoskeleton+at+or+near+surfaces+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reconstituting the actin cytoskeleton at or near surfaces in vitro.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1853 (11), 3006-3014 (2015).</li>
<li>Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanical+resilience+to+active+material+properties+in+biopolymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks.</a> Nat Rev Phys. 1 (4), 249-263 (2019).</li>
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<li>Alfaro-Aco, R., Petry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+microtubule+cytoskeleton+piece+by+piece%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Building the microtubule cytoskeleton piece by piece.</a> J Biol Chem. 290 (28), 17154-17162 (2015).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
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<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nat Phys. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
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<li>Zhang, R., Kumar, N., Ross, J. L., Gardel, M. L., De Pablo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+structure%2C+elasticity%2C+and+dynamics+in+actin-based+nematic+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interplay of structure, elasticity, and dynamics in actin-based nematic materials.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), E124-E133 (2018).</li>
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<li>Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics%2C+architecture%2C+and+mechanics+in+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility.</a> Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).</li>
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<li>Lengsfeld, A. M., Lowt, I., Wielandt, T., Dancker, P., Hasselbach, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+phalloidin+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of phalloidin with actin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 31, 846(1974).</li>
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<li>Heymann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+solgel+transformations%3A+I.+the+inverse+solgel+transformation+of+methylcellulose+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Faraday+Soc%22%5BJournal%5D)">Studies on solgel transformations: I. the inverse solgel transformation of methylcellulose in water.</a> Trans Faraday Soc. 31, 846(1935).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6643">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68127">10.3791/68127</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68127">Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops</a>. The Affiliations&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 0,6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-123</td><td></td></tr><tr><td>008-Fluorosurfactante</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>00115081361-6525</td><td>Solución alternativa a premezclada</td></tr><tr><td>008-FluoroSurfactante en HFE7500</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactante-2wtH-50G</td><td>Solución premezclada</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (&beta;-mercaptoetanol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689</td><td>Número CAS: 60-24-2 Solución madre: 25 mM en agua MilliQ, almacenada a 4 &°; C</td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfónico (HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Número CAS: 7365-45-9</td></tr><tr><td>5 min Epoxi</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AKL99-A</td><td>>99% puro de músculo esquelético de conejo (alternativo a la purificación)</td></tr> <tr><td>Actina (marcada con rodamina)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AR05-A</td><td>Músculo esquelético de conejo (Alternativo a la purificación)</td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td>Número CAS: 34369-07-8 Solución madre: 25 mM en agua MilliQ, almacenar a -20 &deg; C Mantener congelado para evitar la hidrólisis</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Número CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>Proteína de recubrimiento (ratón)</td><td></td><td></td><td>Purificado de la sobreexpresión en E.coli con un HisTag Solución madre: 20 mM en tampón de proteína de tapado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Catalasa de hígado bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9322</td><td>Número CAS: 9001-05-2 Solución madre: 85 ku/mL, almacenar alícuota con glucosa oxidasa a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>12544C</td><td>Borosilicato, #1.5, 24 mm x 40 mm Fisherbrand no Fisher Finest</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>Número CAS: 50-99-7 Solución madre: 225 mg/mL en agua MilliQ, almacenar a -20 &deg; </td></tr><tr><td>C Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3860-OP</td><td>Número CAS: 3483-12-3 Solución madre: 1 M en agua MilliQ, almacenar a -20 &grados; Cinta de</td></tr><tr><td>doble cara</td> C <td>3M</td><td>3136</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol de etilo a prueba de 200 PHARMCO</td><td></td><td>111000200</td><td>Número CAS: 64-17-5 Prueba de 200</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetileéter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Número CAS: 67-42-5</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td>Número CAS: 60-00-4</td></tr><tr><td>Glucosa Oxidasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>345386</td><td>Número CAS: 9001-37-0 Solución madre: 135 mg/mL en agua MilliQ, almacenar alícuota con catalasa a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>356352M</td><td>Número CAS: 56-81-5</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Bioreactivos&nbsp;</td><td>BP305-50</td><td>Número CAS: 288-32-4</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Fisher Bioreagents&nbsp;</td><td>BP214</td><td>Número CAS: 7786-30-3, 7791-18-6</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0512</td><td>Número CAS: 9004-67-5 15 centipoise</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Plain</td><td>Electron Microscopy Sciences/Gold Seal</td><td>63710-05</td><td>&nbsp; 3"x1", 1 mm de espesor</td></tr><tr><td>Agua MilliQ</td><td>Millipore</td><td>CUFBI001</td><td>Agua ultrapura</td></tr><tr><td>Novec-7500 Fluido de ingeniería 3M</td><td></td><td>7100134816</td><td>Alternativa a la solución premezclada</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>Número CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio (KPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>Número CAS: 7758-11-4</td></tr><tr><td>Polvo de acetona para el músculo esquelético del conejo</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>41995-1</td><td>Se utiliza para purificar actina (alternativa a la compra) Almacenar alrededor de 30 mM en actina Tampón G a -80 &grados; C</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289</td><td>Número CAS: 26626-22-8</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina-C6-maleimida</td><td>AnaSpec</td><td>AS-81445</td><td>Número CAS: 174568-68-4 Se utiliza para purificar actina (alternativa a la compra) Almacenar alrededor de 30 mM en actina Tampón G a -80 &deg;C. Se utiliza para etiquetar actina (alternativa a la compra)</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico Tris (Tris HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648317</td><td>Número CAS: 1185-53-1</td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Emerson Branson</td><td></td><td></td>CPX2800H</tr></tbody></table>

ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops

Se puede formar una amplia gama de ensamblajes de actina en sistemas modelo utilizando proteínas purificadas siguiendo la estrategia general descrita en estos métodos, donde la actina se polimeriza en filamentos en presencia de proteínas accesorias que modifican la arquitectura del ensamblaje (Figura 1). Cuando la actina se polimeriza en filamentos sin reticulantes ni proteínas de recubrimiento, forma redes de filamentos entrelazadas (Figura 1A). La adición de r...

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Actin cytoskeleton-based materials are widely investigated as model cellular materials to elucidate physical mechanisms of cell mechanics, such as shape ...

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Research

Investigación

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Biology

Biología

Demostramos la preparación de elastómeros de cristal líquido (LCEs) a base de siloxano y epoxi y nanocompuestos LCE. Los LCEs se caracterizan con respecto a la deformación reversible, el ordenamiento del cristal líquido y la rigidez. Como aplicación potencial, demostramos su uso como sustratos sensibles a la forma en un dispositivo personalizado para el cultivo celular activo.

Preparación de monodominio de cristal líquido elastómeros y elastómeros de cristal líquido nanocompuestos

Aquí, fabricamos micro/nano estructuras poliméricas en 3D en las que tanto la forma como la alineación molecular se pueden diseñar con precisión a escala nanométrica mediante el uso de escritura láser directa. La deformación inducida por la luz de varios tipos de microestructuras de elastómeros cristalinos líquidos se puede controlar a escala microscópica.

De forma libre actuadores de luz - Fabricación y Control de la Actuación en la escala microscópica

Este estudio presenta una metodología para preparar 3D,, andamios celulares similares a espuma biodegradables a base de la cadena lateral elastómeros de cristal líquido biocompatibles (LCE). experimentos de microscopía confocal muestran que las LCE similares a espuma permiten para la fijación celular, la proliferación y la alineación espontánea de mioblastos C2C12s.

Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

El objetivo del protocolo es crear películas de polímero cristalino líquido que pueden oscilar mecánicamente bajo irradiación de la luz continua. Describimos con gran detalle el concepto del cine independiente, desde el método de alineación del cristal líquido para la impulsión de la foto. El protocolo experimental aplicado para preparar este material es ampliamente aplicable.

Preparación de redes de cristal líquido para macroscópico movimiento oscilatoria inducida por luz

Este artículo describe el proceso de microfluidos y parámetros para preparar partículas accionamiento de elastómeros cristalinos líquidos. Este proceso permite la preparación de la impulsión de las partículas y la variación de su tamaño y forma (de Oblatos a fuertemente prolato, core-shell y morfologías de Janus) así como la magnitud de la actuación.

Preparación de microfluídica de elastómero cristalino líquido actuadores

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

Aquí se presentan métodos para preparar nemática activa a partir de microtúbulos y motores de quinesina, incluida la preparación y construcción de proteínas y el uso de pozos para el confinamiento nemático activo.

Formación, confinamiento y observación de nemática activa basada en microtúbulos

En este trabajo, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para estudiar la poroelasticidad de los geles de actomiosina en condiciones controladas. Se cuantifica la dinámica del gel de actomiosina y el disolvente incrustado, a través de la cual se demuestra la porosidad de la red. También discutimos los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.

La mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular

Aprende a preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales entrelazados y reticulados para estudiar materiales biológicos blandos. Este protocolo mejora la reproducibilidad en sistemas in vitro y revela mecanismos físicos de organización celular.

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Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

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