Separación y caracterización diferencial de vesículas extracelulares microbianas intestinales en ratas sensibles a la sal en condiciones de dieta alta en sal

Esta investigación explora el papel de las vesículas extracelulares microbianas intestinales en ratas hipertensas sensibles a la sal con una dieta alta en sal, examinando cómo una dieta alta en sal altera las vesículas e influye en las interacciones hipertensivas e inmunes. Los avances recientes en este campo incluyen la comprensión del papel de las vesículas extracelulares microbianas intestinales en la hipertensión, la evaluación del impacto de las dietas altas en sal en la diversidad microbiana y la implementación de intervenciones basadas en plantas dirigidas a las vesículas de la regulación metabólica e inmunológica. Los desafíos experimentales actuales incluyen aislar vesículas extracelulares de alta prioridad, distinguir también las vesículas derivadas de las vesículas del microbioma, minimizar la pérdida de muestras en los protocolos de teñido estándar para garantizar la reproducibilidad en todos los estudios. Esta cuadrícula de densidad y protocolo de centrifugación proporciona una mayor prioridad a las vesículas extracelulares con una integridad y reproducibilidad mejoradas en comparación con los métodos tradicionales, lo que permite una investigación más confiable de vesículas extracelulares del microbioma intestinal en estudios de hipertensión.

[Narrador] Para comenzar, transfiera cinco gramos de heces a un tubo de centrífuga de 50 mililitros previamente pesado. Agregue 50 mililitros de PBS precalentado a 37 grados Celsius libre de endotoxinas al tubo y gírelo durante 30 minutos. Enfríe la centrífuga de alta velocidad a 4 grados centígrados. A continuación, coloque la muestra simétricamente en la centrífuga y centrifugue a 8.000 G durante 15 minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de centrífuga estéril. Después de centrifugar nuevamente durante 15 minutos, aspire el sobrenadante con cuidado y utilícelo para un análisis posterior. Coloque una unidad de filtro estéril de 0,22 micrómetros sobre hielo. Transfiera el sobrenadante a la parte superior del filtro y encienda la bomba de vacío para recoger las muestras filtradas. Transfiera el filtrado a un filtro centrífugo con un corte de 10 kilodalton y una capacidad de 15 mililitros. Centrifugar a 4 grados Celsius 3000G durante 30 minutos para concentrar la muestra en al menos 1.400 microlitros. Coloque inmediatamente la muestra en hielo. Mezcle un volumen de tampón de gradiente A con cinco volúmenes de medio de gradiente de densidad para preparar la solución de trabajo. Prepare una solución de yodixanol al 10% mezclando una unidad de solución de trabajo con cuatro unidades de tampón B. De manera similar, mezcle dos unidades de solución de trabajo con tres unidades de tampón B para una solución de yodixanol al 20% y cuatro unidades de solución de trabajo con una unidad de tampón B para una solución de yodixanol al 40%. Ahora mezcle la muestra concentrada preparada anteriormente con siete mililitros de medio de gradiente de densidad para hacer una solución de yodixanol al 50%. Para preparar un gradiente de densidad, agregue una solución de azul de tripano a las soluciones de yodixanol al 40% y al 10%. Transfiera ocho mililitros de solución de yodixanol al 50% al fondo de un tubo de centrífuga de polipropileno de pared delgada. Incline el tubo a 70 grados y transfiera ocho mililitros de solución de yodixanol al 40% a la superficie del líquido. A continuación, agregue ocho mililitros de solución de yodixanol al 20%, seguidos de siete mililitros de solución de yodixanol al 10% y dos mililitros de PBS sin endotoxinas. Tome el tubo de gradiente de densidad preparado y colóquelo en una ultracentrífuga preenfriada. Establezca los parámetros de ultracentrifugación en 100,000G 20 horas y 10 grados Celsius y comience la ejecución. Para la separación manual de densidad de gradiente para la recolección, el gradiente de densidad es de aproximadamente 34 mililitros de líquido. Se extraen lentamente dos mililitros de solución del centro de la superficie del líquido, y cada solución de dos mililitros es un gradiente. Entonces, la solución de gradiente de densidad se divide en 17 gradientes. Finalmente, con una pipeta, transfiera las fracciones de densidad a tubos de muestra estériles e inmediatamente colóquelas en hielo. El análisis de seguimiento de nanopartículas reveló los perfiles de tamaño, distribución y concentración de vesículas extracelulares recolectadas de diferentes fracciones de gradiente de densidad. La mayoría de las vesículas extracelulares en todas las fracciones se concentraron dentro del rango de tamaño de 30 a 100 nanómetros siguiendo un patrón de distribución típico. La concentración de vesículas extracelulares alcanzó su nivel más alto en la fracción nueve, alcanzando un máximo de aproximadamente 3,85 veces 10 a la potencia de nueve partículas por mililitro. El contenido de proteína, medido con un kit de ácido bicinconínico, también fue más alto en la fracción nueve con 0,417 microgramos por microlitro. Además, los niveles de expresión de lipopolisacáridos, determinados mediante un kit de detección de endotoxinas, se elevaron significativamente en las fracciones nueve y 10. También se observaron mayores cantidades de proteína en la fracción nueve durante el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. La microscopía electrónica de transmisión, o imágenes TEM, reveló que las vesículas extracelulares poseían una morfología circular similar a una membrana.