Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Las proteínas operan en un espacio de estados complejo y gran parte de él está oculto. Utilizamos imágenes de moléculas individuales para revelar estos estados. Al rastrear proteínas de membrana simple en una bicapa lipídica, los principales retos son la preparación de la muestra, el fotoblanqueo y la resolución temporal.

Para empezar, retira las soluciones de los tallos lipídicos del congelador y déjalas alcanzar la temperatura ambiente. Saca un matraz limpio de 10 mililitros del horno y déjalo enfriar a temperatura ambiente. Añade 900 microlitros de cloroformo de grado espectroscópico y 100 microlitros de metanol de grado espectroscópico al matraz de fondo redondo refrigerado.

Luego añade la cantidad adecuada de cada lípido al matraz y remueve para mezclar bien. Ahora coloca un conector de destilación al vacío encima del matraz de fondo redondo y conéctalo a la línea de secado de nitrógeno. Luego enciende el gas nitrógeno y ajusta la presión hasta que el flujo apenas se sienta en el dorso de la mano.

Pipetear un mililitro de tampón por cada cinco micromoles de lípidos totales en el matraz de fondo redondo. Coloca un tapón de cristal en el frasco y sélalo con película de parafina. Coloca el matraz y una pinza en un soporte de anillo y sumerge su parte inferior en un baño de sonicador a 60 grados Celsius.

Confirma que la solución se vuelve opaca y que no quedan lípidos adheridos a la pared interna del matraz. Tras la incubación de una hora, enciende el sonicador y ajusta la amplitud al máximo. Mueve el matraz dentro del baño para localizar el punto con mayor agitación donde la solución golpea y rocía visiblemente dentro del matraz.

Sonica la solución durante 30 minutos. Observando la transición de opaco a transparente y ligeramente opalescente. Retira la solución lipídica del matraz y transfierela a un tubo microcentrífuga.

Centrifuga el tubo a 100.000 G durante una hora a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, retirar y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo centrifugador. Coloca los deslizamientos de cuarzo de 25 milímetros en un vaso de precipitados y añade volúmenes iguales de agua nanopura, peróxido de hidrógeno al 30% y ácido nítrico concentrado.

Calienta la tapa en la solución preparada durante 30 minutos hasta que empieza a burbujear. Revisa la solución cada 10 minutos y haz girar suavemente para evitar que las tapas se enganchen entre sí. Observa cómo la cubierta se desliza y se separa durante el giro.

Una vez separados, reduce gradualmente la velocidad de giro para mantener la separación y permite que la solución burbujeante cubra la tapa se deslice de forma uniforme. Luego enjuaga bien la tapa y desliza con agua purificada mientras se gira suavemente para eliminar todos los residuos químicos. Alternativamente, limpia los deslizantes de la cubierta de cuarzo usando n-hexano seguido de metanol, limpiando con papel de lente para cada disolvente.

Coloca las tapas dentro de un limpiador UV de ozono, con la superficie a tratar orientada hacia la lámpara. Permite que el oxígeno entre en la cámara a cinco libras por pulgada cuadrada durante cinco minutos. Luego corta el flujo de osígeno.

Ahora enciende las luces ultravioleta durante 15 minutos y deja que las cubiertas se deslizen al menos 10 minutos para que el ozono se disipe. Coloca una tapa recién limpia en un portamuestras de 25 milímetros. Usando un tubo SM de un cuarto de pulgada y un único objetivo, corta una junta de doble capa de película par de ocho milímetros de diámetro y colócala en el centro del portamuestras.

Aplica una gota de 50 microlitros de las pequeñas vesículas Unilamelares en el centro de la junta de ocho milímetros. Después de sellar la cámara, incubar a 37 grados Celsius durante una hora. Después de la incubación, usa una pipeta para enjuagar la solución.

Añade 50 microlitros de tampón fresco a la bicapa y repite este proceso un total de 10 veces. Tras el enjuague final, retira el buffer del portamuestras. Añade una aliteracia de 50 microlitros de la proteína deseada en detergente, asegurando que la concentración esté igual o por debajo de la concentración crítica de micela.

Incuba la muestra a 37 grados Celsius durante al menos una hora para permitir la incorporación de proteínas, enjuaga la muestra con tampón para eliminar cualquier proteína y detergente no incorporado. Ajusta la velocidad de desplazamiento vertical de píxeles a aproximadamente 600 nanosegundos y aumenta el voltaje de reloj vertical usando el modo overclock. Luego configura la lectura horizontal de píxeles a su velocidad máxima.

Ajusta la ganancia del preamplificador a dos. Ajusta la salida del amplificador para la multiplicación de electrones y ajusta la ganancia del multiplicador de electrones a su nivel más alto. Luego ajusta el tiempo de exposición a 25 milisegundos.

Confirma que la tasa real de fotogramas supera ligeramente el tiempo de exposición. Ahora ajusta la potencia del láser hasta que la señal destaque claramente sobre el ruido de fondo. Recoge suficientes datos de imagen para obtener un mínimo de 1000 pistas por muestra.

Para el análisis de seguimiento, recorta todos los conjuntos de datos a un tamaño consistente y realiza correcciones de fondo usando Image J.In Fiji, arrastra y suelta el archivo TIFF o apila en la interfaz. Para introducir los detalles de calibración de píxeles, ve a la pestaña de analizar, selecciona ajustar escala y aplica la calibración de píxel a distancia específica para el instrumento. Luego guarda una copia del conjunto de datos para preservar el original y hacer un seguimiento de cualquier cambio realizado.

Resta el fondo de una región seleccionada de interés y aplícalo a la copia guardada de los datos originales. Ve a la pestaña de procesos y elige restar fondo. En la pestaña de plugins, selecciona tracking, seguido de trackmate para abrir la ventana de diálogo trackmate para el análisis de trackmate.

El grado de marcaje para los cuatro tetrameros de AQP se calculó en 4,12 utilizando espectrometría UV visible y el análisis de distribución de Poisson indicó que el 98% de los tetramers llevaban al menos una molécula de colorante fluorescente. El histograma muestra una amplia distribución de tamaños de pasos consistentes con la difusión de matrices ortogonales de partículas de diferentes tamaños, y el coeficiente medio de difusión calculado fue de 0,0143 micrómetros cuadrados por segundo. En este vídeo, hemos identificado estados clave importantes para la regulación de la acuaporina cuatro y sus fuerzas termodinámicas asociadas.

Este protocolo elimina la incertidumbre en la creación de membranas biomiméticas con proteínas transmembrana purificadas que sean adecuadas para el seguimiento de moléculas individuales en lapso de tiempo. Las máquinas de proteínas operan en puntos de inflexión, el seguimiento de una sola proteína en lapso de tiempo permite la observación directa de vías estocásticas, ramas y callejones sin salida.