Name: Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a rastrear proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia de molécula única. Este protocolo permite estudiar la dinámica de proteínas de membrana como aquaporina cuatro.

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<table><tbody><tr><td>Placa de onda 1/4</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>Asegúrate de igualar el láser</td></tr><tr><td>Objetivo 100X Oil</td><td>Olimpo</td><td>12-563-659</td><td>1,45 N/D apocromático</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850457</td><td>POPC Fosfolípidos</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 PE</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>880210</td><td>Sal de amonio</td></tr><tr><td>Objetivo de 300 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Láser He:Ne de 633 nm</td><td>Melles Griot</td><td>05-LHP-927</td><td>Puede cambiarse a otras fuentes y a otras longitudes de onda</td></tr><tr><td>Filtro pasa banda de 633nm</td><td>Chroma Tech</td><td>633/10X</td><td>Coincidencia con el láser que se está usando</td></tr><tr><td>Filtro pasa-largo de 655 nm</td><td>Chroma Tech</td><td>ET655lp</td><td>Cambia para que coincida con las longitudes de onda del tinte/láser</td></tr><tr><td>Andor Solis I</td><td>Andor&nbsp;</td><td>Andor Solis I</td><td>Software para captura de imágenes</td></tr><tr><td>ATTO 655&nbsp;</td><td>ATTO-TEC</td><td>655 d.C.</td><td>Modificación NHS-Ester, cualquier tinte con la modificación adecuada para trabajar con moléculas individuales puede usarse. Se recomienda ATTO, pero se puede usar Cy5/7</td></tr><tr><td>Bio-perlas SM-2 Resina</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155-50MG</td><td>de hígado bovino, soltion acuosa y ge; 30.000 unidades/mg</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>C547-1</td><td>HPLC o grado espectroscópico</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Cubiertas</td><td>Óptica ESCO</td><td>R525000</td><td>Cuarzo de 25mm</td></tr><tr><td>Divisor de haz dicróico</td><td>Semrock</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>Cambia para que coincida con las longitudes de onda del tinte/láser</td></tr><tr><td>Cámara EMCCD</td><td>Andor&nbsp;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes 15mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Tubos de cultivo celular Cellestar</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133-50KU</td><td>de Aspergillus niger, Typer VII, &ge; 100000 unidades/g sólido (sin oxígeno añadido)</td></tr><tr><td>Pistola de calor</td><td>Carga portuaria</td><td>56434</td><td>Utilizado en el calentamiento del parafilm, generalmente se podía emplear cualquier pistola de calor</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biorreactivos de Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión de baja autofluorescencia</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>Methonal</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>A452-1</td><td>HPLC o grado espectroscópico</td></tr><tr><td>Tubo microcentrífuga</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Pipetters</td><td>Ependorf</td><td></td><td>Varios; 1000 y micro; L, 100 y micro; L y 10 & micro; Se sugieren L</td></tr><tr><td>& Oslash; Tubos de lente de 1,5"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>El hilo externo se corta para preparar la muestra</td></tr><tr><td>Tabla óptica</td><td>Newport</td><td>Dependencia del RPR</td><td>El tamaño de la tabla depende del espacio disponible</td></tr><tr><td>Tejidos ópticos</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>Limpieza de varios componentes</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7669</td><td>No comprueba nada fluorescente en los gases durante el proceso</td></tr><tr><td>Actuador piezoeléctrico</td><td>Newport</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>Aisladores neumáticos de vibración</td><td>Newport</td><td>Serie I-2000</td><td>se utiliza para estabilizar la mesa óptica ante cualquier irregularidad &nbsp;</td></tr><tr><td>Baño refrigerado</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>Vinculado al software de imagen</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Steritop</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Controlador y controlador de la caja de interruptores &nbsp;</td><td>Newport</td><td>PZC200</td><td>Controlador de escenario</td></tr><tr><td>Filtro de jeringuilla</td><td>J.T. Baker</td><td>SF01-98</td><td>PES 25mm 0.2 y micro; M</td></tr><tr><td>Elemento TEC</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>Se utiliza para conectar la bomba de calor Peltirer al portamuestras y al collar objetivo</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Ingeniería Meerstetter</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>Detector de temperatura</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>Termistor</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Dializador de tubo</td><td>G Biociencias</td><td>786-611</td><td>MWCO 4K</td></tr><tr><td>Limpiador UV de ozono</td><td>Novascan</td><td>PSDP_UV</td><td>Pro Series - Digital y nbsp;</td></tr><tr><td>Zoom Optics&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Direct observation is a fundamental method for scientific discovery and understanding. Time-lapse single-molecule fluorescence imaging allows the ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Aquí, presentamos un protocolo para la sola partícula seguimiento análisis de imagen que permite la evaluación cuantitativa de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y racimo de tamaños de partículas solo detectados por microscopía de fluorescencia.

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Este protocolo describe un enfoque de procesamiento de imágenes basado en iSCAT y seguimiento de una sola partícula que permite la investigación simultánea de la masa molecular y el comportamiento difusivo de las macromoléculas que interactúan con las membranas lipídicas. Las instrucciones paso a paso para la preparación de muestras, la conversión de masa a contraste, la adquisición de películas y el posprocesamiento se proporcionan junto con instrucciones para prevenir posibles trampas.

Seguimiento de partículas sensibles a la masa para caracterizar la dinámica de macromoléculas asociada a la membrana

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía TIRF para rastrear canales iónicos individuales y determinar su actividad en las membranas lipídicas soportadas, definiendo así la interacción entre el movimiento de la membrana lateral y la función del canal. Describe cómo preparar las membranas, registrar los datos y analizar los resultados.

Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Aprende a rastrear proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia de molécula única. Este protocolo permite estudiar la dinámica de proteínas de membrana como aquaporina cuatro.

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

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