Caracterización de la estructura y función de la membrana lipído-proteína usando bicapas de interfaz de gotas

En este trabajo, estudiamos cómo las propiedades físicas y eléctricas de las membranas lipídicas y su entorno impactan en la conducción iónica en sistemas modelo de bicapa con interfaz de gotas. La electrofisiología tradicional de pinza de parche no investiga la biofísica de membranas a mayor escala, pero esta única plataforma captura tanto la actividad de un solo canal como las áreas de membrana de mayor tamaño a escala milimétrica para estudiar más extensamente la biofísica de membranas. Para empezar, preparar los electrodos de alambre de plata clorados recubiertos de agarosa y las soluciones de vesículas lipídicas para experimentos electrofisiológicos.

Para la formación de bicapas de interfaz de gotas, se coloca una placa de Petri transparente en el fondo del microscopio invertido. Llena el recipiente con aceite de alcano, como 100% hexadecano, hasta una profundidad de aproximadamente cinco milímetros. Tras unir los electrodos a la cabeza de la abrazadera de parche y al soporte de electrodos de tierra, se utiliza los controles del micromanipulador para bajar ambos extremos de bola recubiertos de agarosa en el aceite a una profundidad de aproximadamente 2,5 milímetros por debajo de la superficie del aceite, evitando movimientos rápidos para evitar colisiones con la placa de Petri.

Ajusta el enfoque del microscopio hasta que ambos extremos de la bola y sus recubrimientos de agarosa estén en un enfoque nítido. Coloca los electrodos cerca del borde del campo de visión, de modo que ambos puedan observarse simultáneamente. Utilizando una pipeta calibrada de dos microlitros, aspira las vesículas lipídicas DPhPC extruidas, dopadas con gramicidina A. Dispensa lentamente 250 nanolitros de la suspensión directamente en cada extremo esférico recubierto de agarosa usando una punta de pipeta separada para cada uno sin tocar la cáscara de agarosa.

Permite que las gotas se dispersen por la superficie de agarosa y se hundan visiblemente hacia abajo debido a la gravedad y la reducción de la tensión superficial, formando una gota colgante. Observa el hundimiento desde un lado a través de la pared de la placa de Petri si está despejado. Tras cinco minutos, empuja suavemente la mesa antivibración para evaluar la gota.

Confirma que las gotas caídas se mueven con un ligero retraso respecto al movimiento del electrodo, indicando la formación de gotas monocapa lipídicas completamente recubiertas. Si no se observa este comportamiento, espera dos o tres minutos adicionales y repite la evaluación. Asegúrate de que el microscopio, la mesa antivibración, la jaula de Faraday, el amplificador, el digitalizador, el generador de funciones y el ordenador estén conectados a una toma de tierra común.

Disponga las conexiones de los instrumentos según la guía de configuración del fabricante y configure la configuración eléctrica y óptica esencial, siguiendo las instrucciones detalladas para experimentos de bicapa con interfaz de gotas. Configura un generador de funciones externo o el canal de salida del software de adquisición para generar una forma de onda de voltaje triangular de 10 Hertz y 10 milivoltios. Confirma la amplitud y frecuencia en un osciloscopio conectado y en el software de adquisición.

Después de que las gotas se hayan hundido durante aproximadamente 10 minutos, utilice los micromanipuladores para que ambas gotas se acerquen suavemente. Enciende la forma de onda triangular de 10 Hertz, 10 milivoltios y monitoriza la respuesta capacitiva de corriente en el software de adquisición. Ajusta el área de contacto de las gotas moviendo ligeramente los electrodos hasta que la respuesta de corriente capacitiva pico a pico a la forma de onda esté entre aproximadamente 100 y 200 picoamperios.

O el área de contacto no supera aproximadamente 1/4 del diámetro de la gota. Esperar la formación espontánea de bicapas indicada eléctricamente por una respuesta de corriente capacitiva en expansión de pico a pico y ópticamente por una reflexión interna creciente con apariencia ovalada en la región de contacto. Confirmar que las bicapas lipídicas puras muestran mesetas rectangulares de corriente en respuesta al estímulo de voltaje triangular, mientras que las bicapas dopadas con gramicidina A presentan mesetas inclinadas, reflejando conducción iónica conjunta.

Una vez confirmadas las respuestas capacitivas o conductoras estables, apague la forma de onda triangular y permita que la bicapa de la interfaz de gotas se equilibre durante al menos 15 minutos antes de aplicar protocolos de estimulación. En el software de captura de vídeo, configura la tasa de fotogramas a al menos 20 fotogramas por segundo. Selecciona la cámara y la configuración del objetivo adecuadas.

A continuación, haz clic en Adquirir y selecciona Nuevo Protocolo. En la pestaña de Modo de Adquisición, selecciona Estimulación Episódica. Establece las carreras por prueba y barridos por partida a uno.

Ajusta la duración del barrido a cuatro segundos más que la duración total del experimento, permitiendo una línea base de dos segundos antes y después del estímulo. Ajusta la frecuencia de muestreo entre cinco y diez kilohercios. En la pestaña de Entradas, asigna el canal de grabación a la entrada actual.

Y luego, en la pestaña de Salidas, asigna el canal de estimulación a la salida de voltaje que controla los electrodos. Abre la pestaña de Forma de Onda. En la columna A, establece el tipo a Paso, el primer nivel y el nivel delta a cero milivoltios, y la primera duración a 2.000 milisegundos para definir una línea base previa a la estimulación.

En la columna B, se establece el tipo Pulse para facilitar pulsos emparejados. Especificar los valores para la primera duración y la amplitud de tensión de primer nivel y establecer la tasa de tren para definir el intervalo de interpulsos correspondiente al ciclo de trabajo objetivo. Ajusta el ancho de pulso a 100 milisegundos.

En la columna C, para la depresión de pulsos emparejados, se ajusta el tipo a Pulso con la misma amplitud y duración del pulso. Ajusta la velocidad de tren para lograr el ciclo de trabajo más bajo deseado y ajusta el ancho de pulso. A continuación, en la columna D, configura los parámetros post-estimulación idénticos a la línea base previa a la estimulación.

Revisa el protocolo y guárdalo con un nombre descriptivo. Inicia la grabación de vídeo y comienza inmediatamente la adquisición eléctrica y la estimulación haciendo clic en el botón Grabar en cada software. Durante los primeros 60 segundos de estimulación, observa que la corriente aumenta y puede alcanzar una meseta.

Durante los últimos 60 segundos, observa que la corriente disminuye. Al final del protocolo, detener la adquisición eléctrica y la grabación de vídeo simultáneamente. Finalmente, realiza un post-procesamiento para extraer el área de la membrana y calcular la corriente, el área y el flujo normalizados a partir de datos de imagen y eléctricos.

Imágenes secuenciales capturaron un cierre espontáneo de bici y expansión de área cuando dos gotas caídas entraban en contacto. Las brillantes reflexiones ovaladas internas en el contacto de las gotas se utilizaron para estimar el diámetro de la bicapa y el área de la membrana a lo largo del tiempo. Se entregaron la facilitación de pulsos emparejados de cero a 60 segundos y la depresión de pulsos emparejada de 60 a 120 segundos usando pulsos de 100 milisegundos.

Se registraron las respuestas representativas actuales durante los periodos y los patrones de estimulación. Se muestra corriente normalizada para las bicapas DPhPC dopadas con gramocídina A en aceites hexadecanano y dodecano/hexadecano durante la facilitación de pulsos emparejados y la depresión de pulsos emparejados. El área de membrana normalizada medida en 30 puntos temporales mostró una evolución similar en ambas condiciones de aceite a pesar de las diferentes corrientes.

El flujo normalizó los cambios en conductancia independientes del área y fue consistente con cambios en la conducción de membrana más allá de la simple expansión de área. La estimulación prolongada por depresión pulsiva emparejada durante hasta 30 minutos produjo un comportamiento prolongado similar a la depresión en las membranas hexadecana, pero mantuvo un flujo elevado en las membranas dodecano/hexadecana, consistente con un comportamiento a largo plazo similar a la potenciación. Este protocolo nos permite medir cómo cambian la estructura de la membrana y la conducción iónica mediante la reestructuración eléctrica de las bicapas de la interfaz de gotas.

Esta plataforma puede soportar muchos protocolos de estimulación diferentes en dibs con canales iónicos, sin canales iónicos e incluso canales fotoisomerizables para mejorar la dinámica de las membranas y las propiedades eléctricas. Dado que esta plataforma sintonizable sonda tanto la biofísica de membrana a macroescala como a microescala, los experimentos futuros mejorarían mucho al usar espectroscopía de fluorescencia para separar con mayor confianza la actividad de canales proteicos de la conducción de poros de membrana.