Name: El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprende a formar bicapas planas soportadas para estudiar sinapsis inmunológicas mediante microscopía TIRF. Este método permite visualizar la dinámica de formación sináptica y el papel de las proteínas de adhesión celular.

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1. La preparación de los lípidos <ol><li> A fin de vincular las proteínas de la hoja superior de una bicapa, usamos Ni 2 + lípidos quelantes, que anclan las proteínas recombinantes con poli-histidina etiquetas. Ciertos tipos de células pueden adherirse de forma inespecífica a Ni 2 + con recubrimiento bicapa, pero las células T en general, no, por lo que este método óptimo para el estudio de la activación de células T. </li><li> La solución bicapa lipídica se realiza mediante la preparación de una solución de 20% de Ni 2 + quelante de lípidos y el 80% de fosfatidilcolina en la cuantía apropiada en un tubo de vidrio con 2.1 ml de cloroformo-metanol. <ol><li> Se evapora el solvente bajo una corriente de gas nitrógeno en un ambiente cálido (30-37 ° C) baño de agua. Esto suele tardar unos 15 minutos. </li><li> Eliminar cualquier disolvente que queda en alto vacío, utilizando un liofilizador durante 90 minutos. </li></ol></li><li> Disolver los lípidos en el 2% de N-octil-glucósido detergente en Tris-buffer salina, lo que crea una solución de detergente mezclado / fosfolípido micelas. La concentración de fosfolípidos final debe ser de 0,4 mm. Para formar liposomas, diálisis de esta solución con tres cambios de Tris-salina para eliminar los liposomas detergente y forma. Por lo general, trabajan con volúmenes del orden de 1 ml con 6 mm de diámetro Spectra / Por # 2 tubos con un corte alrededor de 10 kDa. Tenemos el cuidado de excluir cualquier burbuja de aire cuando s de sujeción del tubo. Por lo general estériles filtro de esta solución y hacer la diálisis en condiciones de limpieza, la manipulación que utiliza el 70% de etanol guantes esterilizados. </li><li> Esta solución debe ser transparente. Se almacena en atmósfera de argón para evitar la oxidación. Si la solución está turbia, y luego de varias paredes vesículas se han generado, y tendrá que empezar de nuevo. </li></ol> 2. Determinar la cantidad de ICAM-1 y MHC se depositan en la bicapa plana <ol><li> Con el fin de preparar el experimento, primero es necesario determinar la cantidad de ICAM-1 y MHC se depositan en una superficie dada de Ni 2 + quelante bicapa en una determinada concentración de proteína soluble. Para ello, bicapas depósito el 5 de cuentas de vidrio micrómetro de diámetro, se incuban las perlas de vidrio con soluciones de proteínas en las condiciones que se aproximan a los de las células de flujo utilizado para la imagen y leer la densidad de las proteínas mediante un ensayo de flujo immunofluorometric. </li><li> Anticuerpos FITC marcado con un número conocido de fluoresceína por molécula se utilizan para detectar las proteínas unidas a la superficie. Fluoresceína cuentas estándar se utiliza para calibrar el flujo de microfluorimeter. </li><li> Vamos a establecer las condiciones que se aproximan a los de células presentadoras de antígenos con 200 molecules/μm2 de ICAM-1 y 0.2-20 molecules/μm2 de I-Ek-MCC91-103 complejos. </li></ol> 3. Limpieza de los cubreobjetos de vidrio para la formación de bicapas planas <ol><li> Bicapas planas se forman espontáneamente cuando los liposomas se fusionan para vidrio, pero sólo si el cristal se limpian adecuadamente. </li><li> Cuando se trabaja con Piraña, que use ropa de protección completa, incluyendo un delantal y guantes de ácido fuerte, resistente a los ácidos. Con cuidado, separar los residuos de los desechos orgánicos y deshágase de ellos apropiadamente. </li><li> Para preparar la solución Piranha ácido, agregar 75 ml de ácido sulfúrico concentrado a un vaso de seco, y añadir con cuidado 25 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. La solución se calienta rápidamente a más de 100 ° C. </li><li> Sumerja el cubreobjetos secos en la solución durante 15 minutos. Eliminar de la solución y enjuague con agua purificada durante un minuto por cada lado. Seque el cubreobjetos con una fuente de vacío para drenar el agua purificada. Deje que la solución Piranha de enfriar y agregar al contenedor de residuos Piranha, que se queda con la tapa suelta, bien marcado en la campana extractora de humos. Cuando todos los liposomas, cubreobjetos, y las proteínas están preparados, la sinapsis inmunológica está listo para ser formado. </li></ol> 4. La formación de las bicapas <ol><li> Para formar las bicapas, nuestro laboratorio utiliza Bioptechs FCSII cámaras, que tienen la ventaja de calefacción integrado. El sistema FCSII se encuentra en una base de acero inoxidable que se fija en conjunto de un colector de microfluidos con una junta de 0,5 mm superior, un tobogán microaqueduct recubiertas con óxido de estaño e indio para la calefacción en una superficie, con ranura de fluidos en el otro lado, libre de polvo 0,25 mm junta que define la altura de la cámara de flujo y la limpieza Piranha 40 mm cubreobjetos ronda en la que se forma la bicapa. </li><li> Mientras que la hoja de la cubierta, sobre la cual se forma la doble capa, tiene que ser altamente hidrofílico y limpia, la diapositiva microacqueduct realmente funciona mejor si es más hidrofóbico. Haciendo que el hidrofóbicas microaqueduct más se logra mediante el tratamiento con 1% de HSA durante 60 minutos a temperatura ambiente, luego lavar con agua pura y el secado por completo después de este proceso de acondicionamiento, así como entre los usos. La capa de proteínas desnaturalizadas que dejan este procedimiento permite una l de suspensión de liposomas para formar una ronda, hemispherical gota que es&gt; 0,25 mm de alto. </li><li> Para montar la celda de flujo y la forma bicapas planas, coloque el colector, con los tubos dirigidos hacia arriba, sobre una superficie plana. Luego, coloque el 0. 5 mm junta con agujeros colocados en los tubos de fluidos, asegurándose de que está sentado plano. Con cuidado, coloque el lado microaqueduct en la junta con los canales de fluidos hacia arriba, y asegúrese de que se asiente plana sin aplicar ninguna presión a la baja, hasta comprobar que los orificios de la diapositiva se alinean con los tubos de microfluidos. Coloque el polvo 0,25 mm junta con un corte rectangular en la cima de la diapositiva microaqueduct para que el canal está alineada con los canales fluidos y no hay espacios de aire mayor. </li><li> Coloque un máximo de 5 gotas x 1 l de suspensión de liposomas en la superficie de la diapositiva microaqueduct en un patrón tal que la distancia de centro a centro entre cada gota es de 2,5 mm. El 5 gotas de liposomas pueden tener diferentes composiciones, pero en este caso sólo se forman dos capas dobles, uno con no Ni 2 + + lípidos y un quelante con un 10% de Ni 2 + + lípidos quelantes. </li><li> Una vez que las gotas están en su lugar, se coloca cuidadosamente la tapa de deslizamiento sobre la superficie en un solo movimiento. Abrazadera en la base lo más rápidamente posible. Las gotas de liposomas se pondrá en contacto con la hoja de la cubierta. Este contacto no se deben romper, ya que las bicapas probablemente ya han formado, cualquier interrupción puede resultar en bicapas defectuoso. </li><li> Es importante tener en cuenta para marcar las posiciones de las capas dobles con manchas de tinta algunos pequeños en la diapositiva microacqueduct para ayudar en la colocación del cubreobjetos en el microscopio. Espere 20 minutos para asegurarse de que el sistema se haya equilibrado. La transferencia de todas las soluciones con una jeringa de 20 ml conectada a unos 20 cm de tubo flexible y una llave de 3 vías. Conectar otro puerto de la llave de paso a la celda de flujo en un tramo corto de tubería para reducir al mínimo el volumen muerto entre la llave y la célula de flujo. Llene la jeringa con solución salina tamponada con HEPES que contenía 2 mM de MgCl2, 1 mM CaCl 2, 5 mM de glucosa y 1% de albúmina sérica humana. </li><li> El primer tubo de la llave de paso y para que no haya burbujas de aire. Conectar el flujo de las células y empujar a través de 5 ml en un solo movimiento mientras se ve para asegurarse de que no queden burbujas de aire pasar por encima de la bicapa. Ahora, usted tendrá su bicapas. </li></ol> Este vídeo es compatible con el artículo &quot;Hunter Gatherer y en la espalda: las sinapsis inmunológica y Kinapses como variaciones sobre el tema de la locomoción ameboide&quot; por <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a> , <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">Informe Anual de Biología Celular y del Desarrollo</a> , Volumen 24, 2008.

el apoyo de bicapa plana para la formación de estudio de la sinapsis inmunológica y kinapse

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Para imitar la interacción entre los linfocitos y las células presentadoras de antígenos, se utiliza Ni2 + quelante de los lípidos para anclar la adhesión celular recombinante y proteínas MHC de la hoja superior de una bicapa con poli-histidina etiquetas. Bicapas planas son generados por la preparación de los lípidos, el tratamiento de las superficies de vidrio en la doble capa se forma, y ​​luego la formación de la bicapa en una cámara especial que contiene una celda de flujo, donde los linfocitos se añadirán. Entonces, bicapas están acusados ​​de Ni y su marcada con proteínas recombinantes se agregan. Finalmente, los linfocitos se inyectan en la celda de flujo y microscopía TIRF se puede utilizar para la formación de imágenes sinapsis y los mecanismos que controlan la locomoción de las células T, los sitios de la clasificación de los receptores, y los sitios de la degradación del receptor.

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Aquí, se muestra los métodos para el anclaje de las proteínas de adhesión celular sabe que modulan la formación de sinapsis en el folleto superior de la bilyer lípidos y visualizar la formación de sinapsis mediante microscopía TIRF.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

Las bicapas planas soportadas son herramientas potentes que pueden utilizarse para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Para imitar las interacciones...

Hola, soy Mike Dustin del Instituto Geral y de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York. Hoy les guiaré a través del procedimiento para formar bioláminas planas de soporte para el estudio de la sinapsis inmunológica. Así que comencemos.Para formar la bicapa lipídica, preparamos una solución de 20% de lípido quelante de níquel y 80% de fosfatidilcolina en las cantidades adecuadas en un tubo de vidrio con uno a dos mililitros de cloroformo-metanol. El primer paso consiste en evaporar el disolvente bajo un flujo de gas nitrógeno en un baño de agua tibia de 30 a 37 grados Celsius. Esto normalmente toma alrededor de 15 minutos.Luego, elimine cualquier disolvente restante bajo vacío elevado utilizando un liofilizador durante 90 minutos. A continuación, disuelva los lípidos en tampón salino con detergente octil glucósido al 2 %N hasta una concentración final de 0,4 milimolar. Esto crea una solución de micelas mixtas de detergente y fosfolípidos para formar liposomas.Dializa esta solución frente a tres cambios de solución salina de tris para eliminar el detergente y formar liposomas. Normalmente trabajamos con volúmenes del orden de un mililitro, utilizando tubos de seis milí

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

En este video, demostramos un procedimiento para investigar la organización de la septina en una bicapa lipídica soportada por vidrio in vitro utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Ensayo de bicapa lipídica soportada plana: una técnica in vitro basada en microscopía para investigar el ensamblaje de septinas en imitaciones de membranas biológicas

Este video muestra una técnica para visualizar la formación de la sinapsis inmunológica en células asesinas naturales (NK) en una bicapa lipídica (SLB) soportada. El SLB se marca primero con un ligando del receptor activador de células NK marcado con fluoróforos, seguido de la incubación con células NK. Posteriormente, las células se tiñen para obtener actina polimerizada y gránulos líticos perforin-positivos. Este enfoque permite la visualización de la formación de sinapsis mediante...

Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

Este video muestra una técnica in vitro para estudiar la formación de sinapsis inmune entre las células T humanas primarias y las bicapas lipídicas soportadas (SLB). Las proteínas de la superficie de las células T interactúan con los respectivos ligandos inmovilizados en SLB para formar una sinapsis inmunitaria, seguida del movimiento de los gránulos líticos hacia la sinapsis, que se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Una técnica in vitro para estudiar la interacción de las células T con bicapas lipídicas planas soportadas

Este video muestra imágenes de células vivas de la topología inmunológica de la sinapsis, investigando las interacciones entre los linfocitos T y las células epiteliales portadoras de antígenos fluorescentes. La microscopía de fluorescencia revela un desplazamiento rojo del citoplasma y anillos amarillos en la membrana de las células endoteliales, lo que indica la formación de sinapsis inmunológicas.

Evaluación de la topología de la sinapsis inmunológica a través de imágenes de células vivas

Describimos aquí una combinación de la técnica de bicapa lipídica soportada por vidrio para formar sinapsis inmunológicas con la técnica de imagen de superresolución de la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED). El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios las instrucciones necesarias para llevar a cabo con éxito estas dos técnicas.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Aquí describimos dos enfoques para caracterizar los eventos de polarización celular en linfocitos B durante la formación de un IS. El primero, implica la cuantificación del reclutamiento de orgánulos y reordenamientos del citoesqueleto en la membrana sináptica. El segundo es un enfoque bioquímico, para caracterizar los cambios en la composición del centrosoma, que se somete a polarización a la sinapsis inmune.

Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune

Este protocolo analiza tanto la formación de la sinapsis inmunológica como el posterior tráfico secretor polarizado posterior hacia la sinapsis inmunológica. Se formaron conjugados celulares entre una célula Raji con pulso de superantígenos (que actúa como una célula que presenta antígenos) y un clon de Jurkat (actuando como un linfocito T auxiliar del efector).

Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

Aquí presentamos el protocolo para la reconstitución escalonada de células presentadoras de antígenos sintéticos utilizando bicapas lipídicas soportadas por perlas y su uso para interrogar la salida sináptica de las células T activadas.

Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

Se presenta un protocolo experimental para ensamblar, estimular eléctricamente y analizar bicapas de interfaz de gotas dopadas con gramicidina A. Las relaciones estructura-función lipídio-proteína se cuantifican midiendo cambios en el área de membrana, el flujo iónico y la conductancia de canal único, y relacionando estas respuestas con cambios similares a la plasticidad en la conducción iónica en un modelo de membrana inspirado en sinapsis eléctricas.

Caracterización de la estructura y función de la membrana lipído-proteína usando bicapas de interfaz de gotas

Aprende a formar bicapas planas soportadas para estudiar sinapsis inmunológicas mediante microscopía TIRF. Este método permite visualizar la dinámica de formación sináptica y el papel de las proteínas de adhesión celular.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

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