El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

Hola, soy Mike Dustin del Instituto Geral y de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York. Hoy les guiaré a través del procedimiento para formar bioláminas planas de soporte para el estudio de la sinapsis inmunológica. Así que comencemos.

Para formar la bicapa lipídica, preparamos una solución de 20% de lípido quelante de níquel y 80% de fosfatidilcolina en las cantidades adecuadas en un tubo de vidrio con uno a dos mililitros de cloroformo-metanol. El primer paso consiste en evaporar el disolvente bajo un flujo de gas nitrógeno en un baño de agua tibia de 30 a 37 grados Celsius. Esto normalmente toma alrededor de 15 minutos.

Luego, elimine cualquier disolvente restante bajo vacío elevado utilizando un liofilizador durante 90 minutos. A continuación, disuelva los lípidos en tampón salino con detergente octil glucósido al 2 %N hasta una concentración final de 0,4 milimolar. Esto crea una solución de micelas mixtas de detergente y fosfolípidos para formar liposomas.

Dializa esta solución frente a tres cambios de solución salina de tris para eliminar el detergente y formar liposomas. Normalmente trabajamos con volúmenes del orden de un mililitro, utilizando tubos de seis milímetros de diámetro con un punto de corte alrededor de 10 kilodaltons, y tenemos cuidado de excluir cualquier burbuja de aire mientras se sujeta el tubo. Esta solución se filtra estérilmente y se realiza la diálisis en condiciones limpias, manipulándola con guantes esterilizados con etanol al 70%.

Esta solución debe ser completamente transparente y se almacena bajo gas argón para prevenir la oxidación. Si la solución está turbia, entonces ha generado vesículas multilaminares y debe comenzar de nuevo. Con el fin de establecer el experimento, primero necesitamos determinar cuánto ICAM uno y MHC se depositan en un área de superficie determinada de una bicapa con níquel quelatado a una concentración dada de proteína soluble.

Para hacer esto, depositamos bicapas sobre perlas de vidrio de cinco micrómetros de diámetro. Incubamos las perlas de vidrio con soluciones de proteínas en condiciones que se aproximan a las de las celdas de flujo utilizadas para la obtención de imágenes, y luego determinamos la densidad de proteína unida mediante un ensayo inmuno fluorométrico de flujo. Se utilizan anticuerpos marcados con FSI que contienen un número conocido de fluoresceína por molécula para detectar las proteínas unidas a la superficie, y se emplean perlas estándar de fluoresceína para calibrar el microfluorímetro de flujo.

Estableceremos condiciones que se aproximan a las de las células presentadoras de antígenos con 200 moléculas por micrómetro cuadrado de ICAM-1 y de 0,2 a 20 moléculas por micrómetro cuadrado de I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. Las bicapas planas complejas se forman espontáneamente cuando los liposomas se fusionan con el vidrio, pero solo si este se ha limpiado adecuadamente hasta obtener vidrio limpio. Utilizamos solución de piraña ácida, una mezcla recién preparada de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno al 30%, que destruye todo material orgánico y además deja la superficie del vidrio muy hidrofílica.

Al trabajar con piraña, usamos ropa protectora completa, incluyendo un delantal resistente a ácidos y guantes pesados resistentes a ácidos. Los desechos deben separarse cuidadosamente de los desechos orgánicos y desecharse adecuadamente. Para preparar la solución de ácido piraña, agregue 75 mililitros de ácido sulfúrico concentrado a un vaso de precipitados seco y luego añada cuidadosamente 25 mililitros de peróxido de hidrógeno al 30 %.

La solución se calienta rápidamente hasta superar los 100 grados Celsius; luego, sumerja las laminillas secas en la solución durante 15 minutos. Tras esta incubación en piranha, sumerja las laminillas en agua purificada y enjuáguelas durante un minuto por cada lado. A continuación, seque las laminillas utilizando una fuente de vacío para eliminar el agua purificada.

Deje enfriar la solución de piranha y añádala al recipiente de desecho para piranha, que se deja con la tapa suelta y bien etiquetado en la campana extractora para formar las bicapas. Nuestro laboratorio utiliza dos cámaras bi FCS, que tienen la ventaja de contar con calefacción integrada. El sistema FCS dos está montado sobre una base de acero inoxidable que sujeta un manifold microfluídico con una junta superior de 0,5 milímetros, una placa microacueducto recubierta con óxido de indio y estaño para calefacción en una superficie y con una ranura fluídica en el otro lado.

Una junta de 0,25 milímetros libre de polvo que define la altura de la cámara de flujo y la cubreobjetos redonda de 40 milímetros limpiada con piranha, sobre la cual se forma la bicapa, para armar la celda de flujo y formar bicapas planas. Coloque el colector con los tubos orientados hacia arriba sobre una superficie plana. Luego coloque la junta de 0,5 milímetros con orificios posicionados sobre los tubos fluidicos y asegúrese de que quede asentada plana.

Coloque suavemente la placa de microacueducto con los canales fluidicos hacia arriba y asegúrese de que asiente plana sin aplicar ninguna presión hacia abajo hasta verificar que los orificios de la placa coincidan con los tubos microfluídicos. Luego coloque la junta libre de polvo de 0,25 milímetros de espesor con una abertura rectangular encima de la placa de microacueducto, de modo que el canal quede alineado con los canales fluidicos y no haya espacios de aire importantes. Coloque hasta cinco gotas de un microlitro de suspensión de liposomas sobre la superficie de la placa de microacueducto en un patrón tal que la distancia de centro a centro entre cada gota sea de 2,5 milímetros. Las cinco gotas de liposomas pueden tener composiciones diferentes, pero en este caso solo formaremos dos bicapas, una sin lípidos quelantes de níquel y otra con 10% de lípidos quelantes de níquel.

Una vez que estas gotas estén en su lugar, coloque cuidadosamente la laminilla sobre la superficie de un solo movimiento y sujétela a la base lo más rápido posible. Las gotas de liposomas deben hacer contacto con la laminilla. Este contacto no debe interrumpirse, ya que probablemente ya se hayan formado las bicapas y cualquier perturbación podría resultar en bicapas defectuosas.

En este momento, es importante recordar marcar las posiciones de las bicapas con unos pequeños puntos de tinta en la lámina para facilitar la colocación del cubreobjetos en el microscopio. Espere 20 minutos para asegurarse de que el sistema ha alcanzado el equilibrio, y transfiera todas las soluciones utilizando una jeringa de 20 mililitros conectada a unos 20 centímetros de tubo flexible y una llave de paso de tres vías. Luego, otro puerto de la llave de paso se conecta a la celda de flujo mediante un tramo corto de tubo para minimizar el volumen muerto entre la llave de paso y la celda de flujo.

Llene la jeringa con solución salina tamponada con hepes que contenga cloruro de magnesio, cloruro de calcio, glucosa y albúmina sérica humana. Ceba el tubo y la llave de paso para que no haya burbujas de aire. A continuación, conecte esto a las celdas de flujo y pase cinco mililitros de una sola vez, observando para asegurarse de que ninguna burbuja de aire cruce la bicapa.

Ahora tendrá sus bicapas para introducir las proteínas marcadas con hiss en la bicapa. Primero debe bloquearse con casena y cargarse con níquel. Llene una jeringa de un mililitro con la solución de iones de casena y níquel, y conecte esta al puerto lateral sin atrapar burbujas de aire.

Después de inyectar la solución, espere 20 minutos para permitir la saturación completa. Luego, lave la solución de bloqueo con H-B-S-H-S-A procedente de la jeringa de 20 mililitros. A continuación, inyecte 0,5 mililitros de solución de H-B-S-H-S-A que contenga ICAM uno y IEK marcados con polihistidina.

En este experimento, la ICAM uno se marca con SCI cinco. De este modo, las interacciones entre LFA uno e ICAM uno pueden seguirse mediante imágenes del reordenamiento de ICAM uno en la bicapa. Permita 30 minutos para que la proteína se una a la bicapa cargada con níquel mientras la proteína se adhiere a la bicapa. Fije la celda de flujo al microscopio invertido utilizando un inserto personalizado para la platina.

Luego, conecte la electrónica de calentamiento para permitir que el sistema se equilibre a 37 grados Celsius. Utilice las marcas realizadas anteriormente para colocar la celda de flujo de manera que el objetivo se alinee con una de las bicapas y use microscopía de reflexión por interferencia para localizar el plano focal enfocando la imagen de luz reflejada del diafragma de campo. Finalmente, lave las moléculas de ICAM uno no unidas de las celdas de flujo.

Adquiera imágenes de fluorescencia de la bicapa en el canal ICAM uno en los modos turf M y widefield. Esto tiene como objetivo confirmar la unión de ICAM uno a la bicapa recubierta con níquel en comparación con la bicapa sin níquel. Ahora la cámara de flujo está lista para recibir células.

Para esta demostración, utilizaremos células T transgénicas del receptor de células T ND que han sido transducidas con un retrovirus que codifica GFPs P zap 70, lavaremos las células una vez con H-B-S-H-S-A y luego incubaremos las células con un FAB marcado con Alexa 5 68 dirigido al receptor de células T para que podamos rastrear los microagregados del TCR. Después de 15 minutos, diluya las células de uno a diez. Esta dilución reduce suficientemente el anticuerpo H 57 para que no interfiera con la imagen del turf M, pero mantiene la saturación del receptor de células T a medida que el fab inicialmente unido comienza a disociarse, luego inyecte las células en la cámara de flujo.

Imaginamos la sinapsis inmunológica en modo turf M de tres colores. Esto incluye la formación de la interacción LFA-1, ICAM-1, la formación de agrupamientos de TCR y la C smac, y la formación sostenida de microagrupamientos de TCR, que reclutan GFP ZAP-70. Algunos de estos resultados son evidentes durante la adquisición, mientras que otros requerirán un análisis posprocesamiento para ser plenamente apreciados.

Vale, acabamos de mostrarle cómo utilizar bicapas planares soportadas para estudiar la sinapsis inmunológica. Es muy importante, para que funcionen estos experimentos, que los linfocitos T se encuentren en muy buenas condiciones y que la solución salina tamponada con PPS no se utilice para cultivos de linfocitos T a largo plazo. Por lo tanto, debe retirar las células del cultivo, colocarlas en este medio y usarlas rápidamente.

Si descubre que desea realizar experimentos a largo plazo, existen algunas excelentes formulaciones de medios libres de suero que puede sustituir por la solución salina tamponada con hepes. Esto mantendrá las células vivas durante un período mucho más largo si desea realizar puntos finales prolongados, como la producción de citoquinas o la proliferación de los linfocitos T. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.