El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

Hola, soy Mike Dustin del Instituto Geral y de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York. Hoy te llevaré a través del procedimiento de formación de Biolay planar de apoyo para el estudio de la sinapsis inmunológica. Así que comencemos.

Para hacer la bicapa lipídica, preparamos una solución de 20% de níquel, lípidos quelantes y 80% de fosfatidilcolina en las cantidades adecuadas en un tubo de vidrio con uno o dos mililitros de metanol cloroformo. El primer paso es evaporar el solvente bajo una corriente de gas nitrógeno en un baño de agua tibia de 30 a 37 grados Celsius. Esto suele tardar unos 15 minutos.

A continuación, elimine cualquier resto de disolvente a alto vacío utilizando un liofilizador durante 90 minutos. A continuación, disuelva los lípidos en un tampón salino de interés con detergente glucocida octal al 2%N hasta una concentración final de 0,4 milimolar. Esto crea una solución de microcélulas de fosfolípidos detergentes mezclados para formar liposomas.

Esta solución se dializa contra tres cambios de solución salina tris para eliminar el detergente y formar liposomas. Por lo general, trabajamos con volúmenes del orden de un mililitro con tubos de seis milímetros de diámetro con un corte de alrededor de 10 kilodaltons y tenemos cuidado de excluir cualquier burbuja de aire mientras sujetamos el tubo. Filtramos esta solución estéril y realizamos la diálisis en condiciones limpias y la manipulamos con guantes esterilizados con etanol al 70%.

Esta solución debe ser cristalina y se almacena bajo el gas Argonne para evitar la oxidación. Si la solución es turbia, entonces ha generado vesículas de paredes múltiples y necesita comenzar de nuevo. Para llevar a cabo el experimento, primero tenemos que determinar cuánto ICAM one y MHC se depositan en una superficie dada de bicapa quelante de níquel a una concentración dada de proteína soluble.

Para ello, depositamos bicapas en vidrios de cinco micrómetros de diámetro. Incubar las perlas de vidrio con soluciones de proteínas en condiciones que se aproximen a las de las celdas de flujo utilizadas para la obtención de imágenes, y luego leer la densidad de la proteína unida mediante un ensayo inmunofluorescemétrico de flujo. Los anticuerpos marcados con FSI con números conocidos de fluoresceína por molécula se utilizan para detectar las proteínas unidas a la superficie y las perlas estándar de fluoresceína se utilizan para calibrar el microfluorímetro de flujo.

Estableceremos condiciones que se aproximen a las de las células presentadoras de antígenos con 200 moléculas por micrómetro cuadrado de ICAM uno y de 0,2 a 20 moléculas por cuadrado. Micrómetro de I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, las bicapas planas complejas se forman espontáneamente cuando los liposomas se fusionan con el vidrio, pero solo si se limpia adecuadamente para limpiar el vidrio. Utilizamos una solución ácida de piana, una mezcla recién preparada de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno al 30%, que destruye toda la materia orgánica y también deja la superficie del vidrio muy hidrófila.

Cuando trabajamos con pirañas, usamos ropa protectora completa, que incluye un delantal de ácido y guanteletes resistentes a los ácidos pesados. Los residuos deben separarse cuidadosamente de los residuos orgánicos y eliminarse adecuadamente. Para preparar la solución ácida de piraña, agregue 75 mililitros de ácido sulfúrico concentrado a un vaso de precipitados seco y luego agregue con cuidado 25 mililitros de peróxido de hidrógeno al 30%.

La solución se calienta rápidamente a más de 100 grados centígrados, luego sumerja los cubreobjetos secos en la solución durante 15 minutos. Después de esta incubación en piraña, sumerja los cubreobjetos en agua purificada y luego enjuáguelos durante un minuto por cada lado. A continuación, seque los cubreobjetos con una fuente de vacío para drenar el agua purificada.

Deje que la solución de piraña se enfríe y agregue al contenedor de desechos de piraña, que se deja con una tapa suelta, bien marcada en la campana de gases para formar las bicapas. Nuestro laboratorio utiliza dos cámaras bi FCS, que tienen las ventajas de la calefacción integrada. El sistema FCS two se encuentra sobre una base de acero inoxidable que sujeta un colector microfluídico con una junta superior de 0,5 milímetros, un portaobjetos de microacueducto recubierto de óxido de indio y estaño para calentar en una superficie y con una ranura fluídica en el otro lado.

Una junta de 0,25 milímetros libre de polvo que define la altura de la cámara de flujo y el deslizamiento de la cubierta redonda de 40 milímetros limpiada con piraña sobre el que se forma la bicapa para ensamblar la celda de flujo y formar bicapas planas. Coloque el colector con los tubos dirigidos hacia arriba sobre una superficie plana. A continuación, coloque la junta de 0,5 milímetros con orificios colocados sobre los tubos fluídicos y asegúrese de que quede plana.

Coloque suavemente el portaobjetos del microacueducto con los canales fluídicos hacia arriba y asegúrese de que se asiente plano sin aplicar ninguna presión hacia abajo hasta verificar que los orificios del portaobjetos estén alineados con los tubos microfluídicos. A continuación, coloque la junta de 0,25 milímetros libre de polvo con un recorte rectangular en la parte superior del portaobjetos del microacueducto para que el canal esté alineado con los canales fluídicos y no haya espacios de aire importantes, coloque hasta cinco gotas de un microlitro de suspensión de liposomas en la superficie del portaobjetos del microacueducto en un patrón tal que la distancia de centro a centro entre cada gota sea de 2,5 milímetros. Las cinco gotas de liposomas pueden tener diferentes composiciones, pero en este caso solo formaremos dos bicapas, una sin lípidos quelantes de níquel y otra con un 10% de lípidos quelantes de níquel.

Una vez que estas gotas estén en su lugar, coloque con cuidado la cubierta sobre la superficie con un solo movimiento, sujétela a la base lo más rápido posible. Las gotas liposomadas deben entrar en contacto con el cubreobjetos. Este contacto no debe romperse, ya que es probable que las bicapas ya se hayan formado y cualquier interrupción pueda dar lugar a bicapas defectuosas.

En este punto, es importante recordar marcar las posiciones de las bicapas con algunas pequeñas manchas de tinta en el portaobjetos para ayudar a colocar el cubreobjetos en el microscopio. Espere 20 minutos para asegurarse de que el sistema ha equilibrado, transfiera todas las soluciones utilizando una jeringa de 20 mililitros conectada a unos 20 centímetros de tubo flexible y una llave de paso de tres vías. A continuación, se conecta otro puerto de la llave de paso a la celda de flujo mediante un tramo corto de tubería para minimizar el volumen muerto entre la llave de paso y la celda de flujo.

Llene la jeringa con solución salina tamponada que contiene cloruro de magnesio, cloruro de calcio, glucosa y albúmina sérica humana. Prepare el tubo y la llave de paso para que no haya burbujas de aire. Luego conéctelo a las celdas de flujo y empuje cinco mililitros en un solo movimiento mientras observa para asegurarse de que no pasen burbujas de aire sobre la bicapa.

Ahora tendrá sus bicapas para introducir las proteínas marcadas con silbidos en la bicapa. Primero se debe bloquear con casen y cargar con níquel. Llene una jeringa de un mililitro con la solución de iones de níquel casen y conéctela al puerto lateral sin atrapar burbujas de aire.

Después de inyectar la solución, espere 20 minutos para permitir el bloqueo completo. A continuación, lave la solución de bloqueo con H-B-S-H-S-A de la jeringa de 20 mililitros. Ahora inyecte 0,5 mililitros de solución H-B-S-H-S-A que contenga el polihis marcado con ICAM one e IEK.

En este experimento, el ICAM uno está etiquetado con SCI cinco. Por lo tanto, las interacciones de LFA con ICAM uno se pueden seguir mediante imágenes del reordenamiento de ICAM uno en la bicapa, lo que permite 30 minutos para que la proteína se una a la bicapa cargada de níquel mientras la proteína se adhiere a la bicapa. Fije la celda de flujo al microscopio invertido con un inserto de platina personalizado.

A continuación, conecte la electrónica de calefacción para permitir que el sistema se equilibre a 37 grados centígrados. Utilice las marcas hechas anteriormente para colocar la celda de flujo de modo que el objetivo esté alineado con una de las bicapas y use la microscopía de reflexión de interferencia para ubicar el plano focal enfocándose en la imagen de luz reflejada del diafragma de campo. Por último, lave el ICAM no unido de las celdas de flujo.

Adquiera imágenes de fluorescencia de la bicapa en el ICAM de un canal en los modos de césped M y campo amplio. Esto es para confirmar la unión de ICAM uno en la bicapa recubierta de níquel en relación con la bicapa sin níquel. La celda de flujo ahora está lista para recibir celdas.

Para esta demostración, utilizaremos un receptor de células T ND que han sido transducidas con un recubrimiento de retrovirus ENC GFPs P zap 70, lavaremos las células una vez con H-B-S-H-S-A y luego incubaremos las células con una Alexa 5 68 FAB marcada con el receptor de células T para que podamos rastrear los micro grupos de TCR. Después de 15 minutos, diluya las células de uno a 10. Esto diluye el anticuerpo H 57 lo suficiente como para que no interfiera con las imágenes de M del césped, pero mantiene la saturación del receptor de células T a medida que la fábrica inicialmente unida comienza a disociarse, luego los inyecta en la celda de flujo.

Visualizamos la sinapsis inmunológica en el modo M de tres colores. Esto incluye la formación de la interacción LFA uno, ICAM uno, la formación de clústeres TCR y el C smac y la formación sostenida de micro clústeres TCR, que reclutan GFP ZAP 70. Algunos de estos resultados son obvios durante la adquisición, mientras que otros requerirán un análisis de posprocesamiento para apreciarlos por completo.

Bien, acabamos de mostrarle cómo usar bicapas planas compatibles para estudiar la sinapsis inmunológica. Es muy importante para que estos experimentos funcionen que las células T estén en muy buena forma y que la solución salina tamponada PPS no sea muy adecuada para el cultivo de células T a largo plazo. Por lo tanto, hay que sacar las células del cultivo, ponerlas en este medio y luego utilizarlas muy rápidamente.

Si descubres que quieres hacer experimentos a largo plazo, hay algunas formulaciones de medios sin suero muy buenas que puedes sustituir por la solución salina tamponada en piezas. Eso mantendrá las células vivas mucho más tiempo si se desea hacer un punto final más largo, como la producción de citocinas o la proliferación de las células T. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.