Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Matériaux
Tampons
<ol><li>Tampon de lavage : 1 X saline stérile tamponnée de phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium</li>
	<li>Tampon de fixation : 1% de paraformaldehyde en PBS</li>
	<li>Tampon de perméabilisation : 0,1 % Triton X-100 en PBS</li>
	<li>Tampon de blocage : 1% d'albumine de sérum bovin dans PBS</li>
	<li>Milieu de croissance cellulaire : DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), pénicilline/streptomycine, et L-glutamine</li>
</ol>équipement
<ol start="6"><li>Hotte d'écoulement laminaire</li>
	<li>Incubateur humidifié (37oC, 5% CO2)</li>
	<li>Microscope à balayage laser confocal; ici, Nikon Eclipse Ti laser</li>
</ol>Matériaux et réactifs
<ol start="9"><li>Diapositives de culture cellulaire chambrée</li>
	<li>Médias de montage anti-fade avec DAPI (pour les noyaux de coloration)</li>
	<li>Verre de couverture de microscope</li>
	<li>Lingettes de tâche délicates</li>
	<li>Pipettors et conseils</li>
</ol>Réagents spécifiques d'assay
<ol start="14"><li>Cellules adhérentes (cellules primaires ou lignées cellulaires); ici, des fibroblastes de souris transfectés avec CD1d ont été employés (LCD1).</li>
	<li>Anticorps primaires pour détecter les cibles cellulaires; ici, rat anti-souris CD107a (LAMP-1) et souris anti-souris CD1d ont été utilisés.</li>
	<li>Anticorps secondaires conjugués au fluorophore spécifiques aux isotypes d'anticorps primaires; ici anti-rat IgG conjugué à Alexafluor 488 et anti-souris IgG conjugué à Alexafluor 647 ont été utilisés.</li>
</ol>2. Protocole
Préparation à la coloration des anticorps
Cellules d'ensemencement
<ol><li>Resuspendre les cellules d'intérêt dans les médias de croissance.</li>
	<li>Ensuite, ensemencez 500 ll de la suspension cellulaire/par puits dans les puits d'une glissière de chambre à 4 puits. (Ici, les cellules LCD1 ont été ensemiées à 2,5x105 cellules/chambre dans 500 ll de supports de croissance. La densité d'ensemencement peut varier d'une lignée cellulaire à l'autre).</li>
	<li>Incuber la glissière de chambre pendant la nuit dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC, pour permettre aux cellules d'adhérer au verre.</li>
	<li>Le lendemain, aspirez les supports de chaque puits, puis lavez les cellules 1X avec 500 L de PBS.</li>
</ol>fixation
<ol start="5"><li>Pour fixer les cellules, ajouter une solution de paraformaldéhyde de 500 l 1 % dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Après l'incubation, recueillir le paraformaldéhyde dans un contenant de déchets liquides dangereux approprié.</li>
	<li>Ensuite, lavez les cellules 3 fois avec 500 L PBS pour enlever les restes du fixatif.</li>
</ol>Perméabilisation
<ol start="8"><li>Perméabilisez les cellules en couvant avec un tampon/puits de perméabilisation de 500 l l pendant 15 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Ensuite, lavez les cellules brièvement 3 fois avec 500 L de PBS.</li>
</ol>Blocage
<ol start="10"><li>Incuber les cellules dans chaque puits avec un tampon de blocage de 500 l pendant 1 heure à 4 oC, pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps.</li>
</ol>Incubation primaire d'anticorps
<ol start="11"><li>Aspirez le tampon de blocage des chambres de diapositives.</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 500 L de solution d'anticorps primaire diluée aux cellules. (Ici, anti-CD107a (LAMP-1) a été dilué 1:500 et anti-CD1d a été utilisé non dilué (1H6 anticorps monoclonaux a été gentiment fourni par le Dr Randy Brutkiewicz)).</li>
	<li>Incuber les toboggans pendant la nuit à 4oC.</li>
</ol>Remarque : Si vous probez pour plus d'une cible, assurez-vous que les anticorps primaires sont différents isotypes. Les concentrations d'anticorps recommandées varient d'un fabricant à l'autre et doivent être titrées avant d'être utilisées.
Incubation secondaire d'anticorps
<ol start="14"><li>Aspirez la solution d'anticorps primaire des puits.</li>
	<li>Laver les chambres de puits 4 fois avec 500 L PBS.</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 500 L de la solution d'anticorps secondaire diluée à chaque puits. (Ici, les anticorps secondaires- anti-souris IgG Alexafluor 647 et anti-rat IgG Alexafluor 488 ont été dilués 1:2000 dans le tampon de blocage).</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 1 h dans l'obscurité.</li>
	<li>Après l'incubation, aspirez la solution d'anticorps secondaire.</li>
	<li>Laver les chambres 4 fois avec 500 L PBS pour enlever tout anticorps secondaire non lié.</li>
</ol>Remarque : Les concentrations d'anticorps recommandées varient d'un fabricant à l'autre et doivent être titrées avant d'être utilisées. Si l'on cherche plus d'une cible, les anticorps secondaires doivent être conjugués à différents fluorophores avec des spectres d'excitation/émission uniques. Gardez également à l'esprit l'excitation/émission de la contretache nucléaire (c.-à-d. DAPI) tout en sélectionnant les fluorophores. La sélection de fluorophore peut être affectée par la configuration laser du microscope confocal utilisé. La configuration laser de la machine dictera quels fluorophores sont appropriés pour l'expérience.
3. Les couvertures de montage
<ol><li>Tout d'abord, retirez soigneusement les chambres de la glissière.</li>
	<li>Ensuite, maintenez la glissière à l'angle au-dessus d'une lingette délicate de tâche et retirez le fluide des bords sans toucher les cellules.</li>
	<li>Ajouter 1 goutte de milieu de montage antifade, contenant la tache nucléaire DAPI, sur chaque section de cellules.</li>
	<li>Ensuite, placez un bordereau de 20 mm x 60 mm sur la glissière en la tenant sur les bords à l'aide du bout des doigts. (Éviter la formation de bulles sur les cellules, car elles interfèrent avec l'imagerie).</li>
	<li>Essuyez tout support de montage supplémentaire sur les côtés avec une manette délicate et rangez les diapositives dans l'obscurité à température ambiante jusqu'à une semaine.</li>
</ol>4. Imagerie confocale
Échantillons d'image sur un microscope à balayage laser confocal. Pour les données présentées dans la figure 2, le Nikon Eclipse Ti A1R a été utilisé avec le logiciel NIS Elements Advanced Research. La section suivante détaille la procédure de capture d'images à l'aide du logiciel susmentionné.
<ol><li>Pour commencer l'imagerie des cellules, ouvrez le logiciel de recherche avancéeNIS Elementsen cliquant sur l'icônelogicielle NIS.</li>
	<li>Ensuite, sur la fenêtre de contrôle cliquez sur 'TiPad' onglet et choisissez l'objectif souhaité pour l'imagerie. (Ici, le premier objectif 40x a été utilisé).</li>
	<li>Chargez la diapositive avec des cellules sur la scène et centrez-la sous la lentille.</li>
	<li>Maintenant, sur l'onglet 'A1plus Compact GUI',configurez les lasers appropriés pour les fluorophores utilisés. Cliquez sur le symbole de l'engrenage pour ouvrir le menu de teinture et de réglages spectrals et sélectionnez les canaux nécessaires et définir le laser pour chaque canal.</li>
	<li>Ensuite, sélectionnez les émissions appropriées dans le menu déroulant sous le premier miroir dichroïque.</li>
	<li>Ensuite, sous 'A1plus Compact GUI' fenêtre, cliquez sur 'Ch. Series' pour mettre en place la série de canaux de ligne, qui met en place si les lasers utilisés tirera sur l'échantillon simultanément ou séquentiellement. (Ici, les laissez-passer séquentiels ont été choisis, à commencer par le canal 1, suivi par le canal 2, puis 4).</li>
	<li>Après cela, commencez à numériser en cliquant sur l'icône 'Arrow tip'sur le dessus. À ce stade, alors que l'imagerie est en direct, sous 'A1plus Compact GUI' fenêtre, cliquez sur l'échelle coulissante et modifier la taille du sténopé pour assurer la limitation de la lumière de mise au point. (Ici, le réglage le plus bas disponible (0,5), a été utilisé).</li>
	<li>Ensuite, ajustez les paramètres «haute tension» et «offset» sous chaque laser à des niveaux appropriés, en utilisant les échelles coulissantes pour permettre la détection de la coloration spécifique tout en limitant toute coloration de fond potentielle. Si un échantillon de coloration positive est disponible, commencez par l'imagerie de cet échantillon pour chaque canal afin de s'assurer que les réglages laser donnent des rapports signaux/bruit optimaux. Attention : une intensité laser élevée pendant de longues périodes peut provoquer le photoblanchiment.
</li>
	<li>Après avoir défini les valeurs HV et offset optimales pour chaque laser, cliquez sur l'onglet 'ND Acquisition'et sélectionnez ensuite l'icône 'Z'pour configurer les paramètres de la série Z. Ensuite, lors de l'acquisition d'une image en direct de l'échantillon, d'abord définir le fond en trouvant le bas de l'image et en cliquant sur le bouton«bas»puis trouver la position supérieure de l'échantillon et cliquez sur le bouton'haut'. Définir la taille de l'étape soit en tapant spécifiquement la taille d'étape préférée en m pour chaque étape ou en spécifiant le nombre total d'étapes nécessaires.</li>
	<li>Une fois que les paramètres de la série Z ont été réglés, sélectionnez la résolution de taille/pixel désirée de l'image. Pour ce faire, cliquez sur la fenêtre 'A1plus Compact GUI' et sous l'icône 'taille' sélectionnez la résolution désirée. Pour diminuer le bruit de l'image, on peut sélectionner le menu déroulant à côté du symbole'' ' pour faire la moyenne du nombre d'images sélectionnées.</li>
	<li>Maintenant, cliquez sur l'onglet 'Run now' sur le menu 'ND Acquisition' afin de commencer à imagerie de l'échantillon.</li>
	<li>Une fois l'imagerie terminée, enregistrez l'image en cliquant sur 'File', puis 'Save As', qui exportera le fichier d'image avec l'extension'.nd2'. Enfin, répétez le processus pour chacun des autres échantillons.</li>
</ol>

La coloration fluorescente confocale est une procédure relativement simple qui donne lieu à des images de très haute qualité de spécimens qui sont préparés de la même manière que pour la microscopie à fluorescence conventionnelle. En bref, les échantillons sont fixes, perméabilisés, puis bloqués. Les anticorps primaires contre une protéine ou des protéines d'intérêt sont autorisés à se lier, puis des anticorps secondaires conjugués au fluorophore sont utilisés pour visualiser la coloration. La microscopie par fluorescenc...

microscopie confocale à fluorescence : une technique pour localiser les protéines dans les fibroblastes de souris

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 1 Département de microbiologie et d'immunologie, University of Maryland School of Medicine et Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201 2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201
La microscopie par fluorescence confocale est une technique d'imagerie qui permet une résolution optique accrue par rapport à la microscopie d'épifluorescence « à champ large » classique. Les microscopes confocals sont capables d'obtenir une meilleure résolution optique x-y grâce à la « numérisation laser » - généralement un ensemble de miroirs à tension contrôlée (miroirs de galvanomètre ou de « galvo ») qui dirigent l'éclairage laser à chaque pixel du spécimen à la fois. Plus important encore, les microscopes confocals atteignent une résolution z-axiale supérieure en utilisant un sténopé pour enlever la lumière de mise au point provenant d'endroits qui ne sont pas dans le z-plan étant numérisé, permettant ainsi au détecteur de recueillir des données à partir d'un z-plan spécifié. En raison de la haute résolution Z réalisable dans la microscopie confocale, il est possible de recueillir des images à partir d'une série de z-planes (également appelé z-stack) et de construire une image 3D à travers un logiciel.
Avant de discuter du mécanisme d'un microscope confocal, il est important de considérer comment un échantillon interagit avec la lumière. La lumière est composée de photons, des paquets d'énergie électromagnétique. Un photon empiéchant sur un échantillon biologique peut interagir avec les molécules qui composent l'échantillon de l'une des quatre façons : 1) le photon n'interagit pas et passe à travers l'échantillon; 2) le photon est réfléchi/dispersé; 3) le photon est absorbé par une molécule et l'énergie absorbée est libérée sous forme de chaleur par des processus collectivement connus sous le nom de carie non radiative; et 4) le photon est absorbé et l'énergie est alors rapidement réémise en tant que photon secondaire par le processus connu sous le nom de fluorescence. Une molécule dont la structure permet l'émission de fluorescence est appelée fluorophore. La plupart des échantillons biologiques contiennent des fluorophores endogènes négligeables; par conséquent, les fluorophores exogènes doivent être utilisés pour mettre en évidence les caractéristiques d'intérêt dans l'échantillon. Pendant la microscopie de fluorescence, l'échantillon est éclairé avec la lumière de la longueur d'onde appropriée pour l'absorption par le fluorophore. Lors de l'absorption d'un photon, un fluorophore est dit être «excité» et le processus d'absorption est appelé «excitation». Lorsqu'un fluorophore abandonne l'énergie sous la forme d'un photon, le processus est connu sous le nom d'« émission », et le photon émis est appelé fluorescence.
Le faisceau lumineux utilisé pour exciter un fluorophore est focalisé par la lentille objective d'un microscope et converge à un « point focal » où il est focalement focal. Au-delà du point focal, la lumière diverge à nouveau. Les poutres entrantes et sortantes peuvent être visualisées comme une paire de cônes touchant au point focal (voir la figure 1, panneau gauche). Le phénomène de diffraction impose une limite à la façon dont étroitement un faisceau de lumière peut être concentré - le faisceau se concentre réellement à un endroit de taille finie. Deux facteurs déterminent la taille de la tache focale : 1) la longueur d'onde de la lumière, et 2) la capacité de collecte de lumière de la lentille objective, qui se caractérise par son ouverture numérique (NA). Le «spot» focal s'étend non seulement dans le plan x-y, mais aussi dans la direction z, et est en réalité un volume focal. Les dimensions de ce volume focal définissent la résolution maximale réalisable par l'imagerie optique. Bien que le nombre de photons soit le plus grand dans le volume focal, les chemins de lumière conique au-dessus et au-dessous de la mise au point contiennent également une densité plus faible de photons. N'importe quel fluorophore dans le chemin de lumière peut ainsi être excité. Dans la microscopie conventionnelle (à champ large), les émissions des fluorophores au-dessus et au-dessous du plan focal contribuent à la fluorescence hors foyer (un « fond brumeux »), ce qui réduit la résolution et le contraste de l'image, comme le montre la figure 1, le cube rouge représentant l'émission de fluorophore au-dessus du plan focal (étoile rouge) qui a comme conséquence la fluorescence hors-focus (en haut à droite). Ce problème est amélioré dans la microscopie confocale, en raison de l'utilisation d'un trou d'épingle. (figure 2, en bas à droite). Tel que représenté à la figure 3, le trou d'épingle permet aux émissions provenant du point focal d'atteindre le détecteur (à gauche), tout en empêchant la fluorescence hors foyer (à droite) d'atteindre le détecteur, améliorant ainsi à la fois la résolution et le contraste.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> Figure 1. Résolution optique de l'épifluorescence par rapport à la microscopie confocale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Le faisceau lumineux utilisé pour exciter un fluorophore est focalisé par la lentille objective d'un microscope et converge à un volume focal, puis diverge (à gauche). L'étoile rouge représente le plan focal d'un échantillon qui est représenté tandis que le carré rouge représente l'émission de fluorophore au-dessus du plan focal. Lors de la capture d'une image de cet échantillon à l'aide d'un microscope épifluorescent, l'émission du carré rouge flou sera visible et contribuera à un « fond brumeux » (en haut à droite). Les microscopes confocals ont un trou d'épingle qui empêche la détection de la lumière émise à l'extérieur du plan focal, éliminant le « fond brumeux » (en bas à droite).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> Figure 2. Effet de trou d'épingle dans la microscopie confocale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Bien que l'intensité la plus élevée de la lumière d'excitation soit au point focal de la lentille (gauche, ovale rouge), d'autres parties de l'échantillon ne se trouve pas dans le point focal (droite, étoile rouge) obtiendront la lumière et la fluoresce. Afin d'éviter que la lumière émise par ces régions floues n'atteigne le détecteur, un écran muni d'un sténopé est présent devant le détecteur. Seule la lumière dans le foyer (à gauche) émise par le plan focal est capable de traverser le sténopé et d'atteindre le détecteur. La lumière hors foyer (à droite) est bloquée avec le sténopé et n'atteint pas le détecteur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> Figure 3. Principaux composants d'un microscope à balayage laser confocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Par souci de simplicité, la description mécaniste d'un microscope confocal sera limitée à celle du Nikon Eclipse Ti A1R. Bien qu'il puisse y avoir des différences techniques mineures entre les différents microscopes confocal, l'A1R sert bien comme un bon modèle pour décrire la fonction de microscope confocal. Le faisceau lumineux d'excitation, produit par un tableau de lasers à diodes, est reflété par le miroir dichroïque primaire dans l'objectif, qui concentre la lumière sur le spécimen en cours d'image. Le miroir dichroïque primaire réfléchit sélectivement la lumière d'excitation tout en permettant à la lumière à d'autres longueurs d'onde de passer à travers. La lumière rencontre alors les miroirs de balayage qui balaient le faisceau lumineux à travers le spécimen d'une manière x-y, illuminant un seul (x,y) pixel à la fois. La fluorescence émise par les fluorophores au pixel lumineux est recueillie par l'objectif et passe à travers le miroir dichroïque primaire pour atteindre un tableau de tubes photomultiplicateurs (PMT). Les miroirs dichroiques secondaires dirigent la lumière d'émission vers le PMT approprié. La lumière d'excitation dispersée par l'échantillon dans l'objectif est réfléchie par le miroir dichroïque primaire vers le spécimen, et donc empêchée d'entrer dans la détection voie légère et d'atteindre les PMT (voir la figure 3). Cela permet de quantifier la fluorescence relativement faible sans contamination par la lumière dispersée du faisceau lumineux d'excitation, qui est généralement des ordres de grandeur plus intenses que la fluorescence. Parce que le sténopé bloque la lumière de l'extérieur du volume focal, la lumière arrivant au détecteur provient d'un étroit, sélectionné z-plan. Par conséquent, les images peuvent être recueillies à partir d'une série de z-planesadjacents; cette série d'images est souvent appelée « z-stack ». En utilisant le logiciel approprié, une pile zpeut être traitée pour générer une image 3D du spécimen. Un avantage particulier de la microscopie confocale est la capacité de distinguer la localisation subcellulaire de la coloration. Par exemple, la différenciation entre la coloration de membrane de la coloration intracellulaire, qui est très provocante avec la microscopie conventionnelle d'épifluorescence (1, 2, 3).
La préparation de l'échantillon est une facette importante de l'imagerie confocale. Une force des techniques de microscopie optique est la flexibilité d'imager des cellules vivantes ou fixes. Lorsque vous tentez de produire des images 3D, en raison du nombre d'images qui doivent être acquises pour une z-pile, la difficulté de maintenir la santé cellulaire, et le mouvement des cellules vivantes et de leurs organites, l'utilisation de cellules fixes est typique. La procédure pour fixer et tacher des cellules pour la fluorescence confocale est semblable à celle conventionnellement employée dans l'immunofluorescence. Après la culture dans les diapositives de chambre ou sur les couvertures, les cellules sont fixées à l'aide de paraformaldéhyde pour préserver la morphologie cellulaire. La liaison non spécifique d'anticorps est bloquée utilisant l'albumine bovine de sérum, le lait, ou le sérum normal. Afin de maintenir la spécificité des anticorps secondaires, la solution utilisée ne doit pas provenir de la même espèce dans laquelle les anticorps primaires ont été générés. Les cellules sont incubées avec des anticorps primaires qui lient l'antigène d'intérêt. Lors de l'étiquetage de plusieurs cibles cellulaires, les anticorps primaires doivent être dérivés d'une espèce différente. Les anticorps taguant un antigène sont alors liés par des anticorps secondaires fluorophore-conjugués. Les anticorps secondaires conjugués au fluorophore doivent être sélectionnés afin qu'ils soient compatibles avec les longueurs d'onde de l'excitation laser disponibles dans le microscope confocal. Lors de la visualisation de plusieurs antigènes, les spectres d'excitation/émission des fluorophores devraient différer suffisamment pour que leurs signaux puissent être discriminés par l'analyse microscopique. Le spécimen taché est ensuite monté sur une glissière pour l'imagerie. Un support de montage est utilisé pour prévenir le photoblanchiment et la déshydratation des spécimens. Si vous le souhaitez, un support de montage contenant une contre-tache nucléaire (p. ex. DAPI ou Hoechst) peut être utilisé (4).
Dans le protocole suivant, les fibroblastes de souris transfectés pour exprimer cD1d (LCD1) ont été souillés avec des anticorps reconnaissant CD1d et CD107a (LAMP-1). CD1d est un complexe d'histocompatibilité majeur 1 (MHC 1)-comme le récepteur présent sur la surface des cellules présentant d'antigène qui présente des antigènes. LAMP-1 (protéine de membrane associée lysosomal-1) est une protéine transmembranaire principalement présente dans les membranes lysosomal. Pour la présentation appropriée d'antigène, CD1d est trafiqué par le compartiment lysosomal de pH bas, ainsi LAMP-1 est employé comme marqueur du compartiment lysosomal pour ce protocole. En sondant les cellules LCD1 avec anti-CD1d et anti- LAMP-1 qui ont été produites dans différentes espèces, les anticorps secondaires avec des fluorophores uniques peuvent être utilisés pour déterminer la localisation de chaque protéine dans la cellule et si CD1d est présent dans le LAMP-1 positif compartiments lysosomal.

Dans cette expérience, les fibroblastes de souris exprimant le gène de glycoprotéine de surface CD1d ont été fixés, immunostained et imaged sur un microscope confocal. Une image représentative obtenue à l'aide du protocole ci-dessus est indiquée à la figure 4. Dans le panneau supérieur de A, des images monocanaux montrant le motif de coloration de chaque cible individuelle sont présentées. Ces images comprennent une seule section (tranche) de la z-stack capturée. Le panneau droit montre l...

Microscopie confocale à fluorescence : une technique pour localiser les protéines dans les fibroblastes de souris

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

La microscopie confocale à fluorescence est une technique d’imagerie spécialisée permettant de localiser une protéine ou un antigène d’intérêt dans un échantillon de cellule ou de tissu en marquant l’antigène avec un colorant fluorescent conjugué à un anticorps et en détectant le signal fluorescent. Elle offre une résolution spatiale plus élevée que la microscopie à fluorescence à champ large, à l’aide de deux sténopés placés dans les plans focaux de l’objectif, ce qui lui donne le nom de confocale. Il permet aux utilisateurs de visualiser la coloration à un niveau subcellulaire, comme la différenciation entre la coloration membranaire de surface et la coloration intracellulaire. Un microscope confocal suit un principe de base similaire à celui d’un microscope à fluorescence classique. Le faisceau d’une source lumineuse, généralement un laser pour confocal, est réfléchi par un miroir dichroïque et focalisé par une lentille d’objectif sur l’échantillon. Cette lumière excite les fluorophores à émettre une longueur d’onde différente, qui retourne à travers la lentille de l’objectif et le miroir dichroïque jusqu’à une caméra ou un oculaire. L’amélioration de la résolution d’un microscope confocal est principalement due à la présence de deux sténopés, qui sont de très petits trous permettant à la lumière de passer sur les trajets lumineux d’excitation et d’émission. Les sténopés sont stratégiquement placés dans le plan focal de l’objectif. Passons maintenant à un schéma de vue latérale de la disposition du microscope pour examiner le trajet de la lumière. Après être passé à travers le sténopé d’excitation, le faisceau lumineux d’excitation a pour effet de provenir d’un point focal, ce qui permet à la lentille de l’objectif de focaliser ensuite la lumière sur un point de l’échantillon également. Le faisceau d’émission de ce point focal converge au niveau du sténopé d’émission, ce qui lui permet de le traverser. Maintenant, pendant l’excitation, les fluorophores dans le trajet de la lumière, au-dessus et en dessous du point focal, sont également légèrement excités. Alors que la lumière d’émission provenant du point focal passe à travers le sténopé, les émissions des points flous convergent avant ou après le sténopé d’émission, et sont donc bloquées, ce qui réduit la fluorescence de fond. Le cycle excitation-émission-détection doit être répété pour chaque point d’imagerie dans la région d’intérêt, ce qui peut être fait de différentes manières. Par exemple, le confocal à balayage laser utilise des miroirs à balayage galvanométrique, qui dévient la lumière d’excitation sous différents angles. Par conséquent, balayer le faisceau lumineux sur l’échantillon dans le plan XY. Le disque confocal en rotation utilise un disque avec un ensemble de sténopés, qui tourne pour décaler la disposition des sténopés. Cela permet aux utilisateurs d’éclairer plusieurs petits points d’imagerie dans l’échantillon à chaque fois, couvrant progressivement toute la surface au fur et à mesure que le disque tourne. En raison des sténopés, l’image XY au détecteur représente un plan Z étroit. Par conséquent, les images peuvent être collectées à partir d’une série de plans Z consécutifs, souvent appelée pile Z. À partir de ces images, un logiciel approprié peut générer une représentation 3D du motif du signal de fluorescence dans l’échantillon. Dans ce protocole, vous observerez l’immunomarquage de fibroblastes de souris, suivi d’une imagerie au microscope confocal pour visualiser différentiellement une protéine de surface cellulaire et une protéine lysosomale. Pour commencer, à l’aide de techniques stériles, réintroduisez les cellules d’intérêt dans 500 microlitres de milieu de croissance par puits, puis ensemencez-les dans les puits d’une lame de chambre à quatre puits. Ici, nous utilisons des fibroblastes de souris qui ont été transfectés pour exprimer la molécule présentatrice d’antigène, CD1d. Pour permettre aux cellules d’adhérer au verre, placez la lame de chambre dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et incubez pendant la nuit. Le matin, aspirez le milieu de chaque puits, puis lavez une fois les cellules avec 500 microlitres de PBS pendant quelques secondes. Pour fixer les cellules, ajoutez 500 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 1 % dans chaque puits et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après l’incubation, recueillez le paraformaldéhyde dans un contenant approprié pour les déchets liquides dangereux, puis retirez tous les restes du fixateur en lavant les cellules trois fois avec du PBS pendant quelques secondes. Pour permettre aux anticorps de pénétrer dans les cellules, ajoutez 500 microlitres de tampon de perméabilisation dans chaque puits et incubez sur la paillasse pendant 15 minutes à température ambiante. Après la perméabilisation, lavez brièvement les cellules trois fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage dans chaque puits et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques. Préparez les anticorps primaires, anti-CD1d et anti-LAMP-1, à des concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez le tampon des puits et couvrez les cellules de chaque puits avec 500 microlitres de solution d’anticorps primaires diluée, puis incubez la lame sur une surface plane pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, diluez les anticorps secondaires, dans ce cas un anticorps anti-souris et anti-rat avec des marqueurs fluorescents distincts, dans un tampon bloquant aux concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez la solution d’anticorps primaire des puits, puis lavez les cellules quatre fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution d’anticorps secondaire diluée dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité. Après l’incubation, aspirez la solution d’anticorps secondaires et lavez les puits quatre fois avec 500 microlitres de PBS pour éliminer tout anticorps secondaire non lié. Pour monter les échantillons après le lavage final, détachez soigneusement et retirez les chambres de la lame. Pour éliminer le PBS résiduel, tenez la lame en biais au-dessus d’une lingette délicate et retirez le liquide des bords sans toucher les cellules. Une fois l’excès de PBS éliminé, ajoutez une goutte de milieu de montage anti-évasion, contenant le colorant nucléaire DAPI, sur chaque section de cellules. Ensuite, prenez une lamelle de 20 x 60 millimètres et, du bout des doigts, commencez à abaisser lentement la lamelle sur chaque bord, en prenant soin d’éviter la formation de bulles sur les cellules. Essuyez tout support de montage supplémentaire sur les diapositives à l’aide d’une lingette délicate et conservez les diapositives dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à une semaine. Pour commencer à imager les cellules, cliquez d’abord sur l’icône du logiciel NIS sur le bureau. Une fois dans la fenêtre de contrôle, cliquez sur l’onglet TiPad en haut et choisissez l’objectif souhaité pour l’imagerie. Ensuite, chargez la diapositive avec des cellules sur la platine et centrez-la sous l’objectif. Ensuite, dans l’onglet A1plus Compact GUI à côté de l’onglet TiPad, configurez les lasers appropriés pour les fluorophores utilisés. Cliquez sur le symbole de l’engrenage pour ouvrir le menu des paramètres de colorant et spectral. Une fois le menu des paramètres de colorant et spectral ouvert, sélectionnez les canaux nécessaires et réglez le laser pour chaque canal. Ensuite, sélectionnez les émissions appropriées dans le menu déroulant sous le premier miroir dichroïque. Ensuite, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur Ch.Series pour configurer la série de canaux de ligne, qui définit si les lasers utilisés se déclencheront sur l’échantillon simultanément ou séquentiellement. Après cela, commencez la numérisation en cliquant sur l’icône en forme de flèche en haut. À ce stade, pendant que l’imagerie est en direct, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur l’échelle mobile et modifiez la taille du sténopé pour limiter la lumière floue. Ensuite, ajustez les paramètres de haute tension et de décalage sous chaque laser à des niveaux appropriés en utilisant les échelles coulissantes pour permettre la détection de la coloration spécifique tout en limitant toute coloration de fond potentielle. Si un échantillon de coloration positif est disponible, commencez par imager cet échantillon pour chaque canal afin de vous assurer que les paramètres laser produisent des rapports signal/bruit optimaux. Après avoir défini les valeurs HV et de décalage optimales pour chaque laser, cliquez sur l’onglet Acquisition ND, puis sélectionnez l’icône Z pour configurer les paramètres de la série z. Ensuite, lors de l’acquisition d’une image en direct de l’échantillon, définissez d’abord le bas en trouvant le bas de l’image et en cliquant sur le bouton du bas. Ensuite, trouvez la position supérieure de l’échantillon et cliquez sur le bouton supérieur. Définissez la taille du pas en tapant spécifiquement la taille de pas préférée en microns pour chaque pas ou en spécifiant le nombre total de pas nécessaires. Pour sélectionner la taille/résolution en pixels souhaitée de l’image, cliquez sur la fenêtre Aiplus Compact GUI, et sous l’icône de taille, sélectionnez la résolution souhaitée. Pour réduire le bruit de l’image, vous pouvez sélectionner le menu déroulant à côté du symbole thêta pour faire la moyenne du nombre d’images sélectionné. Après cela, cliquez sur l’onglet Exécuter maintenant dans le menu Acquisition ND afin de commencer à imager l’échantillon. Une fois l’imagerie terminée, enregistrez l’image en cliquant sur Fichier, puis sur Enregistrer sous, ce qui exportera le fichier image avec l’extension dot-nd2. Enfin, répétez le processus pour chacun des autres échantillons. Dans cette expérience, des fibroblastes de souris exprimant le gène de la glycoprotéine de surface CD1d ont été fixés, immunocolorés et imagés au microscope confocal. Cette image montre une seule section d’une pile Z à un grossissement de 40X, où CD1d est coloré en rouge. L’échantillon a été co-coloré avec LAMP-1, un marqueur lysosomal, en vert. La coloration nucléaire DAPI a été utilisée pour montrer les noyaux des cellules. Dans une image composite où les trois canaux différents sont fusionnés, l’apparition du jaune résulte du chevauchement des canaux rouge et vert, et indique une zone où CD1d et LAMP-1 sont co-localisés dans les lysosomes. Les zones où une seule couleur est présente indiquent la présence de CD1d ou LAMP-1 sans co-localisation. Cette image montre un rendu 3D des cellules construites à partir d’images capturées dans la pile z et cette méthode a permis de construire une vue latérale de ce groupe de cellules. L’image suivante montre une coupe de l’empilement z à un grossissement de 100X, démontrant les modèles d’expression de ces deux protéines plus en détail. La boîte rose sur le côté droit de l’image affiche la coupe transversale de la coordonnée x désignée par la ligne rose dans l’image, qui représente la vue latérale au niveau de la ligne rose. De même, la boîte bleue au bas de l’image montre la section transversale de la coordonnée y désignée par la ligne bleue dans l’image, qui représente la vue de face au niveau de la ligne bleue. Le rendu 3D de l’image z-stack permet aux utilisateurs de visualiser l’image en 3D, en visualisant tous les plans x, y et z. Cela peut être utilisé pour étudier la co-localisation des différentes taches dans différentes régions de la cellule.

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confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

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Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Cette collection couvre de nombreuses techniques de base utilisées en laboratoire d'immunologie, notamment le marquage et le tri des cellules immunitaires. Elle présente également des techniques d'isolation de cellules immunitaires et de production d'anticorps, ainsi que des tests courants d'activité immunitaire comme le test ELISA. Enfin, elle présente la coloration et l'imagerie d'échantillons tissulaires et cellulaires.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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