Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

Aperçu de la procédure
Le typique 51Cr-release pour mesurer la mort cellulaire implique les étapes suivantes:
<ol><li>Tout d'abord, les cellules cibles sont étiquetées avec Na2[51Cr]O4. Cela les distingue des cellules effectrices dans l'assay.</li>
	<li>Pendant que les cellules cibles sont étiquetées, les cellules effectrices sont collectées et, en utilisant la technique de dilution en série, une titration décroissante des cellules effectrices est générée dans une plaque d'essais de 96 puits en bas rond.</li>
	<li>À la fin de l'étiquetage des cellules cibles, les cellules sont d'abord lavées, puis un nombre fixe de cellules sont ajoutés à la plaque d'assay qui contient déjà une série de dilutions de cellules effectrices.</li>
	<li>Ensuite, le mélange de cellules cibles-effecteurs est incubé pendant une période de temps définie afin de permettre une interaction cellulaire suffisante avec les cellules cibles, afin de médiatiser la lyse cellulaire.</li>
	<li>Enfin, les supernatants de culture sont récoltés et récoltés dans des tubes. La quantité de 51Cr est quantitée à l'aide d'un compteur gamma.</li>
	<li>À la fin, les données sont recueillies et utilisées pour calculer la « lyse cellulaire spécifique au pourcentage » des cellules cibles.</li>
</ol>1. Étiquetage des cellules cibles avec 51Cr
<ol><li>Pour commencer, préparer les cellules cibles, (ici- ligne cellulaire du mélanome humain WM793), dans une suspension de cellule unique.</li>
	<li>Pour ce faire, d'abord retirer les médias de la flacon de culture tissulaire.</li>
	<li>Ensuite, lavez les cellules avec 5 ml de 1X PBS.</li>
	<li>Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine à la plaque pendant 2 min.</li>
	<li>Appuyez doucement sur le flacon pour desserrer les cellules de la surface du flacon.</li>
	<li>Ajouter 5 ml de milieu RPMI au flacon et pipet le milieu de haut en bas pour détacher les cellules.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min. Decant le supernatant.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de support à la pastille et légèrement pipet le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension.</li>
	<li>Déterminer la concentration cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre.</li>
	<li>Transférer 1x106 cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugelant la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min et décant le supernatant.</li>
	<li>Vortex brièvement le tube pour resuspendre la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.</li>
	<li>Ajouter 100 'Ci de 51Cr directement à la suspension de la cellule cible WM793. Note: Il devrait y avoir un espace de laboratoire dédié mis en place pour la radioactivité particulière. En outre, il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage et une utilisation sécuritaires du 51Cr pendant toutes les étapes ainsi qu'une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons avec 51Cr sont conservés. Un compteur Geiger équipé d'une sonde à crêpes est également nécessaire, pour l'arpentage de l'espace pour une contamination possible.
</li>
	<li>Ajouter un petit morceau de ruban radioactif au tube pour indiquer que le tube est maintenant radioactif.</li>
	<li>Placez le tube dans un incubateur à 37 oC avec un bouclier de plomb et incubez pendant 1 h. Faites glisser le tube toutes les 15-20 minutes pour augmenter l'apport cellulaire cible du chrome.</li>
	<li>Après la période d'incubation, laver les cellules cibles avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès de 51Cr.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min. Décant radioactif FBS laver dans un conteneur de déchets approprié.</li>
	<li>Resuspendre la pastille et laver une deuxième fois avec FBS. Vérifiez la radioactivité incorporée à l'aide d'un compteur Geiger.</li>
	<li>Resuspendre la pastille dans un milieu complet de 10 ml, ce qui lui a procuré une concentration cellulaire de 105 cellules/ml. Note: L'étape de comptage cellulaire après l'étiquetage 51Cr est omise ici en grande partie pour des raisons de sécurité. On peut supposer que la concentration de cellules WM793 est la même qu'avant l'étiquetage 51Cr.
</li>
</ol>2. Préparation des cellules effectrices
<ol><li>Une variété de cellules effectrices peuvent être utilisées, telles que les lymphocytes T humains ou de souris et les cellules NK. Dans cet exemple, des PBMC, isolés du sang entier par centrifugation standard de gradient de densité (à une concentration de 5x106),ont été utilisés.</li>
	<li>Pour commencer, ajoutez 100 l de milieu de culture tissulaire à chaque puits de l'une des rangées (ici rangée A, Voir tableau 1) d'une plaque à fond rond de 96 puits. Ici, aucune cellule effectrice n'est ajoutée, et elles serviront de « blanc » pour déterminer la « libération minimale/spontanée de 51Cr » des cellules cibles.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> Tableau 1 : 51Cr release assay layout: Row A- Target cells (104 cells/ 100 'L) incubated with media only (generates 'blank' for determining the "minimum/spontaneous 51Cr release"). Lignes B à C- puits contenant différents effecteurs : ratios de cellules cibles (E:T), allant de 50:1 à 1,5:1. Ligne H- cellules cibles (104 cellules/100 l) incubées avec 1% NP-40 (NP-40 lyses les cellules cibles, générant "maximum ou total 51Cr libération"). Chaque rapport E:T est testé en triplicate pour chaque condition expérimentale. Colonne 1-3- PBMC non stimulés et colonne 4-6- CPG-stimulé PBMCs.
<ol start="3"><li>Ensuite, générer une dilution des cellules sérielles 2X des PBMC (en triple pour chaque condition expérimentale), pour obtenir une concentration de cellules effectrices allant de 5x105 à 15 625 cellules/100 L de médias (ici les lignes B à G). Note: Dans cet exemple, l'effecteur de départ : le ratio de cellule cible (E : T) est de 50:1. Toutefois, ce ratio peut être ajusté en fonction des spécificités expérimentales.
</li>
	<li>Laissez la dernière rangée vide (ici la rangée H) en n'ajoutant aucune cellule effectrice à ces puits. (Cette ligne sera utilisée pour générer le « nombre total de comptes/min, ou (c. p. m) » ou le « communiqué maximum 51Cr »).</li>
	<li>Placez la plaque dans un incubateur à 37 oC jusqu'à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.</li>
</ol>3. Ajout de 51cellules cibles WM793 étiquetées Cr à l'Assay
<ol><li>Après la période d'incubation, retirer les cellules cibles de l'incubateur et laver avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès de 51Cr.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min, à l'aide d'une centrifugeuse désignée.</li>
	<li>Retirez le lavage FBS (supernatant radioactif) dans un contenant de déchets approprié.</li>
	<li>Répétez l'étape de lavage en rependant la pastille dans un frais de 5 ml de FBS.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à nouveau à 1200 tr/min pendant 5 min.</li>
	<li>Enfin, resuspendre la pastille en 10 ml de milieu complet.</li>
	<li>Verser la suspension cellulaire WM793 51étiquetée Cr (105 cellules/mL) dans un réservoir de réactif jetable.</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 100 L de ces cellules cibles étiquetées, à chaque puits de la plaque de cellules effectrice s'il y a 96 puits, à l'aide d'une pipette multicanal.</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 100 OL de 1 % De NP-40 (dans l'eau) à la rangée de puits dépourvus de toute cellule effectrice (ici rangée H). 1% NP-40 lysera les cellules cibles, et donc ces puits serviront de contrôles pour déterminer le "nombre total / min, ou (c. p. m)" ou le maximum 51Cr libération.</li>
	<li>Fixez le couvercle à la plaque en ajoutant un petit morceau de ruban perméable au gaz de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu'il contient 51Cr.</li>
	<li>En bref, centrifuger la plaque à 1200 tr/min. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajouter une plaque d'équilibre à la centrifugeuse. Note: Il est important d'utiliser une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs.
</li>
	<li>Retirer la plaque de la centrifugeuse.</li>
	<li>Placer la plaque dans un incubateur à 37 oC avec un petit morceau de plomb protégeant la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 h pour permettre la lyse cellulaire cible. Note: La période d'incubation peut varier de 4 à 18 h selon les cellules effectrices utilisées et le mécanisme potentiel de mise à mort utilisé.
</li>
</ol>4. Récolte des Supernatants
<ol><li>À la fin de la période d'incubation, retirer soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirer le couvercle.</li>
	<li>Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque, en veillant à confirmer que les petits disques de filtre sont en place pour chacun des bouchons de coton. Cela assurera la collecte d'un supernatant sans cellules.</li>
	<li>Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits.</li>
	<li>Après environ 10 secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des lanières de tube.</li>
	<li>Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire.</li>
	<li>Enfin, chargez les tubes FACS sur le compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de 51Cr libérées dans chaque condition. Les échantillons sont généralement mesurés pendant 1 minute, ce qui permet une détermination facile des « comptes/minute ».</li>
	<li>Enregistrez soigneusement l'ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.</li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux trois premières colonnes, et des PBMC stimulés par le CpG (CpG ODN, (1 g/mL) pendant 24 h) ont été ajoutés aux colonnes 4-6. Voir tableau 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>un</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>gr</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H (en)</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ⅰ</td>
			<td colspan="2">Moyenne de A1,A2,A3 -gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>Spontané c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">Moyenne de B1,B2,B3 -gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K</td>
			<td colspan="2">Moyenne de C1,C2,C3 -Gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>l</td>
			<td colspan="2">Moyenne de D1,D2,D3 -Gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>m</td>
			<td colspan="2">Moyenne de E1,E2,E3 -Gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>n</td>
			<td colspan="2">Moyenne de F1,F2,F3 -Gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ô</td>
			<td colspan="2">Moyenne de G1,G2,G3 -gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>page</td>
			<td colspan="2">Moyenne de H1,H2,H3 -Gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>Maximum c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBMC Unstim</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CPG-stim PBMC</td>
			<td>Ratio E:T</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : 51données d'analyse de sortie Cr : Valeurs de données 'comptes par minute' / 'c. p. m', valeurs moyennes c. p. m, et valeurs de lyse spécifiques pour cent calculées.
<ol start="2"><li>Les données recueillies (comptes par minute, c.-à-d. c.p.m) ont été saisies dans les cellules d'une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d'origine.</li>
	<li>Tout d'abord, les moyennes des tripliciats ont été calculées. Tableau 2 - cellules I3 à P3, pour les PBMC non stimulés et les cellules I6 à P6, pour les PBMC stimulés par le CpG.</li>
	<li>Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition a été calculé à l'aide de la formule suivante- <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>Le pourcentage de lyse spécifique a été calculé pour chaque condition (tableau 2 - cellules J4 à O4, pour les PBMC non stimulés et J7 à O7, pour les PBMC non stimulés).</li>
</ol>

Le spoque décrit ici a une flexibilité considérable, comme une variété de cellules effectrices et cibles peuvent être utilisés en fonction de la question posée. Par exemple, la spécificité des cellules effectrices peut être déterminée en utilisant différentes cellules cibles ou le mécanisme de l'abattage des cellules effectrices peut être déterminé en utilisant des cellules déficientes en protéines spécifiques ou en utilisant des inhibiteurs spécifiques des protéines. Un problème majeur avec l'assay de libération de...

test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

Source : Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, et Thomas S. Griffith1,2,3,4 1 Microbiologie, immunologie et programme d'études supérieures en biologie du cancer, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455 2 Center for Immunology, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455 3 Département d'urologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455 4 Centre du cancer maçonnique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Une des principales fonctions des cellules du système immunitaire est d'enlever les cellules cibles qui ont été infectées par des virus ou ont subi une transformation en une cellule tumorale. Les tests in vitro pour mesurer la capacité cytotoxique des cellules immunitaires sont un aliment de base dans les laboratoires depuis de nombreuses années. Ces essais ont été utilisés pour déterminer la capacité des lymphocytes T, des cellules NK, ou de toute autre cellule immunitaire à tuer les cellules cibles d'une manière spécifique à l'antigène ou non spécifique. Les ligands de la mort (p. ex. Fas ligand ou TRAIL), les cytokines (p. ex. IFNg ou TNF) ou les granules cytotoxiques (p. ex., perforine/granzyme B) exprimés par les cellules effectrices sont quelques façons d'intenter l'induit de la mort cellulaire cible. Avec l'explosion de la recherche d'immunothérapie de tumeur ces dernières années, il y a l'intérêt croissant dans trouver des agents pour augmenter l'activité cytotoxique des cellules immunitaires pour améliorer des résultats patients. Inversement, certaines maladies sont marquées par l'activité surexubérante de l'activité cytotoxique des cellules immunitaires, ce qui entraîne des efforts pour identifier les agents pour tempérer ces réponses. Ainsi, avoir un test dans lequel l'utilisateur peut facilement intégrer un certain nombre de cellules effectrices différentes, cellules cibles, et / ou modificateurs de réponse dans la conception expérimentale peut servir de moyen précieux d'évaluer rapidement la capacité cytotoxique des cellules effectrices et / ou la réactivité de la cellule cible.
Ces essais in vitro impliquent le mélange de différentes populations cellulaires, ainsi que l'utilisation d'un nombre relativement faible de cellules effectrices et cibles. Ainsi, l'une des nécessités de l'analyse est d'étiqueter les cellules cibles d'une manière qui peut facilement être détectée et quantit, permettant à l'utilisateur de déterminer ensuite la « lyse spécifique pour cent » médiée par les cellules effectrices. La radioactivité - en particulier, le chrome 51 (51Cr) sous la forme de Na251CrO4- est un moyen peu coûteux d'étiqueter rapidement et non spécifiquement les protéines cellulaires dans les cellules cibles (1). L'étiquetage court et les temps d'assiduité total réduisent le risque de changements significatifs dans le nombre et/ou le phénotype des cellules cibles, ce qui pourrait influencer le résultat de l'effort. Lors de la perte de l'intégrité de la membrane des cellules cibles en raison de l'activité cytotoxique des cellules effectrices, les 51protéines cellulaires étiquetées Cr dans les cellules cibles sont libérées dans le supernatant de culture, devenant disponibles pour Quantification. Comme avec tout analyse examinant la fonction des cellules immunitaires in vitro,il ya un certain nombre de considérations importantes à envisager d'améliorer la performance de l'expérience. Une des caractéristiques les plus critiques est d'utiliser l'effecteur sain (pour l'activité cytotoxique maximale) et la cible (pour la réactivité maximale et la mort spontanée minimale /51Cr libération) cellules. Le contact entre l'effet et les cellules cibles est nécessaire (ce qui conduit à l'utilisation courante de plaques rondes de 96 puits pour encourager le contact cellule-cellule) (2). Enfin, l'analyse des données dépend de l'inclusion de populations de cellules cibles de contrôle positives et négatives.
Le protocole suivant exposera les étapes pour effectuer un jeu standard de libération de 51Cr pour mesurer la capacité cytotoxique d'une population de cellules effectrices, bien qu'une version non radioactive utilisant europium ait été récemment développée. 51 Annonces Cr est un puissant émetteur de rayonnement. Par conséquent, l'utilisation de cet analyse nécessite une formation appropriée en matière de sécurité des rayonnements, un espace de laboratoire dédié, un compteur gamma et l'élimination d'échantillons radioactifs.
La séquence générale des événements dans cet état d'œil est la suivante : 1) préparer 51cibles étiquetées Cr; 2) préparer les cellules effectrices et les ajouter à la plaque pendant que les cellules cibles sont étiquetées; 3) ajouter des cibles étiquetées à la plaque; 4) plaque incubée; 5) les supernatants de récolte ; et 6) analyser les données après l'exécution d'échantillons sur le comptoir. Les échantillons sont généralement préparés en triple, puis en moyenne pour tenir compte de toute différence subtile de pipetage.
Un EPI approprié est important pour cet avertissement. Plus précisément, l'utilisateur doit porter une blouse de laboratoire et des gants. Des lunettes de sécurité peuvent être requises en fonction du laboratoire ou de l'établissement. Il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage sûr et l'utilisation de la 51Cr pendant toutes les étapes. Enfin, il devrait y avoir un espace de laboratoire et de l'équipement dédiés réservés à l'utilisation de 51Cr, y compris toutes les signalisations appropriées pour indiquer où les échantillons avec 51Cr sont conservés et un compteur Geiger équipé d'une sonde gamma pour étudier l'espace pour possible contamination.
Dans cet exercice de laboratoire, nous déterminerons la capacité des cellules mononucléaires périphériques humaines de sang (PBMCs), (CpG stimulées contre non stimulées) pour tuer des cellules de mélanome, utilisant la ligne humaine de cellules de mélanome WM793 comme modèle et l'essai de libération de chrome.

Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées par le CpG (figure 1, cercles noirs)ont tué les cellules cibles plus efficacement, à mesure que le rapport entre les cellules effectrices et les cellules cibles augmentait. Cette augmentation n'a pas été observée dans les PBMC non stimulés(cercles blancs),ce qui indique que la stimulation du CpG est nécessaire pour l'augmentation observée de la lyse cellulaire cible.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

Test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Dans cette vidéo, vous allez voir comment effectuer le test de libération de chrome et déterminer le potentiel cytotoxique des cellules effectrices. Les cellules immunitaires sont responsables de l’identification et de l’élimination des cellules potentiellement nocives, comme le cancer ou les cellules infectées par un virus, du corps, qui font partie intégrante de la réponse immunitaire. Plusieurs cellules immunitaires, comme les cellules T et les cellules NK, possèdent une propriété connue sous le nom de potentiel cytotoxique, qui est la capacité d’identifier les cellules cibles et de sécréter des protéines qui induisent la dégradation, la lyse et la mort des protéines de ces cellules cibles. La quantification du potentiel cytotoxique est essentielle pour mesurer l’activation et la puissance des cellules immunitaires, et le test de libération de chrome est couramment utilisé à cette fin. Cette méthode permet aux utilisateurs de comparer la cytotoxicité induite par des types spécifiques de cellules immunitaires dans différentes conditions, ce qui est précieux pour l’étude de l’immunothérapie du cancer et des maladies liées à l’immunité. Pour commencer, les cellules cibles, comme les cellules cancéreuses, sont incubées avec un isotope radioactif, le chrome 51, qui est absorbé par les cellules. Ensuite, ces cellules radiomarquées sont co-cultivées avec les cellules immunitaires isolées d’intérêt, également appelées cellules effectrices, dans une plaque à fond rond à 96 puits pour faciliter l’interaction entre les deux types de cellules. La configuration globale du test implique l’incubation d’un nombre spécifique de cellules cibles avec différentes concentrations de cellules immunitaires, ainsi que des contrôles appropriés. La co-culture permet aux cellules effectrices d’induire l’apoptose et la lyse dans les cellules cibles, ce qui entraîne la libération du chrome 51 intracellulaire dans le surnageant. Ensuite, à un moment pré-optimisé, le surnageant contenant le chrome libéré est récolté dans tous les puits. Le chrome 51, étant radioactif, subit spontanément une désintégration radioactive pour émettre un rayonnement gamma. Les niveaux de rayonnement gamma dans les surnageants de tous les puits de la plaque d’essai représentent un résultat quantifiable de la lyse des cellules cibles. Celui-ci est mesuré à l’aide d’un compteur gamma, qui est ensuite utilisé pour déterminer le potentiel cytotoxique des cellules immunitaires. Pour commencer, les cellules cibles, la lignée cellulaire de mélanome humain WM793 dans cet exemple, sont préparées dans une suspension unicellulaire. Pour ce faire, retirez d’abord le milieu du flacon de culture tissulaire et lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS. Décanter le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine dans la plaque pendant environ deux minutes. Tapotez doucement le ballon pour détacher les cellules de la surface du ballon, puis ajoutez cinq millilitres de média RPMI dans le ballon. Pipetez le média de haut en bas pour recueillir les cellules et ajoutez cette suspension dans un tube conique de 15 millilitres. Placez le tube dans la centrifugeuse pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Ensuite, retirez le média du tube en veillant à ne pas perturber la pastille de cellule. Effleurez doucement le bas du tube pour perturber la pastille cellulaire et ajoutez 10 millilitres de média dans le tube. Ensuite, pipetez doucement le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension. Ensuite, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et transférez deux millilitres de la suspension cellulaire d’origine dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Placez le tube dans une centrifugeuse et granulez les cellules à 12 cents tr/min pendant cinq minutes. Après la centrifugation, versez l’excédent de fluide hors du tube dans un conteneur à déchets. Vortex brièvement le tube pour remettre en suspension la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière. Ensuite, préparez-vous à utiliser le chrome 51 en vous déplaçant vers un espace de laboratoire dédié à cette radioactivité particulière. Il doit y avoir un blindage en plomb suffisant pour le stockage et l’utilisation en toute sécurité du chrome 51 pendant toutes les étapes, ainsi qu’une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons contenant du chrome 51 sont conservés. Un compteur Geiger équipé d’une sonde à crêpes est également nécessaire pour servir dans l’espace pour une éventuelle contamination. Une fois configuré pour l’utilisation correcte de la radioactivité, ajoutez 100 microcuries de chrome 51 directement dans la suspension de cellules cibles. Ensuite, ajoutez un petit morceau de ruban radioactif dans le tube pour indiquer que l’échantillon et le tube sont maintenant radioactifs. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un bouclier en plomb et incubez pendant une heure, en retournant le tube toutes les 15 à 20 minutes. Pendant que les cellules cibles sont marquées, préparez une suspension cellulaire unique de cellules effectrices. Dans cet exemple, les cellules mononucléées du sang périphérique humain, ou PDMC, ont été isolées du sang total par centrifugation à gradient de densité standard à une concentration de 5 fois 10 puissance 6. Transférez cette suspension de cellule effectrice dans un réservoir de réactif jetable, puis ajoutez 200 microlitres de cette suspension dans chaque puits de la rangée B dans une plaque à fond rond de 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de RPMI dans chaque puits des rangées C à G de la plaque. Maintenant, commencez à effectuer des dilutions en série des PBMC pour avoir une gamme de nombres de cellules effectrices en retirant d’abord 100 microlitres de cellules dans les puits de la rangée B et en l’ajoutant à la ligne C. Ensuite, diluez davantage les cellules effectrices en transférant 100 microlitres de cellules de la rangée C à la rangée D. Continuez la dilution en série. Une fois la rangée G atteinte, déplacez 100 microlitres des puits pour laisser un volume final de 100 microlitres dans chaque puits de cette rangée. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture tissulaire dans les puits de la rangée A pour servir de contrôle contre la libération spontanée de chrome 51 à partir des cellules cibles, car aucune cellule effectrice ne doit être ajoutée à cette rangée. Ensuite, placez une plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées. Après la période d’incubation, retirez les cellules cibles de l’incubateur et lavez-les avec 5 millilitres de FBS pour éliminer tout excès de chrome 51. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse désignée et tournez à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le lavage radioactif FBS dans un conteneur à déchets approprié et répétez l’étape de lavage en remettant la pastille en suspension dans 5 millilitres de FBS frais. Placez le tube dans une centrifugeuse désignée et faites tourner à nouveau les cellules à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le deuxième lavage et vérifiez que la pastille n’est pas contaminée à l’aide d’un compteur Geiger. Enfin, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu complet et versez la suspension de cellules cibles marquée au chrome 51 dans un réservoir de réactif jetable. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de ces cellules cibles marquées à chaque puits de la plaque cellulaire effectrice à 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de NP-40 à 1 % dans l’eau dans les puits de la rangée H pour lyser toutes les cellules cibles de chaque rangée. Ces puits seront utilisés comme contrôle pour déterminer le nombre total de comptages par minute, ou cpm. Maintenant que la plaque est prête, fixez le couvercle en ajoutant un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu’il contient du chrome 51. Ensuite, placez la plaque dans une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajoutez une plaque d’équilibrage à la centrifugeuse. Réglez la centrifugeuse à 1200 tr/min et mettez la plaque à la vitesse. Une fois à la vitesse, arrêtez la machine. Retirez la plaque de la centrifugeuse. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un petit morceau de blindage en plomb sur la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 heures pour permettre aux cellules cibles de lyser. À la fin de la période d’incubation, retirez soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirez le couvercle. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque en vous assurant de confirmer que les petits disques filtrants sont en place pour chacun des bouchons de coton. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits. Après une dizaine de secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des bandes de tube. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire. Enfin, chargez les tubes FACS sur un compteur gamma et analysez les échantillons pour quantifier la quantité de chrome 51 libérée dans chaque condition. Notez soigneusement l’ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le compteur. Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux 3 premières voies et des PMBC stimulés par des CPG ont été ajoutés aux voies 4 à 6. Dans cet exemple, les comptages par minute ont été saisis dans les cellules d’une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d’origine et que les moyennes des triplets ont été calculées. Par exemple, pour la première condition, la moyenne des cellules A1, A2 et A3 a été calculée dans la cellule I3. Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition peut être calculé à l’aide de cette formule. Par exemple, pour calculer le pourcentage de lyse spécifique pour les cellules non stimulées qui avaient un rapport de 50 à 1 cellules effectrices par rapport aux cellules cibles, le CPM spontané, qui dans cet exemple, est 1164,67, a été soustrait du CPM expérimental, 1129. 67. Ce nombre peut ensuite être divisé par la différence entre le CPM maximum et le CPM spontané, puis multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage de lyse spécifique. Celle-ci est ensuite calculée pour chaque condition. Ces données peuvent ensuite être représentées graphiquement pour montrer la comparaison du rapport E/T avec le pourcentage de lyse spécifique pour les PBMC non stimulés et les PBMC stimulés par CPG. Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées avec CPG ont tué plus efficacement les cellules cibles à mesure que le rapport entre les cellules effectrices et les cellules cibles augmentait. Cette augmentation n’a pas été observée dans les PBMC non stimulés, ce qui indique que la stimulation CPG est nécessaire pour l’augmentation observée de la lyse des cellules cibles.

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chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

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Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Cette collection couvre de nombreuses techniques de base utilisées en laboratoire d'immunologie, notamment le marquage et le tri des cellules immunitaires. Elle présente également des techniques d'isolation de cellules immunitaires et de production d'anticorps, ainsi que des tests courants d'activité immunitaire comme le test ELISA. Enfin, elle présente la coloration et l'imagerie d'échantillons tissulaires et cellulaires.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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