Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.
Abstract
Influenza A viral genomun viral ribonulceoprotein parçacıklar (vRNPs) içine İnfluenza A nükleoprotein (NP) birden fazla kopyası ile ayrı ayrı paketlenmiş sekiz negatif anlamda, tek sarmallı RNA molekülleri oluşur. Influenza vRNPs viral zarf içine. Hücreye girişi sırasında konak nükleer taşıma makine erişmek, ancak, bu vRNP kompleksleri, sitoplazma içine salınır. , Grip vRNPs ve grip genomunun çoğaltma nükleer ithalat incelemek üzere, bu virüsün diğer bileşenler bu süreçlerin karışmaz böylece izole vRNPs çalışmak için yararlıdır. Burada, influenza A virüsünün bu vRNPs arındırmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Prosedür zarflı virion vRNP kompleksleri serbest bırakmak amacıyla grip deterjanlarla virion bozulma ile başlar. VRNPs sonra grip hız sedimantasyon% 33-70 süreksiz gliserol degrade virion diğer bileşenler ayrılır. Gliserol gradiyenti elde kesirler sonra Coomassie mavi ile boyandıktan sonra SDS-PAGE ile analiz edilir. NP içeren pik fraksiyonları daha sonra bir araya toplanmış ve santrifüj yoluyla yoğunlaşmıştır. Konsantrasyon sonra, vRNPs bütünlüğünü negatif boyandıktan sonra transmisyon elektron mikroskobu ile vRNPs görselleştirme tarafından doğrulanmadı. Gliserol degrade arıtma Kemler o bir değişiklik<em> Ve ark.</em> (1994)<sup> 1</sup> Ve negatif boyama Wu tarafından yapılan olmuştur<em> Ve ark.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Bölüm 1: Grip bozulması bir virion Beckman Optima kullanmak için TLA-120,2 rotor içine sığacak şekilde tasarlanmış bir Beckman polikarbonat santrifüj tüpüne (11 mm x 34 mm) içine MNT tampon 750 ul (20 mM (MES), 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5) Max-E ultrasantrifüjdeki. Bu tüpe, influenza A virüsünün (2 mg / ml 'H3N2 X-31 A/AICHI/68 suşu) 500 ul ekleyin. MNT tamponu ile birkaç kez aşağı yukarı pipetleme virüs karıştırın. TLA-120,2 rotor kullanarak Beckman O…
Discussion
VRNPs Arındırma Kemler ve ark (1994) tarafından açıklanan prosedüre dayanmaktadır. 1. Biz ve diğerleri de kendi nükleer ithalat çalışma vRNPs izole etmek için bu protokolü kullanılır. 2,4,5
RNA viral genomun oluşur çünkü RNaz ücretsiz ipuçları ve tüpler vRNPs manipüle kullanmanızı tavsiye ederiz ve bu nedenle RNA varlığı kolayca düşürür. Buna ek olarak, tüm tamponlar RNaz ücretsiz su yapılmalıdır. Burada açıklanan protok…
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Yenilik Vakfı (CFI), Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüsü, Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) hibe ile desteklendi.
Wu, W. W., Weaver, L. L., Panté, N. Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes. J. Vis. Exp. (24), e1105, doi:10.3791/1105 (2009).